Pontage des IgE et dégranulation des cellules effectrices

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Phase précoce

L’histamine, libérée dans les secondes qui suivent l’activation des mastocytes et/ou des basophiles, provoque la dilatation des petits vaisseaux sanguins, augmente la perméabilité vasculaire, et stimule la contraction transitoire des muscles lisses. Les protéases qui sont également libérées peuvent provoquer des lésions des tissus locaux. Des médiateurs néoformés suite à l’activation cellulaire sont également rapidement libérés. Ce sont essentiellement les métabolites de l’acide arachidonique qui comprennent la prostaglandine D2 (PGD2) et le leucotriène C4 (LTC4), et les produits issus de sa lyse (LTD4 et LTE4). Ces médiateurs stimulent la contraction prolongée des muscles lisses et augmentent la perméabilité vasculaire. Ils jouent également un rôle chémotactique pour les cellules inflammatoires comme les éosinophiles.

Phase tardive

La phase précoce est souvent suivie par une phase tardive qui se met en place dans les deux à huit heures suivant la dégranulation, et qui persiste pendant au moins un à deux jours. Cette seconde phase correspond à une réponse inflammatoire déclenchée par les médiateurs libérés par les mastocytes et les basophiles tels que le TNF-α, l’IL-4, l’IL-3, le GM-CSF, l’IL-5, l’IL-6, l’IL-8 et l’IL-16 ou encore CCL3 [127].
Certains de ces médiateurs possèdent une activité chémotactique qui va favoriser le recrutement d’éosinophiles, de neutrophiles, de monocytes et de lymphocytes au site de l’inflammation. Le TNF-α et l’IL-4 produits par les mastocytes favorisent une inflammation riche en neutrophiles et en éosinophiles. L’IL-5 produite par les lymphocytes Th2 et les mastocytes activent les éosinophiles. Les cellules recrutées libèrent alors des protéases qui provoquent des lésions tissulaires. Par ailleurs, la réaction est exacerbée par l’IL-4 qui active les cellules Th2, entraînant la production supplémentaire de cytokines. La réponse IgE, lorsqu’elle a été déclenchée, peut également être amplifiée par les basophiles, les mastocytes et les éosinophiles. Lorsqu’ils sont activés par l’allergène pontant des IgE fixées à leurs récepteurs FcεRI, ces granulocytes expriment le ligand CD40 à leur surface et sécrètent de l’IL-4. Ils peuvent donc, comme les Th2, induire la commutation de classe des cellules B au niveau du site de la réaction allergique et former des centres germinatifs au sein du foyer inflammatoire [128].
L’ensemble de ces réactions est un processus physiologique normal impliqué dans la lutte contre les agents pathogènes extracellulaires tels que les parasites [129;130]. Les lieux de survenue de ces réponses, les muqueuses, correspondent d’ailleurs aux sites potentiellement exposés aux parasites.
Ainsi, l’implication des IgE est cruciale dans les différentes étapes de la réaction allergique. La sensibilisation d’un individu à un aliment est donc révelée par la présence d’IgE spécifiques de cet aliment grâce à des dosages immunoanalytiques ou des tests d’immunoempreintes réalisés sur des prélèvements sanguins. La réactivité clinique est quant à elle confirmée par déclenchement de la réaction allergique après des tests cutanés ou des tests de provocation orale simple ou en double aveugle (DBPCFC : double blind, placebo-controlled food challenge). Le principe de ces différents tests sera détaillé dans la partie II de cette introduction (paragraphe II.1).

LES ALLERGENES ALIMENTAIRES

Principaux allergènes alimentaires

Même si de nombreux aliments sont allergéniques, une petite partie d’entre eux est responsable de la majorité des réactions. Dans une étude portant sur la prévalence de l’allergie alimentaire dans la population française générale, Kanny et coll. ont montré que les aliments en cause étaient le plus fréquemment d’origine végétale, impliquant les fruits de la famille des Rosacées (abricot, cerise, fraise, framboise, pêche, poire, pomme, prune) (14%), les légumes de tous types incluant les Ombellifères (aneth, carotte, céleri, coriandre, fenouil, graines d’anis, graines de carvi, persil) et les légumineuses autres que l’arachide (pois, lupin, soja) (9%), les fruits ayant des réactions croisées avec le latex (avocat, kiwi, banane, châtaigne) (5%), les fruits à coque (noix, noix de Cajou, noix du Brésil, noisette, pistache, amande) (3%) [11]. Précisons que l’arachide n’appartient pas à la famille des fruits à coque, mais que c’est une légumineuse de la famille des Papillionacées comme les pois, les lentilles, le soja ou le lupin. Dans cette étude 1% des allergies impliquait spécifiquement l’arachide. Les allergènes alimentaires d’origine animale impliqués étaient le lait (8%), les crustacées (8%), les coquillages (7%) et l’œuf (4%). Dans une autre étude sur la population toulousaine pédiatrique (0 à 15 ans), Rancé et coll. ont observé que 5 allergènes étaient à l’origine de 78% des allergies alimentaires : l’œuf (36%), l’arachide (24%), le lait de vache (8%), la moutarde (6%) et le poisson (4%). Des variations sont cependant observées en fonction de l’âge considéré : après l’âge de 3 ans, l’arachide est l’aliment le plus fréquemment en cause, tandis que les allergies à l’œuf et au lait diminuent en fréquence [32]. Des données plus récentes de la prévalence de l’allergie en France ont été fournies par le CICBAA en 2005 [22]. Parmi les 886 observations recensées chez les enfants, les aliments le plus souvent en cause sont l’œuf (51 %), l’arachide (40 %) et le lait de vache (16 %) ; et parmi les 247 observations observées chez l’adulte, les aliments en causes sont les fruits de la famille des Rosacées (27%), les fruits ayant des réactions croisées avec le latex (23%), les Ombellifères (17,5%), les fruits à coque (16%), les céréales (14,4%) et l’arachide (10%) (figure 10). Au Royaume-Uni, une étude récente menée sur l’Ile de Wight a montré qu’à un an les aliments incriminés sont majoritairement le lait, l’œuf et dans une moindre mesure, le blé. A 3 ans, ce sont dans l’ordre, l’arachide, l’œuf, le sésame et le lait [10]. Aux Etats-Unis, Sampson rapporte que les principaux aliments allergènes sont également le lait, l’œuf et l’arachide chez le jeune enfant et les crustacées, l’arachide, les noix et le poisson chez les adultes [131].
Il apparaît également que la répartition des aliments responsables d’allergie alimentaire évolue de la naissance à l’adolescence: l’allergie alimentaire aux allergènes végétaux progresse avec l’âge, tandis que le phénomène est inverse pour les réactivités aux allergènes d’animaux. Outre l’impact de la génétique et de l’environnement, des différences sont également notées en fonction des pays résultant de différences dans les niveaux et modes de consommation de certains aliments. A titre d’exemple, l’arachide consommée grillée dans les pays occidentaux est un allergène important alors qu’en Asie, l’arachide consommée bouillie est rarement impliquée dans les cas d’allergies alimentaires [132].
De plus, ces dernières années, on observe une modification du paysage allergénique conjointement à l’apparition de nouvelles allergies alimentaires. Les aliments allergéniques émergents sont multiples : lait de chèvre ou de brebis sans allergie au lait de vache [36], sésame, lupin, isolats de blé ou encore épices, condiments ou fruits exotiques (kiwi, avocat, litchis, noix exotiques) [133]. Ces nouvelles allergies pourraient être le résultat de la modification des comportements alimentaires dans nos sociétés associée à la disponibilité croissante d’aliments « exotiques », et du développement des nouvelles technologies agroalimentaires.
Alors qu’il y a encore quelques années, la majorité des patients allergiques l’étaient à un seul aliment, actuellement une tendance à la polysensibilisation se révèle. Dans des études réalisées à la fin des années 1990, seulement 33% d’une population d’enfants [32] et 42% d’une population adulte [11] étaient allergiques à plus d’un aliment. Récemment, Osborne et coll. [134] ont montré qu’à l’âge de 4 et 8 ans, 51% des enfants allergiques l’étaient à au moins deux aliments.
Les aliments à l’origine des réactions allergiques mortelles sont principalement l’arachide et les noix. Aux Etats-Unis, l’analyse de 32 décès de patients allergiques, recensés entre 1994 et 1999, implique l’arachide dans 20 cas et les noix dans 10 cas. Le poisson et le lait sont mis en cause dans un cas chacun [135]. L’analyse de 31 nouveaux cas de réactions anaphylactiques mortelles sur une période plus récente (2001-2006) a confirmé l’importance de l’arachide et des noix (17 et 8 cas respectivement), mais a également montré une augmentation de l’implication d’autres aliments comme le lait (4 cas) et la crevette (2 cas) [136].
Les travaux réalisés durant ma thèse ont porté sur trois sources allergéniques, l’arachide, le lait de vache et la noisette, dont nous allons analyser plus précisément les caractéristiques.

L’allergie à l’arachide

Prévalence et caractéristiques cliniques

Prévalence et histoire naturelle

L’arachide est donc une source allergénique majeure. Une méta-analyse publiée en 2007 par Rona et coll. a évalué que l’allergie déclarée à l’arachide, c’est-à-dire la part de la population pensant être allergique à l’arachide, était en moyenne de 0,75% de la population générale (entre 0 et 2%) et que la fréquence de la sensibilisation à l’arachide était de 0,8% (présence d’IgE spécifiques chez 0,5 à 2,5%) [7]. Osterballe et coll. ont montré que la fréquence de l’allergie alimentaire à l’arachide au Danemark, prouvée par DBPCFC, était de 0,2% chez des enfants de 3 ans et 0,4% chez les adultes [137]. Rappelons de plus que la prévalence de l’allergie à l’arachide a fortement augmenté ces dernières années dans différents pays [23;24].
L’allergie à l’arachide apparaît généralement pendant l’enfance, avant l’âge d’un an dans 46% des cas et avant 15 ans dans 93% des cas [35]. C’est l’exemple type de l’allergie persistante, même si une résolution survient chez certains enfants. Certaines études indiquent en effet que 15 à 20 % des allergies à l’arachide évoluent naturellement vers la guérison [17;18]. Cette acquisition de tolérance semble plus prononcée lorsque les enfants allergiques à l’arachide ont des taux d’IgE spécifiques faibles (inférieurs à 2 UI/mL), ou des taux d’IgE spécifiques qui diminuent vers l’âge de 3 ans [138;139]. A l’inverse, les enfants polysensibilisés sont moins susceptibles de guérir de leur allergie à l’arachide [140]. De plus, les patients qui sont devenus tolérants à l’arachide présente un risque de rechute important, principalement si une éviction à l’arachide est poursuivie [141].

Tableau clinique

Le tableau clinique de l’allergie alimentaire à l’arachide a été décrit pour la population française par Moneret-Vautrin et coll. à partir de 142 observations [35]. Les symptômes se répartissaient de la façon suivante : 40% de dermatite atopique, 37% d’angio-oedème, 14% d’asthme, 6% de choc anaphylactique et 1,4% de symptômes digestifs. L’étude de Rancé et coll., portant sur 192 enfants allergiques à l’arachide met en évidence un tableau clinique assez proche avec 46% de dermatite atopique, 32% d’urticaire ou d’angio-œdème, 15% d’asthme, 5% de choc anaphylactique, 2% de symptômes gastro-intestinaux et 0,5% de syndrome oral [32].
Il apparaît néanmoins que les manifestations cliniques sont généralement plus sévères dans les cas d’allergies alimentaires à l’arachide que pour les autres aliments. Le et coll. ont ainsi montré que les symptômes étaient plus intenses chez les patients allergiques à l’arachide comparés aux patients allergiques aux fruits [142]. D’après les données du CICBAA [22], l’arachide est responsable de 23% des urgences allergiques pédiatriques. L’arachide est également responsable de la majorité des cas des réactions anaphylactiques mortelles aux Etats-Unis [135;136].

Dose réactogène

Une des difficultés de l’allergie à l’arachide est de respecter une stricte éviction de cet aliment. En effet, les produits alimentaires contiennent souvent de l’arachide comme agent texturant ou de saveur, ou suite à des contaminations sur les chaînes de production. Le problème est accru par le potentiel allergénique de l’arachide. Les doses réactogènes, c’est-à-dire la quantité de protéines d’arachide qui va provoquer une réaction allergique, peuvent être très faibles. La moindre contamination croisée peut donc être dangereuse pour le patient allergique [143]. Les doses réactogènes sont plus faibles pour l’arachide que pour d’autres aliments. A titre d’exemple 87,5% des patients allergiques à l’arachide réagissent à des doses inférieures à 1g de protéine (correspondant à moins d’une cacahuète), tandis que ce pourcentage est de seulement 60% pour la même dose de protéines dans le cas de l’allergie à l’œuf [35]. Les doses d’aliments ayant déclenché une réaction allergique chez des patients allergiques à l’arachide, aux noix ou aux fruits ont été comparées : 1/3 des patients allergiques aux fruits déclare avoir mangé une quantité d’aliment inférieure à une cuillère à café, tandis que cette proportion passe à environ 2/3 dans le cas des allergiques aux noix et à l’arachide [142]. Le cas du « baiser mortel », c’est-à-dire d’allergie induite par un baiser avec un partenaire ayant consommé de l’arachide, est suffisamment évocateur pour souligner la réactivité de l’arachide à de faibles doses [144;145].
Bien que 100 µg de protéines d’arachide puissent provoquer des symptômes [146-148], il existe une grande variabilité inter-individuelle de la dose réactogène au sein de la population de patients allergiques à l’arachide. Dans ces études, certains patients ne répondaient qu’à des doses supérieures au gramme. Peeters et coll. ont déterminé que 10 µg de farine d’arachide est la dose-seuil au-dessous de laquelle aucun symptôme n’est observé dans une population d’allergiques à l’arachide [147]. Il y a cependant de grandes disparités selon les études. A titre d’exemple, Flinterman et coll. ont déterminé cette limite à 1 mg de farine d’arachide (correspondant à 2 mg d’arachide) [143]. Par ailleurs, Bindslev-Jensen et coll. ont évalué une dose-seuil de seulement 0,7 µg de farine d’arachide comme étant la dose qui entraînerait un risque de réaction allergique chez une personne sur 1 million de personnes sensibilisées à l’arachide [149].
Il est à noter que dans la plupart des études, les doses réactogènes ne sont déterminées que lors de tests de provocation DBPCFC réalisés à des fins de diagnostic. Les patients ayant une allergie très sévère ou très fortement sensibilisés ne rentrent donc pas dans ces études. Chez ces patients, les doses réactogènes sont certainement beaucoup plus faibles [148].

Allergies croisées

Les réactions allergiques à l’arachide et aux noix coexistent chez 20% à 50% des patients allergiques à l’arachide [24;35;150;151]. Par contre, la coexistence de l’allergie à l’arachide avec une allergie à une autre plante de la même famille comme le soja ou le pois est moins fréquente [35]. La coexistence de ces allergies peut être due à une vraie réactivité croisée (cross-sensibilisation), mais également à l’existence d’allergies concomitantes chez des individus très atopiques (co-sensibilisation). Alors que chez l’allergique à l’arachide, la sensibilisation au soja est de 6 à 53%, des manifestations cliniques ne sont observées que chez 2,3 à 11% des enfants sensibilisés [151;152]. Ces réactivités ne sont pas pour autant à sous-estimer puisqu’il existe un réel danger d’accidents suite à l’ingestion de soja chez l’allergique à l’arachide. Ce danger a été souligné dès 1999 par Foucard et Yman qui relèvent 4 accidents mortels causés par le soja chez des patients qui avaient une allergie connue à l’arachide, mais qui n’avaient jamais présenté de réaction antérieure avec le soja [153]. Il existe également une réactivité croisée entre l’arachide et le lupin [154]. Une étude a démontré une réaction croisée cliniquement significative entre les pois et l’arachide. Elle résulterait d’une sensibilisation aux homologues de la viciline dans ces aliments [155]. Les homologies entre les protéines d’arachide et d’autres plantes peuvent en effet être responsables des réactions croisées observées. On retrouve par exemple des épitopes de protéines de l’arachide dans d’autres protéines issues de plantes telles que l’amande et la noix du Brésil [156], le soja [157] ou encore la moutarde [158].

Les allergènes de l’arachide

Les protéines d’arachide

L’arachide (Arachis hypogaea) est une plante légumineuse de la famille des Papilionacées, comme les pois, les lentilles, le lupin, le soja, les fèves ou encore les haricots. La graine d’arachide, appelée cacahuète, est composée de 24 à 29% de protéines. Les premières études sur l’arachide avaient permis de décrire deux protéines majeures, l’arachine et la conarachine. L’arachine se présente sous forme d’un complexe protéique de masse moléculaire égale à 170 kDa. Elle existe sous 2 formes polymorphiques A et B qui peuvent être dissociées en sous-unités de masses moléculaires s’étalant entre 20 et 71 kDa [159]. La conarachine peut être séparée en 2 constituants, I et II, de masses moléculaires respectives 142 et 295 kDa [160]. Nous retrouvons en fait majoritairement des protéines de réserve appartenant aux deux grandes familles des globulines 7S et 11S (viciline et glycinine) et des albumines 2S (conglutine). Outre ces protéines quantitativement majeures, l’arachide possède plus de 30 protéines différentes. L’électrophorèse bidimensionnelle de l’arachide illustre bien cette chimie protéique complexe (figure 11).

Table des matières

NTRODUCTION GENERALE
I. L’ALLERGIE ALIMENTAIRE
I.1. L’allergie alimentaire : définitions, prévalence et symptômes
I.1.1. Définitions et classifications
I.1.2. Prévalence de l’allergie alimentaire
I.1.3. Symptômes cliniques
I.1.4. Facteurs influençant la survenue d’une réaction allergique alimentaire
I.1.4.1. Facteurs génétiques
I.1.4.2. Facteurs environnementaux et hypothèse hygiéniste
I.1.4.3. Autres facteurs
I.2. Acteurs et mécanisme de l’allergie alimentaire de type I
I.2.1. Les acteurs de l’allergie alimentaire
I.2.1.1. Les IgE et les récepteurs aux IgE
I.2.1.1.a. Les IgE
I.2.1.1.b. Le récepteur de haute affinité pour les IgE (FcεRI)
I.2.1.1.c. La liaison de l’IgE au FcεRI
I.2.1.1.d. Régulation de l’expression du FcεRI
I.2.1.1.e. Le récepteur de faible affinité pour les IgE (FcεRII ou CD23)
I.2.1.2. Les cellules effectrices de l’allergie
I.2.1.2.a. Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA)
I.2.1.2.b. Les lymphocytes T auxiliaires et T régulateurs
I.2.1.2.c. Les lymphocytes B
I.2.1.2.d. Les granulocytes
I.2.1.2.d.i. Basophiles
I.2.1.2.d.ii. Mastocytes
I.2.1.2.d.iii. Eosinophiles
I.2.2. Le mécanisme de l’allergie alimentaire
I.2.2.1. Franchissement de la barrière mucosale
I.2.2.2. Phase de sensibilisation
I.2.2.3. Phase de déclenchement
I.2.2.3.a. Pontage des IgE et dégranulation des cellules effectrices
I.2.2.3.b. Phase précoce
I.2.2.3.c. Phase tardive
I.3. Les allergènes alimentaires
I.3.1. Principaux allergènes alimentaires
I.3.2. L’allergie à l’arachide
I.3.2.1. Prévalence et caractéristiques cliniques
I.3.2.1.a. Prévalence et histoire naturelle
I.3.2.1.b. Tableau clinique
I.3.2.1.c. Dose réactogène
I.3.2.1.d. Allergies croisées
I.3.2.2. Les allergènes de l’arachide
I.3.2.2.a. Les protéines d’arachide
I.3.2.2.b. Les allergènes identifiés de l’arachide
I.3.3. L’allergie au lait de vache
I.3.3.1. Prévalence et caractéristiques cliniques
I.3.3.1.a. Prévalence et histoire naturelle
I.3.3.1.b. Tableau clinique
I.3.3.1.c. Dose réactogène
I.3.3.1.d. Réactions croisées
I.3.3.2. Les allergènes du lait de vache
I.3.3.2.a. Les protéines du lait de vache
I.3.3.2.b. Les allergènes identifiés dans le lait de vache
I.3.4. L’allergie à la noisette
I.3.4.1. Prévalence et caractéristiques cliniques
I.3.4.1.a. Prévalence
I.3.4.1.b. Tableau clinique
I.3.4.2. Les allergènes de la noisette
I.3.5. Conclusion
II. ETUDE IN VIVO ET IN VITRO DE L’ALLERGENICITE DES ALIMENTS
II.1. Outils d’évaluation de l’allergénicité
II.1.1. Tests in vitro de la réactivité des IgE
II.1.1.1. Etude de la liaison IgE-allergène
II.1.1.1.a. Immunoempreinte
II.1.1.1.b. Dosage des IgE spécifiques
II.1.1.2. Etude sur cellules effectrices
II.1.2. Modèles animaux
II.1.2.1. Evaluation du pouvoir sensibilisant
II.1.2.2. Evaluation du pouvoir déclenchant
II.1.3. Tests de provocation chez l’homme
II.1.3.1. Tests cutanés
II.1.3.2. Test de provocation orale
II.2. Effet des traitements sur l’allergénicité des aliments
II.2.1. Digestion
II.2.1.1. Effet de la digestion sur l’allergénicité des allergènes vrais
II.2.1.2. Effet de la digestion sur l’allergénicité des allergènes incomplets
II.2.2. Traitements thermiques
II.2.2.1. Effet du chauffage sur les allergènes purifiés
II.2.2.2. Effet de la génération de produits de la réaction de Maillard au cours du chauffage
II.2.2.3. Effet du chauffage sur l’aliment entier
II.2.2.4. Impact sur la digestibilité
II.2.3. Autres procédés industriels
II.2.3.1. Diminution du potentiel allergénique
II.2.3.2. Conservation/protection du potentiel allergénique
II.2.3.3. Augmentation du potentiel allergénique et/ou formation de néoallergènes
II.2.4. Matrice alimentaire
III.CONCLUSION ET OBJECTIFS DE LA THESE PREMIERE PARTIE : DEVELOPPEMENT ET OPTIMISATION D’UN MODELE CELLULAIRE DE DECLENCHEMENT DE LA REACTION ALLERGIQUE
I. INTRODUCTION
I.1. La lignée cellulaire d’origine : RBL 2H3
I.2. Humanisation des cellules RBL 2H3
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. Purifications des allergènes des laits de vache et de chèvre et de l’arachide
II.1.1. Purification des allergènes des laits de vache et de chèvre
II.1.2. Purification des allergènes de l’arachide
II.2. Sérums de patients allergiques
II.2.1. Sérums de patients allergiques à l’arachide
II.2.2. Sérums de patients allergiques au lait
II.3. Dosages enzymo-immunologiques des IgE totales et des IgE spécifiques et dosage des complexes IgE-IgG présents dans les sérums
II.3.1. Matériels et tampons utilisés
II.3.1.1. Matériels d’immunoanalyse utilisés
II.3.1.2. Tampons utilisés
II.3.2. Préparation des plaques de microtitration avec l’anticorps ou l’antigène immobilisé
II.3.3. Préparation des traceurs
II.3.4. Dosages enzymo-immunologiques des anticorps présents dans les sérums
II.3.4.1. Dosage des IgE totales
II.3.4.2. Détection des IgE spécifiques
II.3.4.2.a. Dosage par immobilisation de l’allergène
II.3.4.2.b. Détection par capture d’IgE
II.3.4.3. Dosage des complexes IgE-IgG
II.4. Modèle cellulaire
II.4.1. Conditions de culture des cellules RBL SX-38 et RBL 2H3
II.4.1.1. Milieu de culture
II.4.1.2. Repiquage des cellules
II.4.1.3. Numération et détermination de la viabilité cellulaire
II.4.1.4. Congélation/décongélation
II.4.1.5. Sous-clonage par dilutions limites
II.4.2. Expression du récepteur aux IgE humaines par les cellules RBL SX-38
II.4.2.1. Contrôle de l’expression de la chaîne α du FcεRI humain par cytométrie en flux
II.4.2.2. Contrôle de l’expression de la chaîne β du FcεRI humain
II.4.3. Test de dégranulation
II.4.3.1. Ensemencement des cellules
II.4.3.2. Sensibilisation passive des cellules
II.4.3.3. Activation des cellules
II.4.3.4. Dosage des médiateurs libérés
II.4.3.5. Contrôles réalisés lors des tests de dégranulation
II.4.3.6. Expression des résultats
III.RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. Mise au point du modèle cellulaire de dégranulation avec les cellules RBL SX-38
III.1.1. Choix du médiateur dosé pour évaluer la dégranulation des cellules
III.1.2. Sous-clonage de la lignée et sélection du meilleur clone
III.1.2.1. Expression de la chaîne α du FcεRI par les différents clones
III.1.2.2. Evaluation de la capacité de dégranulation des différents clones
III.1.2.3. Caractérisation du clone sélectionné
III.1.3. Adaptation du test cellulaire de dégranulation au format 96 puits
III.1.4. Optimisation de l’étape de sensibilisation
III.1.4.1. Amélioration de la sensibilité et de la reproductibilité du test par prétraitement des sérums humains
III.1.4.2. Optimisation de la quantité d’IgE
III.1.4.3. Optimisation du volume de milieu dans lequel sont diluées les IgE
III.1.4.4. Durée d’incubation des IgE avec les cellules
III.1.5. Optimisation de l’étape d’activation
III.1.5.1. Durée d’incubation avec les activateurs
III.1.5.2. Dégranulation de référence
III.1.6. Bilan des conditions expérimentales optimales pour le test cellulaire de dégranulation
III.1.7. Discussion sur la mise au point du modèle cellulaire de dégranulation
III.2. Applications du modèle cellulaire
III.2.1. Etude des allergènes du lait
III.2.1.1. Confirmation de la fonctionnalité des allergènes purifiés
III.2.1.2. Comparaison du potentiel de dégranulation des allergènes purifiés des
laits de vache et de chèvre
III.2.1.2.a.Caractéristiques des sérums utilisés
III.2.1.2.b.Profil des courbes de dégranulation induites par les différents allergènes des laits de vache et de chèvre
III.2.1.2.c.Analyse des intensités des dégranulations obtenues : correspondance avec l’intensité de la réponse IgE spécifique
III.2.1.2.d.Doses d’allergènes induisant les dégranulations
III.2.1.2.e.Conclusions et discussion
III.2.2. Etude des allergènes purifiés de l’arachide
III.2.2.1. Comparaison du potentiel de dégranulation de différents allergènes purifiés de l’arachide
III.2.2.1.a.Caractéristiques des sérums utilisés
III.2.2.1.b.Profils des courbes de dégranulation
III.2.2.1.c.Intensités des dégranulations
III.2.2.1.d.Doses d’allergènes induisant les dégranulations
III.2.2.2. Liens entre capacité à dégranuler et caractéristiques immunochimiques des sérums et cliniques des patients
III.2.2.2.a.Pourcentages en IgE spécifiques vs IgE totales des sérums et intensités de dégranulation
III.2.2.2.b.Existe-t-il un lien entre la capacité des sérums à dégranuler les cellules et la symptomatologie du patient ?
III.2.2.2.c.Les complexes IgE-IgG présents dans les sérums ont-ils une influence sur le test de dégranulation ?
III.2.2.3. Conclusions
IV.CONCLUSIONS ET DISCUSSION GENERALE
SECONDE PARTIE : EFFET DE TRAITEMENTS THERMIQUES SUR L’ALLERGENICITE DE LA GLOBULINE 7S DE L’ARACHIDE (Ara h 1)
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. Purifications et modifications des allergènes
II.2. Données cliniques des patients allergiques recrutés et caractérisations immunologiques de leurs sérums
II.3. Etude de la capacité de liaison des allergènes naturels/modifiés aux IgE de patients allergiques
II.3.1. Dosage des IgE spécifiques humaines
II.3.1.1. Dosage des IgE spécifiques par EAST
II.3.1.2. Détection des IgE spécifiques par capture des IgE
II.3.2. Etude de la capacité de liaison des allergènes aux IgE de patients
allergiques
II.4. Etude in vitro du potentiel de déclenchement des allergènes naturels ou modifiés à l’aide des IgE humaines
II.5. Etude in vivo et in vitro du potentiel de déclenchement des allergènes naturels/modifiés chez la souris BALB/c
II.5.1. Souris
II.5.2. Sensibilisation expérimentale
II.5.2.1. Immunisation en AIF
II.5.2.2. Immunisation en alum
II.5.3. Confirmation de la sensibilisation
II.5.3.1. Dosage enzymo-immunologiques des IgE, IgG1 et IgG2a totales et spécifiques de Ara h 1 – N
II.5.3.2. Dosage des cytokines Th1/Th2 sécrétées par les splénocytes des souris immunisées
II.5.3.2.a. Mise en culture et réactivation des splénocytes
II.5.3.2.b. Dosage des cytokines Th1/Th2
II.5.4. Etude de la capacité de liaison des allergènes naturels/modifiés aux IgE de souris sensibilisées expérimentalement
II.5.5. Etude in vitro du potentiel de déclenchement des allergènes naturels ou
modifiés à l’aide des IgE de souris sensibilisées expérimentalement
II.5.6. Test de déclenchement in vivo chez la souris sensibilisée expérimentalement
II.5.6.1. Mesure des paramètres de la réaction allergique immédiate
II.5.6.1.a. Test de provocation et prélèvement des LBA
II.5.6.1.b. Dosages des leucotriènes et des prostaglandines dans les LBA
II.5.6.2. Mesure des paramètres de la réaction tardive
II.5.6.2.a. Test de provocation et prélèvement des LBA
II.5.6.2.b. Analyse de l’influx cellulaire dans les LBA
II.5.6.2.c. Dosage des cytokines Th1/Th2 dans les LBA
II.5.7. Analyses statistiques
III.RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. Analyse des profils de sensibilisation aux albumines 7S de l’arachide, de la noisette, du soja et du pois chez les patients allergiques
III.1.1. Dosages des IgE spécifiques de la globuline 7S du pois et du soja dans les sérums de patients allergiques
III.1.2. Profils de sensibilisation aux allergènes de noisette selon l’origine géographique des patients
III.1.3. Sensibilisation des patients allergiques à l’arachide
III.1.4. Conclusions et nouveaux objectifs
III.2. Effets des traitements thermiques sur l’allergénicité de la globuline 7S de l’arachide (Ara h 1)
III.2.1. Evaluation de l’effet de traitements thermiques sur la capacité de liaison aux IgE de patients allergiques à l’arachide
III.2.1.1. Analyse des IgE spécifiques par dosage EAST
III.2.1.2. Analyse par test d’inhibition en capture d’IgE
III.2.1.2.a.Détection des IgE spécifiques de Ara h 1 – N en capture d’IgE
III.2.1.2.b.Tests de compétitions de Ara h 1 – N vs Ara h 1 – C et – CG en capture d’IgE
III.2.2. Effet des traitements thermiques sur la capacité de dégranulation de cellules effectrices sensibilisées par les IgE de patients allergiques
III.2.3. Effet des traitements thermiques sur le potentiel de déclenchement de la réaction allergique chez des souris sensibilisées expérimentalement
III.2.3.1. Evaluation de la sensibilisation des souris
III.2.3.1.a.Dosages des IgE, IgG1 et IgG2a induites
III.2.3.1.b.Dosages des cytokines Th1/Th2 sécrétées ex vivo
III.2.3.2. Etude de la capacité de liaison des IgE spécifiques induites à Ara h 1 naturelle et modifiée
III.2.3.3. Tests de déclenchement in vitro à l’aide de sérums de souris sensibilisées expérimentalement
III.2.3.4. Induction du déclenchement de la réaction allergique in vivo
III.2.3.4.a.Analyse des marqueurs précoces de la réaction allergique
III.2.3.4.b.Analyse des marqueurs de la réaction tardive
III.2.3.5. Conclusions
IV.CONCLUSIONS ET DISCUSSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE

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