Soutenance mémoire
Le régime méditerranéen, caractérisé par une consommation élevée et variée de produits végétaux (légumes, fruits, huile d’olive, thé…etc), est associé à un allongement de l’espérance de vie. Plusieurs études épidémiologiques suggèrent que la protection qu’une alimentation riche en produits végétaux semble apporter contre le développement de diverses pathologies dégénératives associées au stress oxydant telles que les maladies cardiovasculaires, les maladies neurodégénératives et divers cancers, serait due aux microconstituants de cette diète dont les polyphénols sont les principaux représentants [1, 2].
Les polyphénols possèdent un large éventail d’activités biologiques in vitro (antibactériennes, anti-cancérigène, anti-inflammatoire, antioxydante etc…) liées à leur caractère réducteur et à leur affinité pour les protéines et les ions métalliques. Les polyphénols présentant ainsi des propriétés antioxydantes bien établies et en lien avec l’inhibition de l’oxydation aussi bien dans le domaine alimentaire (oxydation des lipides) que physiologique (stress oxydant). Ces substances suscitent beaucoup d’intérêts dans plusieurs domaines, celui de la nutrition par leur caractère préventif à l’égard de diverses maladies citées précédemment, en cosmétologie et surtout dans les industries agroalimentaires par leurs implications, en particulier, sur la flaveur des aliments et leur incidence sur la conservation des produits alimentaires. Ainsi, ils pourraient constituer une alternative à l’utilisation des additifs alimentaires synthétiques, buthylhydroxyanisol (BHA) et buthylhydroxytoluène (BHT), qui ont montré des effets nuisibles (effet carcinogène) [3].
Une meilleure connaissance du devenir des polyphénols d’importance alimentaire après ingestion et des effets nutritionnels qui en découlent est essentielle d’un point de vue de nutrition préventive. Un des objectifs de la recherche en nutrition préventive est de parvenir à démontrer in vivo les effets de la consommation de polyphénols sur la santé et à identifier, parmi les centaines de polyphénols, ceux qui pourraient jouer un rôle protecteur plus important dans une optique de nutrition préventive.
Aujourd’hui encore, ces molécules n’ont pas livré tous leurs secrets. Notre travail s’inscrit dans un programme de recherche visant à mieux comprendre le pouvoir antioxydant des polyphénols abondants dans l’alimentation et les facteurs physico-chimiques modulant leur activité possible dans le tractus digestif.
Présentation générale sur les polyphénols
Depuis une quinzaine d’années, chercheurs et industriels de l’agro-alimentaire s’intéressent de plus en plus à une catégorie d’antioxydants, les polyphénols. La reconnaissance des propriétés antioxydantes de ces composés, leur abondance dans l’alimentation et leur rôle probable dans la prévention des maladies associées à un stress oxydant sont les principales raisons de cet engouement.
Quelles molécules ?
Les polyphenols, dénommés aussi composés phénoliques, sont des molécules spécifiques du règne végétal et qui appartiennent à leur métabolisme secondaire [1- 3]. On les trouve dans les plantes, depuis les racines jusqu’aux fruits. Leurs fonctions ne sont pas strictement indispensables à la vie du végétal, cependant ces substances jouent un rôle majeur dans les interactions de la plante avec son environnement [4], contribuant ainsi à la survie de l’organisme dans son écosystème. Le terme « phénol » englobe approximativement 10000 composés naturels identifiés [5, 6]. L’élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d’au moins un noyau phénolique à 6 carbones (Fig. 1), auquel est directement lié au moins un groupe hydroxyle (OH) libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester ou hétéroside [7, 8].
Les composés phénoliques des végétaux sont issus de deux grandes voies d’élaboration de cycles aromatiques, la voie shikimate (également responsable de la synthèse des acides aminés Phe et Tyr) et la voie polyacétate, qui consiste en la condensation de molécules d’acétylcoenzyme A. Cette biosynthèse a permis la formation d’une grande diversité de molécules qui sont spécifiques d’une espèce de plante, d’un organe, d’un tissu particulaire [10, 11].
Classification des polyphénols
La classification des polyphénols est basée essentiellement sur la structure, le nombre de noyaux aromatiques et les éléments structuraux qui lient ces noyaux. On peut distinguer deux catégories : les composés phénoliques simples et les composés phénoliques complexes [12, 13].
Polyphénols simples
Acides phénoliques
Ce sont des composés organiques possédant au moins une fonction carboxylique et un hydroxyle phénolique. Ils sont représentés par deux sous-classes μ les dérivés de l’acide hydroxybenzoïque et de l’acide hydroxycinnamique [11].
L’acide caféique est le principal représentant de cette catégorie. Il est présent dans de nombreux végétaux (graine de café, tomate, olive, pomme), en particulier dans les fruits. Il représente 75 à 100% de la teneur totale en acides hydroxycinnamiques de la majorité des fruits, principalement sous forme d’ester de l’acide quinique (acide chlorogénique) [15]. L’acide chlorogénique est présent en très forte concentration dans la pomme (430 mg/kg) [18] et dans le café, une seule tasse peut en contenir de 70 à 350 mg [15].
Flavonoïdes
Les flavonoïdes sont des composés possédant un squelette de base à quinze atomes de carbone, constitués de deux noyaux aromatiques et d’un hétérocycle central de type pyrane, formant une structure C6-C3-C6 (Fig. 4) [19]. Ce sont les composés les plus abondants parmi tous les composés phénoliques. Ils interviennent dans la pigmentation des fleurs et dans les processus de défense contre le rayonnement UV, les herbivores et les attaques microbiennes [20]. Les flavonoïdes sont présents dans une grande variété d’aliments (fruits et légumes, céréales, jus de fruits, thé et vin…).
• Flavanones
Les flavanones sont caractérisées par l’absence de la double liaison entre C2 et C3 et par la présence d’un centre de chiralité en C2 [11, 17]. Les agrumes constituent la principale source alimentaire de flavanones. Les principaux aglycones sont l’ériodictyol dans le citron, la naringénine dans le pamplemousse et l’hespéritine dans l’orange (Fig. 5) : un jus d’orange contient entre 200 et 600 mg d’hespéritine/L [15].
• Flavonols
Les flavonols se distinguent par la présence d’un groupement OH en position C3 et d’une double-liaison en C2-C3 (Fig. 6). Ils peuvent exister soit sous forme d’aglycones, soit sous forme d’hétérosides. Les sucres les plus souvent impliqués sont des aldoses: D-glucose et Lrhamnose [20]. Leurs principaux représentants sont la quercétine, le kaempférol et la rutine. Les sources les plus riches sont les oignons (350-1200mg/kg de matière fraiche) [21, 22], le poireau, le chou et les baies telles que le cassis (115 mg/kg de matière fraiche) [23]. Le thé contient aussi des flavonols à hauteur de 45 mg/L [24].
Polyphénols complexes (tanins)
Les tanins représentent une classe très importante de polyphénols localisés dans les vacuoles [39]. Historiquement, le terme « tanin » regroupe des composés polyphénoliques caractérisés par leurs propriétés de combinaison aux protéines [40], d’où leur capacité à tanner le cuir. Sur le plan structural, les tanins sont divisés en deux groupes, tanins hydrolysables et tanins condensés [41]:
– Tanins hydrolysables : ce sont des esters du D-glucose et de l’acide gallique ou de ses dérivés, en particulier l’acide ellagique (Fig. 11) [42, 43]. Ces substances sont facilement hydrolysables par voie chimique ou enzymatique (tannase) [44].
– Tannins condensés : les tannins condensés ou les proanthocyanidines sont des polymères constitués d’unités flavane reliées par des liaisons entre les carbones C4 et C8 ou C4 et C6 (Fig. 11) [45, 43].
En raison de leur complexation avec les protéines salivaires, les tanins condensés sont responsables de l’astringence caractéristique des fruits avant maturité (raisin, pêche, pomme, poire, etc…) et de certaines boissons (vin, cidre, thé, etc…) et de l’amertume du chocolat.
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Table des matières
Partie1, Chapitre I: Ultrasons
I.1 Domaines d’utilisation des Ultrasons en fonction de la fréquence
I.2 Propagation de l’onde sonore dans un milieu
I.3 Cycles de compression et de raréfaction induits par une onde sonore
Liste des figures
I.4 Evolution d’une bulle de cavitation à proximité d’une surface solide (a) et d’une cellule végétale (b)
I.5 Schéma de dispositifs à ultrasons : bac et sonde
I.6 Réacteurs de laboratoire d’extraction assistée par ultrasonsμ (A) batch (Reus-www.etsreus.com) et (B) continu
I.7 Equipements industriels d’extraction par ultrasons à l’échelle pilote (cuve de 50 L), (A) en batch (Reus – www.etsreus.com) et (B) en continu
I.8 Dispositifs d’extraction par ultrasons (2 X 500 L) à l’échelle industrielle pour les produits liquides et solides permettant l’extraction semi continue
I.9 Avantage de la filtration assistée par ultrasons
I.10 Mécanisme de dommage cellulaire par ultrasons
Partie 1, Chapitre II : Enrichissement de l’huile d’olive
II.1 Arbre d’olivier (Olea europaea L) (A) et feuilles et fruits d’olivier (B)
II.2 Optimisation du rapport feuille d’Olea europea L / huile d’olive
II.3 Bac à ultrason de laboratoire de 3L (R.E.U.S)
II.4 Procédé d’extraction des composés phénoliques des huiles végétales
II.5 Représentation graphique de la distribution virtuelle des points expérimentaux intervenant dans le PCC
II.6 Etapes du test de DPPH
II.7 Image et représentation schématique d’une sonde Testo
II.8 Représentation 3D du système de couleur CIELAB
II.9 Photographies : (a) microscope électronique à balayage, (b) microtome à rétraction et (c) coupes transversales sériées
II.10 Effet de la charge sur le taux de polyphénols totaux
II.11 Diagramme de Pareto pour la concentration d’oleuropéine
II.12 Paramètres optimisés par la méthodologie de surfaces de réponses pour l’oleuropéine
II.13 Comparaison cinétique de l’enrichissement de l’HOV assisté par ultrasons (VOO-US) et la méthode conventionnelle (VOO-CV)
II.14 Chromatogrammes HPLC-DAD à 280 nm des extraits méthanoïques de l’HOV (A), de l’HOV-US (B) et de l’HOV-CV (C)
II.15 Photographies de microscopie électronique à balayage des structures des feuilles d’oliviers après différents traitements : (A) Contrôle, (B) Macération et (C) Sonication
II.16 Activité scavenger du DPPH de l’HOV avant et après enrichissement
II.17 Activité scavenger du DPPH en fonction de la concentration des huiles.
II.18 La fraction polaire totale au cours des sessions de friture (180°C), des huiles étudiées.
II.19 Equipement ultrasonique (30 L) à l’échelle pilote, utilisé pour l’enrichissement assisté par ultrasons de l’HOV
Liste des figures
Partie 2, Chapitre I : Etat des connaissances
I.1 Sérum albumine humaine
I.2 Représentations de la structure chimique des cyclodextrines naturelles
I.3 Représentations schématiques de complexes d’inclusion de toechiométries différentes
Partie 2, Chapitre II : Activité antioxydante des polyphénols
II.1 Fréquence d’utilisation des méthodes d’évaluation in vitro de l’activité antioxydante
II.2 Structure du radical stable DPPH•
II.3 Réduction du radical DPPH• 119
II.4 Solubilisation du radical DPPH• en tampon acétate (pH 5) en présence du détergent Brij 35 (20 mM)
II.5 Spectre d’absorption du DPPH• (1.5 mM) dans le tampon acétate (0.1 M, pH 5) en présence du Brij 35 (20 mM)
II.6 Tracé de l’absorbance du radical DPPH à 52λ nm en fonction du temps après addition de rutine
II.7 Eléments essentiels pour l’activité antioxydante des flavonoïdes 129
II.8 Réduction du radical ABTS●+ par la quercétine, la rutine et la catéchine 129
II.9 Mécanisme général d’oxydation de la quercétine 131
II.10 Mécanisme général d’oxydation de la catéchine 132
II.11 Proposition de structures pour les produits d’oxydation de la rutine (II–IV) 133
II.12 Positionnement du DPPH• dans une micelle de Brij 35 135
II.13 Positionnement de la rutine dans une micelle de Brij 35 136
Partie 2, Chapitre III : Interaction des polyphénols avec des ions métalliques
III.1 Géométrie de coordination des ions métalliques dans les complexes (a), coordination octaédrique possible des complexes polyphénols-fer en général (b)
III.2 Coordination de Fe2+ avec un polyphénol et transfert d’électron en présence d’oxygène générant le complexe Fe3+-polyphénols (A), Coordination de Fe3+ avec un polyphénol, réduction de l’ion et formation de la semiquinone avec réduction de Fe3+ (B). R= H, OH (B)
III.3 Structures des complexes fer-quercétine (A) et fer-rutine (B) dans MeOH 154
III.4 produits de la réaction d’oxydation des flavonols induite par les ions du fer et du cuivre.
III.5 La réduction des ions Fe3+ et Cu2+ par un phénol permet de produire les ions de basse valence nécessaires à la réaction de Fenton, conduisant ainsi à des lésions de l’ADN
III.6 Structure de la ferrozine
Liste des figures
III.7 a) Structure chimique de la rutine. b) Sites de complexation métallique de la rutine
III.8 Complexation de la rutine par AlIII dans tampon acétate (0.1 M, pH 5, 25°C). Concentration de rutine = 50 μM
III.9 Tracé des variations de A (382 nm) après ajout de Al3+ (1, 1.5, 2, 3 et 5 équiv.). Concentration de rutine = 50 µM, tampon acétate 0.1 M, pH 5, 25°C
III.10 Tracé des variations de ΔA (382 nm) en fonction de la concentration totale de métal. Concentration de rutine = 50 µM, tampon acétate 0.1 M, pH 5, 25°C
III.11 Tracé de la constante cinétique apparente de formation du complexe kobs en fonction de Mt
III.12 Complexation de la rutine (50µM) par 5 équiv. d’AlIII dans le tampon acétate (0.1M, pH 5, 25°C)
III.13 Variation de l’absorbance finale à 400 nm en fonction de la concentration totale de FeIII. Concentration de rutine = 50 μM (tampon acétate 0.1 M, pH 5, 25°C)
III.14 Suivi cinétique de la complexation rutine – FeIII (tampon acétate 0.1 M, pH 5, 25°C)
III.15 Suivi cinétique à plusieurs longueurs d’onde de la complexation de la rutine (50 µM) par 1 equiv. de Fe 3+ (tampon acétate pH=5, 25°C)
III.16 Distribution des espèces lors de la complexation de la rutine (50 µM) par 1 equiv. de Fe 3+ (tampon acétate, pH, 25°C).
III.17 Dosage F2+ (100µm) en absence ou en présence de rutine (1eq), tampon acétate (pH=5 et T=25°C)
III.18 Spectres UV-vis de solutions Rutine (50 µM) + 1 equiv. Fe 3+ à différents pH (25°C)
III.19 Interaction de la rutine (50 µM) avec Fe 3+ (1 equiv.) en présence et en absence de la protéine SAB (3 équiv.) dans le tampon acétate (pH 5, 25°C)
III.20 Interaction de la rutine (50 µM) avec Fe 2+ (1 equiv.) dans le tampon acétate (pH 5, 25°C) après 3h
III.21 Suivi cinétique de l’interaction de la rutine (50 µM) avec Fe 2+ (1 equiv.) dans le tampon acétate (pH 5, 25°C). pH (25°C).
III.22 Dosage de Fe2+ (100 µM) en absence ou en présence de rutine (1 équiv.), tampon acétate (pH 5, 25°C)
III.23 Structure chimique de l’acide chlorogénique 180
III.24 Complexation de l’acide chlorogénique (50 µM) par 5 équiv. de AlIII dans le tampon acétate (0.1M, pH 5, 25°C)
III.25 Tracé des variations de A(350 nm) après ajout de Al3+ (2, 3, 4, 5 et 10 équiv.). Concentration d’acide chlorogénique = 50 µM, tampon acétate 0.1 M, pH 5, 25°C
Liste des figures
III.26 Tracé des variations de ΔA(350 nm) en fonction de la concentration totale de métal. Concentration d’acide chlorogénique = 50 µM, tampon acétate 0.1 M, pH 5, 25°C
III.27 Tracé de la constante cinétique apparente de formation du complexe kobs en fonction de Mt
III.28 Complexation de l’acide chlorogénique (50 µM) par 1 équiv. de FeIII dans le tampon acétate (0.1M, pH 5, 25°C)
III.29 Complexation de l’acide chlorogénique par FeIII dans le tampon acétate (0.1 M, pH 5, 25°C). Concentration d’acide chlorogénique = 50 μM
III.30 Suivi cinétique de la complexation acide chlorogénique-FeIII (tampon acétate 0.1 M, pH 5, 25°C)
III.31 Suivi cinétique de la complexation de l’acide chlorogénique (50 µM) par 1 équiv. de Fe 3+ dans le tampon acétate (pH 5, 25°C).
III.32 Dosage de Fe2+ dans une solution de Fe3+ (100 µM) en absence ou en présence d’acide chlorogénique (1 équiv.), tampon acétate (pH 5, 25°C)
III.33 Spectres UV-visible du mélange acide chlorogénique (AC, 50 µM) + 1 équiv. Fe 3+
III.34 Interaction de l’acide chlorogénique (AC) avec Fe 3+ (1 équiv.) en présence et en absence de la protéine SAB (3 équiv.) dans le tampon acétate (pH 5, 25°C).
III.35 Complexation de l’acide chlorogénique par 5 équiv. FeII dans le tampon acétate (0.1M, pH 5, 25°C). Concentration d’acide chlorogénique (AC) = 50 μM.
III.36 Suivi cinétique sur 3h de la complexation de l’acide chlorogénique (50 µM) par 1 équiv. de Fe 2+ dans le tampon acétate (pH 5, 25°C).
III.37 Dosage F2+ (100µm) en absence ou en présence de l’acide chlorogénique (1eq), tampon acétate (pH=5 et T=25°C)
III.38 Structure chimique de la (+)-catéchine (a) et de son complexe métallique (b)
III.39 Interaction de la catéchine avec 1, 3 et 5 equiv. de FeIII dans le tampon acétate (0.1M, pH 5, 25°C). Concentration de la catéchine (Cat) = 50 μM.
III.40 Interaction de la catéchine avec 3 équiv. FeII dans le tampon acétate (0.1M, pH 5, 25°C). Concentration de la catéchine (Cat) = 50 μM
III.41 Evolution du spectre UV-visible du complexe rutine-AlIII (5 équiv. AlIII) dans le tampon acétate (0.1M, pH 5, 25°C) en présence de la catéchine
III.42 Interaction de différents polyphénols (50 µM) avec Cu + et Cu 2+ (5 équiv.) dans le tampon acétate (pH 5, 25°C)
III.43 Autoxydation du Fe2+ (concentration initiale = 100 µM), dans le tampon acétate de pH 5-6, en présence d’ions phosphates, 25°C
III.44 Complexation de la rutine (50 μM) par FeII (2.5 équiv.) dans le tampon acétate (0.1 M, pH6, 5 mM phosphate, 25°C). 3 min après mélange
III.45 Complexation de la rutine (50 µM) par Fe II dans le tampon acétate (0.1 M, pH 6, 5 mM phosphate, 25°C), en présence et en absence de SAB (3 équiv.), 3 min après mélange
III.46 Liaison de FeII-rutine (tampon acétate + 5 mM phosphate, pH 6, 25°C). Rutine (50 µM), 3 équiv. SAB et 2.5 équiv. FeII
III.47 Les principaux sites de l’albumine impliqués dans son activité antioxydante : la séquence de quatre acides aminés Asp-Ala-His-Lys de l’extrémité N-terminale et le résidu cystéine libre (Cys 34)
III.48 Autoxydation de Fe2+ (concentration initiale = 100 µM) en absence ou en présence de rutine (1 équiv.) et de SAB (1 équiv.) dans le tampon acétate (pH 6, 5 mM phosphate, 25°C)
III.49 Rutine (50 µM) + 2.5 équiv. Fe 2+ dans le tampon acétate (pH 6, 5 mM phosphate, 25°C)
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