Soutenance mémoire
Les macrophages et polynucléaires
Les macrophages se différencient à partir des monocytes. Ils sont présents dans de nombreux organes. Ils sont riches en lysosomes contenant des hydrolases et des peroxidases qui participent à la destruction des microorganismes phagocytés. Ils phagocytes les agents infectieux à la suite de l’engagement de PRR, de récepteurs Fc ou de récepteurs aux fragment du complément. Ils sont sources de cytokines proinflammatoires (interleukin (IL)-1, tumor necrosis factor (TNF)-α, IL-6) et de chimiokines telle que l’IL-8. Tout comme les cellules dendritiques dont nous reparlerons plus loin, ils peuvent aussi participer à la présentation de l’antigène aux lymphocytes T. Pour ce qui nous concerne nous évoquerons occasionnellement la population des macrophages du foie (cellules de Kupffer). Quand aux polynucléaires, ils comprennent les neutrophiles qui sont phagocytiques et sécrètent de grandes quantité de chimiokines, les éosinophiles qui sont important pour les réponses antiparasitaires et l’allergie et les basophiles qui interviennent aussi dans l’allergie. Ils ne seront pas davantage évoqués dans ce travail.
Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité
Les gènes du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) (système HLA « Human Leucocyte Antigen » chez l’homme) codent pour des molécules polymorphes qui sont exprimées sur toutes les cellules de l’organisme. Les molécules du CMH de classe I (HLA A, B, et C) et de classe II (HLA DP, DQ, DR) sont des glycoprotéines membranaires formées de l’association d’une chaîne α et de la β2-microglobuline pour le CMH I, et d’un hétérodimère de chaînes α et β pour le CMH II. Les molécules CMH I sont exprimées par toutes les cellules nucléées, tandis que les molécules CMH II ne sont présentes que sur certains types cellulaires parmi lesquels les cellules présentatrices d’antigènes spécialisées (CPA) comme les cellules dendritiques, les macrophages et les lymphocytes B mais aussi les cellules épithéliales thymiques, certaines cellules endothéliales et les lymphocytes T activés chez l’homme (Klein et al., 2000a; Klein et al., 2000b). Comme indiqué ci dessus, les molécules CMH I présentent les peptides antigéniques aux lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8+, alors que les complexes peptide:CMH II sont reconnus par les lymphocytes T CD4+ (Cresswell, 1994; Pamer et al., 1998). Il existe aussi des molécules CMH I dites non classiques telles que les molécules CD1 (Lantz et al., 1994; Maher et al., 1997; Porcelli, 1995) ou HLA-E. Ce sont des glycoprotéines non-polymorphiques exprimées sous la forme d’une chaîne α également associée à la β2-microglobuline. Les molécules CD1 (CD1a, b, c et d) sont donc apparentées aux CMH I mais leur trafic intracellulaire à des ressemblances avec celui des molécules CMH II, elles sont surtout exprimées par les CPA, par des cellules épithéliales intestinales, des cellules de Langerhans et les hépatocytes (Balk et al., 1994; Canchis et al., 1993; Porcelli, 1995; Porcelli et al., 1999). Chez l’homme, les molécules CD1 présentent des antigènes lipidiques ou glycolipidiques à des lymphocytes T spécialisés γδ ou αβ (Faure et al., 1990; Porcelli et al., 1992; Ulrichs et al., 2000) et aux cellules T dites NK-T (Lantz et al., 1994; Porcelli et al., 1992; Tanaka et al., 1995). HLA-E est une molécules très peu polymorphe, exprimée par de nombreux type cellulaires et qui en situation normale, présente des peptides issus des séquences leaders des molécules HLA-A,B,C. Sa reconnaissance peut donc donner une information au système immunitaire sur la synthèse de molécules classique HLA I qui est souvent modifiée par les infections virales ou la transformation tumorale. Certain virus comme le cytomegalovirus (CMV) neutralisent ce système d’information en assurant la synthèse d’un peptide pouvant se lier à HLA-E. Nous reviendrons sur ces éléments dans les résultats et la discussion.
Les lymphocytes B
Ces lymphocytes se différencient dans la moelle osseuse au cours d’une succession d’étapes identifiables par l’expression de molécules de surface et par le statut du réarrangement des gènes des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines (configuration germinale ou réarrangée). Au stade dit B mature, les lymphocytes expriment un récepteur de l’antigène membranaire (IgM), ils quittent la moelle pour les follicules des organes lymphoïdes secondaires riches en cellules dendritiques folliculaires. Phénotypiquement, ils sont alors IgM+IgD+ et se distinguent entre autre par l’expression des molécules CD19, CD20, CD21, CD32, CD40 et de molécule du CMH de classe II. Les lymphocytes B sont impliqués dans la composante humorale de la réponse immunitaire par la sécrétion d’anticorps (ou immunoglobulines) spécifiques qui diffusent dans l’organisme et se lient à l’antigène qui a induit l’activation du/des clones B correspondants. Cette activation se fait à la frontière des zones T/B des follicules et est facilité le plus souvent par les lymphocytes T activés via l’interaction CD40-CD40 ligand. Lors de telles interactions, les cellules B sont aussi des cellules présentatrices de l’antigène aux cellules T CD4+ car elles expriment les molécules CMH de classe II. Les cellules B activées donnent naissance aux centres germinatifs ou se déroulent l’expansion clonale, les hypermutations dans les régions variables qui influence l’affinité des anticorps, les commutations de classe générant des IgG, IgA ou IgE (influencées par l’environnement cytokinique) et la différentiation en lymphocytes sécréteurs d’anticorps (plasmocytes) ou mémoires. Dans le cas d’infections virales, les anticorps sécrétés peuvent permettre la neutralisation des virions en inhibant leur entrée dans les cellules cibles et en participant à l’élimination de particules libres par le système du complément et les phagocytes (Burton et al., 2000; Cooper et al., 1983). Les anticorps efficaces contre les virus sont souvent dirigés contre les protéines d’enveloppe car ils bloquent l’interaction avec la molécule récepteur sur les cellules de l’hôte. La détection de tels anticorps est utilisé dans les tests sérologiques de diagnostique.
L’activité des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL)
Après activation, les cellules T CD8+ prolifèrent et se différentient en cellules cytotoxiques capable, après engagement du TCR, de lyser des cellules cibles par la sécrétion de molécules effectrices (perforine et granzymes A et B) ou par induction de mort cellulaire par la voie Fas/FasL ou TNF/TNF-R (Stenger et al., 1998). Les CTL produisent aussi des cytokines et une distinction parmi les CTL (Tc1 versus Tc2) a été proposée (Maggi et al., 1994; Salgame et al., 1991; Vukmanovic-Stejic et al., 2000). Les Tc1 correspondraient aux cellules produisant de l’IFN-γ et du TNF-α en présence d’IL-12 tandis que les cellules pouvant sécréter de l’IL-4 en présence d’IL-4 correspondraient aux Tc2. Lors des infections virales, l’efficacité de l’activité cytotoxique des CTL joue un rôle central dans l’éradication du virus puisqu’elle assure l’élimination physique des cellules infectées. Dans le cas d’infection par le VIH par exemple, une forte réponse cytotoxique contre différents antigènes viraux constituerait un bon pronostic (Dalod et al., 1999; Ogg et al., 1998). Comme nous le verrons plus loin, il semble qu’une réponse cytotoxique forte et multispécifique est associée à l’éradication du VHC lors de la phase aiguë de l’hépatite virale C, (He et al., 1999; Lechner et al., 2000a; Maini et al., 2000). En revanche, une activité cytotoxique insuffisante des CTL pourrait ne pas permettre l’élimination du virus tout en contribuant à la destruction du tissu hépatique qui caractérise l’hépatite C chronique (Cerny et al., 1999; Chang et al., 1997; Chisari et al., 1997). Enfin, la sécrétion d’IFN-γ et de TNF-α par les CTL peut aussi jouer un rôle dans l’élimination des cellules infectées. Ce mécanisme antiviral non cytolytique a été mis en évidence dans des modèles d’infection par le virus de l’hépatite B, chez la souris et le chimpanzé (Guidotti et al., 1996a; Guidotti et al., 2001; Guidotti et al., 1996b).
La cytotoxicité des cellules NK
Les cellules NK peuvent tuer des cellules infectées ou transformées par plusieurs mécanismes dont la cytotoxicité dépendante des anticorps (ADCC) impliquant CD16, la voie perforine/granzymes et les voies passant par des récepteurs impliqués dans la mort cellulaire de la famille du TNF : Fas-L, TNF-α et TRAIL (Montel et al., 1995, Arase et al., 1995, Kashii et al., 1999). Au repos, les cellules NK CD56dim sont plus cytotoxiques que les cellules NK CD56bright. Ces cellules CD56dim possèdent une activité ADCC plus importante que les NK CD56bright dû à un plus fort niveau d’expression de CD16 (Nagler et al., 1989). Cependant, les cellules CD56bright et CD56dim peuvent atteindre des niveaux d’activité cytolytique similaires après activation avec l’IL-2 ou l’IL-12 in vitro (Caligiuri et al., 1990, Nagler et al., 1990, Robertson et al., 1992). Ceci est en accord avec le fait que les cellules NK CD56dim et NK CD56bright fraîchement isolées peuvent contenir des niveaux comparables de perforine (Konjevic et al., 1995). Le profile d’expression divergent de récepteurs activateurs ou inhibiteurs par les NK CD56dim et CD56bright pourrait aussi moduler leur potentiel cytotoxique. Dans plusieurs types d’infection virale, une faible activité cytotoxique des cellules NK vis à vis des cellules infectées semble être associée à la persistance virale (Corado et al., 1997; Joncas et al., 1989; Katz et al., 1987; Quinnan et al., 1982).
Expression des KIRs par les lymphocytes T
Les sous populations de cellules T αβ CD8+ et les cellules T γδ peuvent exprimer des récepteurs de type NK, tels que les KIR. Chez les sujets normaux les cellules T CD4+ exprimant des KIRs sont détectables mais beaucoup plus rares. Les cellules T αβ CD8+KIR+ sont présentes dans plusieurs tissus chez l’homme, tels que la rate, les amygdales, les ganglions lymphatiques, le sang (Mingari et al., 1997, Anfossi et al., 2001). Au niveau périphérique, ils représentent 4.5% de la population totale des lymphocytes T, est cette fréquence augmenterai avec l’âge (Anfossi et al., 2001). L’acquisition de l’expression des KIRs a lieu après le réarrangements des loci du TCR (Uhrberg et al., 2001, Vely et al., 2001, Snyder et al., 2002). Les lymphocytes T CD8+ expriment principalement des KIRs inhibiteurs. Les cellules T CD8+KIR+ possèdent un phénotype de cellules T effecteur/mémoire caractérisé par la présence de CD45RA, CD45RO et l’absence ou la faible expression d’autres marqueurs tels que CD27, CD28 et CCR7 (Mingari et al., 1996, Speiser et al., 1999, Anfossi et al., 2001, Young et al., 2001). Si les KIRs inhibiteurs sont engagés au même temps que le TCR, ils peuvent réguler négativement la fonction des cellules T selon des mécanismes similaires à ceux décrits pour les cellules NK (phosphorylation des résidus des tyrosines des ITIM, recrutement et activation de SHP1). Les KIRs inhibent la production de cytokines comme l’IFN-γ et le TNF-α ou la cytotoxicité (Ferrini et al., 1994, Vely et al., 2001, Mingari et al., 1996, Mingari 1 et al., 995, De Maria et al., 1997, D’Andrea et al., 1996, Bakker et al., 1998, Guerra et al., 2000). Les KIRs modulent aussi négativement la réorganisation du cytosquelette qui est induite par l’engagement du TCR (Guerra et al., 2002). Les KIRs inhibiteurs confèrent une résistance à la mort cellulaire, ceci a été observé pour des clônes de cellules T et des cellules Jurkat transfectées (Young et al., 2001, Chwae et al., 2002), en interférant avec la voie de signalisation induite par Fas à travers l’induction de c-FLIP-L et la diminution de l’activité de la caspase 8 (Gati et al., 2003). Tandis que pour les cellules NK, les KIRs sont à l’origine du recrutement de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) qui, via la kinase AKT, régule négativement le processus de mort cellulaire (Marti et al., 1998). Les KIRs ont aussi la capacité de prévenir l’activation d’isoformes de la Protein kinase C (PKC) (Chwae et al., 2002). (Figure 9). Les mécanismes qui sont à l’origine de l’expression de KIRs par les cellules T ne sont pas bien connus. Les KIRs sont très probablement exprimés après stimulation antigénique. In vitro, l’engagement du TCR est nécessaire pour l’expression des KIR sur la surface cellulaire (Huard et al., 2000). Il a été proposé que la reconnaissance répétée de l’antigène par les cellules T qui expriment des KIRs inhibiteurs particuliers capables d’interagir avec des molécules de classe I autologues, seraient sélectionnées car les KIRs confèrent une résistance à la mort cellulaire induite par activation (AICD). L’expression de KIRs inhibiteurs sur les cellules T CD8+ serait la signature d’une stimulation antigénique chronique (Vivier 2004). Par ailleurs, des KIRs différents sont retrouvés sur des clônes de cellules T qui partagent le même TCR. Il n’est pas clair si la qualité et/ou la quantité de la stimulation joue un rôle dans l’induction des KIRs. Il est possible que certaines conditions d’activation des cellules T puissent induire l’expression de KIRs par déméthylation de l’ADN et production de certains facteurs de transcription. L’expression des KIRs ne semble pas être inductible in vitro par stimulation en présence des différentes combinaisons de cytokines apparaît stable dans diverses conditions de culture (Vely et al., 2001, Gumperz et al., 1996) .
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
I – La réponse immunitaire
Généralités sur les cellules du système immunitaire
Les macrophages et polynucléaires
Apprêtement et présentation des antigènes par les cellules présentatrices
Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité
Apprêtement et présentation des antigènes
Les cellules dendritiques
Les lymphocytes B
Les lymphocytes T, développement et physiologie
Le développement des lymphocytes T
Les lymphocytes T périphériques
Polarisation de la réponse lymphocytaire CD4+
L’activité des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL)
Les lymphocytes T NK (NK-T)
Les cellules tueuses naturelles ou Natural Killers (NK)
Le développement des cellules NK humaines
Sous populations de cellules NK chez l’homme
La cytotoxicité des cellules NK
Récepteurs activateurs des cellules NK humaines
Corécepteurs présents sur les cellules NK
Récepteurs inhibiteurs des cellules NK humaines
Expression de NKRs par les populations NK CD56dim et NK CD56bright
Génétique des récepteurs KI
Expression de récepteurs de cellules NK par des sous populations de lymphocytes T activés/mémoires
Expression des KIRs par les lymphocytes T
Expression de NKG2A/CD94 par les lymphocytes T
Expression d’autres récepteurs NK par les lymphocytes T
II – Fonctions et organisation du foie
Généralités
Populations lymphocytaires intrahépatiques
III – L’Hépatite virale C
Histoire naturelle de l’Hépatite C
Recrutement de cellules T non-spécifiques pendant cHC
Fibrose
Caractéristiques moléculaires du VHC
Cycle cellulaire du VHC
Réponse immunitaire contre le VHC
Réponse spécifique et résolution
Réponse spécifique et chronicité
Lymphocytes T non-classiques
Lymphocytes T γδ
La réponse lymphocytaire B
Réponse immunitaire innée
Interférons de type I
La réponse NK
Traitement de l’hépatite virale C
MATERIELS ET METHODES
Patients et individus contrôles
Informations sur les paramètres cliniques de la maladie
Isolement des cellules mononuclées périphériques
Extraction des lymphocytes intrahépatiques
Expansion in vitro des cellules isolées à partir des patients
Immunomarquages et cytométrie de flux
Principaux anticorps monoclonaux utilisés
Populations cellulaires étudiées
Multimères de complexes peptide VHC:HLA classe I
Détection de cellules ayant engagé un programme de mort cellulaire
Dosage de cytokines par ELISA
Extraction des ARN totaux et synthèse des ADN complémentaires (ADNc)
Analyse du répertoire des récepteurs KIR par réaction de PCR
Séquence des oligonucléotides utilisés pour l’analyse du répertoire des récepteurs KIR
Analyses statistiques
RESULTATS
Article 1 “Features and Distribution of CD8 T cells with HLA Class I Specific Receptor Expression in Chronic Hepatitis C.”
Article 2 “Altered Distribution of Natural Killer Cell Subsets in Patients with Chronic Hepatitis C.”
Article 3 “Characteristics and Subset Composition of CD8+ Natural Killer (NK) Cells in Patients with Chronic Hepatitis C.”
Résultats sur l’Etude du répertoire des récepteurs KIR de patients atteints d’hépatite virale C chronique
Introduction
Présentation et discussion des résultats actuels
Conclusions provisoires
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Les cellules T CD8+NKR+ au cours de l’hépatite virale C chronique
Les modifications phénotypiques des cellules T CD8+NKR+ au cours de l’hépatite virale C chronique
Les cellules T CD8+ infiltrant le foie au cours de l’infection VHC chronique.
Un rôle pour les cellules NK-CTL dans les lésions hépatiques au cours de l’hépatite virale C chronique ?
Les Cellules NK des patients infectés par le VHC
Conclusion
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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