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Polymorphisme génétique de Plasmodium falciparum
Description
Le polymorphisme chez Plasmodium falciparum a tout d’abord été mis en évidence par l’étude des iso enzymes, puis par des anticorps monoclonaux. Ceci a permis de sérotyper des souches de culture (Mc Bride et al., 1982) ou des souches prélevées chez des malades en zone d’endémie (Babiker et al., 1991) et de mettre en évidence un polymorphisme considérable. Plusieurs types d’événements ont été décrits : mutations ponctuelles, différence dans la séquence primaire des motifs répétitifs, accumulation de mutations ponctuelles conduisant à la constitution de familles alléliques, variation du no mbre de répétitions, réarrangements chromosomiques provoquant des délétions partielles ou totales des gènes, recombinaison intra chromosomique ou intra génique (Kemp et al., 1990). A ce polymorphisme de type alléliques, s’ajoute le phénomène de la variation antigénique par lequel le parasite expose plusieurs leurres d’un même antigène au cours d’une même infection (Hamza et al., 1995). La variation antigénique met en jeu un répertoire de gènes codant pour l’antigène variant exposé à l a surface du pathogène. Il permet une réponse adaptative plus rapide que ne le permet le polymorphisme alléliques et ou la diversité génétique engendrée par la reproduction sexuée.
Analyse du polymorphisme
Les récents progrés des techniques de la biologie moléculaire ont permis de mesurer toute l’étendue du polymorphisme de l’espèce P. falciparum, polymorphisme beaucoup plus large que ne l’avaient laissé entrevoir les études plus anciennes utilisant des méthodes plus classiques d’investigation (Niang, 2001). La diversification alléliques des gènes de P. falciparum est favorisée par la présence de structure répétitive. En effet, le génome de P. falciparum présente une grande tolérance à l’insertion de séquences répétitives et variables. Ces structures sont dynamiques, elles évoluent plus rapidement que les séquences uniques permettant l’émergence rapide de nouvelles formes alléliques. Un très grand nombre de gènes polymorphes utilisables comme marqueurs génétiques ont été identifiés chez P. falciparum et parmi eux on peut citer : dhfr et qui a été utilisé dans cette étude pour préciser les mutations observées.
Technique de réaction de polymérisation en chaîne
Historique
C’est une technique d’amplification sélective d’une séquence d’ADN comprise entre deux amorces d’orientation inverse et de séquence connue. Elle a été mise au point par Karry Mullis en 1985 (Mullis, 1990) qui voulait retrouver une mutation ponctuelle. Ainsi il a réalisé une réaction proche du séquençage en utilisant des didésoxynucléotides (ddNTP) marqués radio activement. L’expérience devait se faire dans quatre tubes qui devraient contenir chacun de l’ADN polymérase, des amorces oligonucléotidiques et un des quatre ddNTP. Ainsi après fixation du ddNTP, il était possible après autoradiographie, d’identifier le nucléotide adjacent à l’amorce. Puis Mullis se proposa une deuxième amorce complémentaire du s econd brin parental afin d’avoir un test plus fiable. S’étant rendu compte de la présence de dNTP en de très faibles quantités dans les solutions d’ADN, il a voulu les diminuer en faisant réagir l’ADN polymérase dans un premier temps. Cette réaction devait allonger certaines amorces qui auraient perturbé les résultats selon Mullis. Mais ayant poursuivi son raisonnement, il s’est rendu compte que ces fragments néoformés n’auraient été rien d’autre que les copies des deux brins initiaux. Il y’aurait eu duplication des séquences d’ADN initiales. Des travaux ont montré que l’amplification était effective. A partir d’un fragment, on aurait théoriquement 2n fragments après n cycles. La PCR, une méthode simple et rapide, était née. Elle connaîtra diverses applications et de nombreux protocoles adaptés à différents matériaux seront mis au point.
Principe de la PCR
Dans la cellule, la duplication a lieu juste avant la mitose. L’ADN polymérase intervenant, ne fait qu’allonger des chaînes de nucléotides à partir d’un double brin. Après la séparation des deux brins d’ADN (dénaturation), des fragments d’ARN appelés amorces s’apparient (ou s’hybrident) à l eurs séquences complémentaires au niveau de chaque brin d’ADN. Puis l’ADN polymérase les allonge par ajout de nucléotides aboutissant ainsi à la formation d’une copie complémentaire de chaque brin d’ADN. On a ainsi deux nouvelles molécules identiques à la molécule de départ (Darnel et al., 1988). Une polymérisation est ainsi faite. La PCR est basée sur ce même principe. Elle consiste à u tiliser deux amorces oligonucléotidiques de synthèse de 20 à 25 nucléotides complémentaires des extrémités 5’ de deux brins d’ADN encadrant la séquence à amplifier. Sous l’action de l’ADN polymérase, chaque amorce est allongée dans le sens 5’→ 3’ d’une séquence exactement complémentaire du brin recopié. Une réaction de PCR correspond à une succession d’environ 30 cycles comportant chacun trois étapes : la dénaturation, l’hybridation et l’élongation. La répétition des cycles aboutit à une amplification exponentielle de la séquence cible considérée .
Composantes de la PCR
Pour faire une bonne PCR, les éléments nécessaires sont : L’ADN, les amorces, l’enzyme de polymérisation, le tampon, les nucléotides et l’eau.
L’ADN
Généralement sous forme de double brin contenant le fragment à amplifier, il constitue la cible à partir de laquelle se feront les copies. Les origines de cet ADN peuvent être multiples : tissus frais, tissus conservés l’état sec, tissus sec conservés à -70°C, tissus conservés dans de l’alcool, échantillon de sang … (Scott et al., 1993). L’ADN ne doit pas comporter de rupture au niveau des séquences à amplifier. Il doit être pur c’est-à-dire être débarrassé des protéines qui lui sont associées. Ces impuretés peuvent conduire à des amplifications parasites dues aux ARN ou à une baisse du rendement par le fait des protéines associées comme les histones (Kaplan & Delpech, 1993 ; Delpech et al., 1999). Il peut être associé à des inhibiteurs de la Taq polymérase soit lors de son extraction, soit lors de sa conservation. Des lavages au chloroforme permettent d’éliminer le phénol. Des dilutions de solution d’ADN permettent de réduire l’effet de ces produits (Ju & Charron, 1992 ; Jackson et al., 1993 ; Paskewitz et al., 1993 ; Delpech et al., 1999).
Les amorces
Ou primers en anglais, ils sont au nombre de deux (amorce sens et amorce antisens) et sont de petits brins d’ADN d’environ 20 b ases chacun, capables de s’hybrider de façon spécifique grâce à la complémentarité des bases sur le brin d’ADN ou sur son brin complémentaire. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d’ADN à amplifier. Elles doivent avoir des quantités (G et C, A et T) sensiblement égales afin d’éviter la formation de structure secondaires comme les boucles (Innis & Gelfand, 1990 ; Taylor, 1993). La séquence de l’une des amorces ne doit pas être complémentaire à l’autre pour éviter l’hybridation entre amorces (Bogard & Lamoril, 1998). Les fortes concentrations doivent être évitées car elles entraînent des amplifications de séquences non ciblées (Innis & Gelfand, 1990).
L’enzyme
La plus utilisée est la Taq polymérase, une ADN polymérase thermorésistant extraite de la bactérie Thermus aquaticus qui vit dans les sources thermales entre 80° C et 90°C (Kaplan & Delpech, 1993). Sa température optimale d’action varie entre 65°C et 72°C (Taylor, 1993) et elle est capable de résister à d es passages successifs à 95°C, ce qui a r endu possible l’automatisation à l a procédure. A cette température, la Taq polymérase est capable de juxtaposer 100 nucléotides par seconde. Les faibles et fortes températures ont pour effet de diminuer l’activité de la Taq polymérase. Il faut savoir que les Taq polymérases d’origines différentes, se comportent différemment (Innis & Gelfand, 1990 ; Meunier & Grimont, 1993) et ceci doit être pris en compte si l’on veut utiliser la technique PCR. Certains auteurs préfèrent, si le nombre d’échantillons à traiter est petit, ajouter la Taq polymérase après le premier cycle de dénaturation pour avoir un rendement maximum (Kapland & Delpech, 1993).
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Table des matières
INTRODUCTION
I. GENERALITES
I.1. Le paludisme
I.1.1. Définition du paludisme
I.1.2. Epidémiologie
I.1.2.1. Agents pathogènes
I.1.2.1.1. Classification
I.1.2.1.2. Cycle évolutif
I.1.2.2. Transmission
I.1.2.2.1. Vecteurs
I.1.2.2.2. Faciès épidémiologiques
I.1.2.2.3. Modes de contamination
I.1.2.2.4. Facteurs favorisants
I.1.3. Clinique
I.1.3.1. Chez les accès simples
I.1.3.2. Chez les accès pernicieux
I.1.4. Diagnostic biologique
I.1.4.1. Frottis sanguin
I.1.4.2. Goutte épaisse
I.1.4.3. Quantitative Buffy Coat (Q. B. C.)
I.1.4.4. Polymerase Chain Reaction (PCR)
I.1.4.5. Tests rapides de diagnostic (TRD)
I.1.5. Traitement
I.1.5.1. Schizonticides
I.1.5.1.1. Schizonticides naturels
I.1.5.1.2. Schizonticides de synthèse
I.1.5.2. Gamétocytocides
I.1.6. Chimiorésistance
I.1.6.1. Définition
I.1.6.2. méthodes d’étude de la résistance
I.1.6.3. Gènes impliqués dans la résistance
I.1.6.3.1. Le gène dhfr
I.1.6.3.2. Le gène dhps
I.1.6.4. Mécanismes
I.1.6.5. Chimiorésistance multiple
I.1.6.6. Facteurs favorisants
I.1.7. Polymorphisme génétique de Plasmodium falciparum
I.1.7.1. Description
I.1.7.2. Analyse du polymorphisme
I.2. Technique de la réaction de polymérisation en chaîne
I.2.1. Historique
I.2.2. Principe
I.2.3. Composantes de la PCR
I.2.3.1. L’ADN
I.2.3.2. Les amorces
I.2.3.3. L’enzyme
I.2.3.4. Les nucléotides
I.2.3.5. Le tampon
I.2.3.5.1. Le Tris HCl
I.2.3.5.2. Le Chlorure de Magnésium
I.2.3.5.3. Le chlorure de potassium
I.2.3.5.4. Les détergents et la gélatine
I.2.3.6. L’eau
I.2.4. Conditions de la réaction
I.2.4.1. Dénaturation
I.2.4.2. Hybridation
I.2.4.3. Elongation
I.2.5. Détection et analyse des produits de PCR
I.2.5.1. Migration électrophorétique
I.2.5.2. Révélation des produits de PCR
I.2.6. Digestion enzymatique
I.2.7. Contamination en PCR
II. MATERIEL ET METHODES
II.1. Cadre d’étude
II.1.1. Historique du centre de santé
II.1.2. Situation géographique
II.1.3. Missions
II.2. Matériel et réactifs de laboratoire
II.2.1. Matériel
II.2.2. Réactifs
II.3. Méthodes d’étude
II.3.1. Extraction
II.3.2. PCR
II.3.3. Migration sur gel électrophorétique
II.3.4. Digestion enzymatique
II.3.5. Révélation
III. RESULTATS
III.1. Caractéristique de la population d’étude
III.2. Amplification du gène dhfr
III.3. Digestion enzymatique
IV. DISCUSSION
CONCLUSION et PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
