Polymérisation de l’actine et motilité cellulaire

Au cours de cette thèse, je me suis intéressé aux mécanismes de production de forces au sein de la cellule. Ces mécanismes interviennent en particulier lors du déplacement et de la multiplication des cellules. Toutes ces activités nécessitent de déformer la cellule pour qu’elle acquière une « polarité ». Sous la membrane plasmique siège ce que l’on nomme le « cytosquelette », organe essentiel au maintien de la forme de la cellule. L’actine, principal composant de ce système, est un biopolymère, capable tantôt de s’assembler en filament ou bien de retourner à l’état de monomère. Les filaments d’actine peuvent ensuite s’organiser pour former des structures tridimensionnelles très variées et adaptées aux fonctions mécaniques dont la cellule a besoin. Le contrôle de la dynamique locale de l’actine ainsi que de sa structure au niveau du cytosquelette permet à la cellule de contrôler sa forme. Ces mécanismes jouent également un rôle fondamental dans le mouvement cellulaire. Bien que très souvent associée à un moteur moléculaire pour générer une force, l’actine est capable, à elle seule par son assemblage, de produire une force suffisante pour déformer une membrane ou propulser un pathogène comme la bactérie Listeria monocytogenes.

Rôles et modes d’action de la polymérisation de l’actine dans la cellule

L’actine joue un rôle important dans de nombreux évènements biologiques fondamentaux. Son action s’exerce à travers sa capacité à polymériser et par les forces mécaniques que cela produit. Ainsi lors de la phagocytose (figure I.1 a), l’actine déforme la membrane de manière à envelopper l’objet à digérer. Un autre exemple est celui de la cytodiérèse, phase tardive de la mitose où il y a division du cytoplasme des deux cellules formées, au cours de cette étape l’actine forme alors un anneau contractile qui contribue à la séparation de ces deux cellules (figure I.1 b). Enfin, on peut citer une fonction essentielle de l’actine qui est celle du maintient de structures cellulaires spécifiques, comme cela est le cas par exemple de la structure en brosse des cellules intestinales, ainsi que pour les cellules ciliaires de l’oreille interne (figure I.1 c).

Dans ces divers mécanismes, l’actine agit rarement seule, elle est notamment souvent associée à des myosines qui sont des moteurs moléculaires qui interagissent avec les filaments d’actine pour générer des forces contractiles. C’est le cas par exemple au sein de nos muscles.

Motilité cellulaire

L’un des aspects les plus importants de l’actine est le rôle qu’elle joue dans la gestion de la morphogenèse de la cellule et notamment lors de la motilité cellulaire, ce que nous avons étudié ici. Il existe, au niveau de la membrane plasmique, des protéines qui ont pour fonction d’initier la polymérisation de l’actine en orientant tous les filaments dans le même sens [Machesky, 1998]. Cette polymérisation localisée « polarise » la cellule et crée un front de migration dans le sens de déplacement de la cellule (figure I.2 ).

L’actine polymérise à l’avant et dépolymérise à l’arrière du front de migration, la cellule recycle ainsi l’actine afin d’avoir constamment des monomères disponibles pour la polymérisation. De nombreuses équipes s’intéressent aux mécanismes liés à l’actine, car les cellules cancéreuses ont entre autre leur machinerie d’actine fortement perturbée. On observe en effet que les cellules cancéreuses se déplacent plus et qu’elles sont capables de passer à travers certains tissus qu’une cellule saine ne peut pas franchir. Ces changements se font conjointement avec les modifications d’expression des protéines régulatrices associées à l’actine [Jordan, 1998] ; c’est en effet à travers une surexpression ou une sousexpression de certaines de ces protéines que s’opèrent les modifications des propriétés de l’actine. Il en découle des bouleversements dans la dynamique des filaments d’actine, ce qui influe fortement sur les propriétés mécaniques et de déplacement des cellules tumorales. En effet, ces cellules présentent une motilité beaucoup plus importante que celle d’une cellule saine. Ce dérèglement du cytosquelette d’actine joue un rôle fondamental dans certaines étapes de la migration de ces cellules cancéreuses depuis leur foyer d’origine jusqu’aux foyers secondaires, favorisant l’apparition de métastases.

Polymérisation de l’actine

Actine monomérique et polymérisation in vitro 

Généralités
L’actine est une protéine très conservée à travers les espèces (qu’elles soient animales ou végétales) [Sheterline, 1994]. Cette protéine globulaire (Actine-G) de 42 kDa, qui est constituée de 375 acides aminés, fut identifiée pour la première fois par Straub en 1942 comme étant une partie du complexe acto-myosine responsable de la génération de forces contractiles dans les muscles [Straub, 1942]. L’actine est une des protéines les plus abondantes dans les cellules eucaryotes et représente 5 à 10% de la masse protéique des cellules (jusqu’à 20% pour les cellules musculaires dont elle est généralement extraite pour la réalisation d’expériences in vitro). Dans les cellules non musculaires, l’actine est très présente près de la surface de la cellule où elle forme le cortex d’actine qui constitue une partie du cytosquelette de la cellule. Ce cortex permet à la cellule d’avoir une résistance mécanique et joue (notamment par sa réorganisation locale) un rôle fondamental dans les mécanismes de motilité cellulaire. Chez l’homme, différents gènes codent pour six types d’actine qui ne varient entre eux que de quelques acides aminés. Les différentes formes sont rangées en trois classes α, β et γ caractérisées par leur point isoélectrique (de 5.4 pour α à 5.9 pour γ) [Zechel, 1978]. Les différentes classes d’actine humaine polymérisent de la même façon in vitro et forment des copolymères entre eux. Il existe cependant de petites différences dans la structure des filaments et des différences plus importantes dans la capacité de certaines protéines à se fixer suivant l’isoforme de l’actine [Segura, 1984]. In vivo, les différentes formes d’actine coexistent dans la cellule mais elles sont différemment régulées et très souvent ne peuvent pas se substituer dans leurs fonctions respectives [Kumar, 1997 ; Chaponnier, 1995]. La polymérisation de l’actine est un processus qui consomme de l’ATP (Adenosine Triphosphate) qui est le « carburant » de la cellule. Le monomère polymérise sous la forme actine-ATP, puis l’ATP est hydrolysée en ADP dans le filament.

Le monomère :
La structure d’un monomère d’actine associé avec un ADP est donnée figure I.3. Le monomère d’actine se replie en deux lobes, le petit et le grand domaine, eux-mêmes divisés en deux sous domaines. La jonction des quatre sous domaines forme un interstice dans lequel réside un complexe métal-nucléotide constitué de K+ ,Ca2+ ou Mg2+ pour le métal et d’ATP ou ADP pour le nucléotide. En effet, l’actine est une ATPase qui catalyse l’hydrolyse de l’ATP en ADP. Bien que les structures de l’actine-ATP et de l’actine-ADP soient très proches, la nature du nucléotide influe significativement sur les propriétés biochimiques du filament d’actine et plus particulièrement sur les mécanismes de polymérisation/dépolymérisation comme nous le verrons par la suite.

Polymérisation in vitro

A très faible force ionique, l’actine se met sous forme globulaire (dite actine-G) ; il en va de même à très forte concentration en sel. A force ionique physiologique (KCl 0.1 M), les monomères d’actine s’assemblent spontanément en filaments (dit actine-F) et adoptent un arrangement hélicoïdal d’une demi-période de 37nm (figure I.4 ). Le mécanisme de « nucléation-élongation » de l’assemblage de l’actine a été élucidé par Oosawa [Oosawa, 1962] et le modèle cinétique par Wegner et Engel [Wegner et Engel, 1975] On distingue quatre étapes principales lors de la polymérisation :
-L’activation : les monomères se lient à un cation Ca2+ ,Mg2+ ou K+ écrantant ainsi la charge négative de la protéine et induisant un changement conformationnel.
-La nucléation : C’est l’étape cinétiquement limitante. Le taux de nucléation est proportionnel au cube de la concentration en actine-G, suggérant la nécessité de la formation d’un trimère de molécules d’actine avant d’avoir une élongation spontanée du filament. Or la formation d’un trimère nécessite la formation préalable d’un dimère qui dans le cas de l’actine est fortement instable.
-La croissance : c’est une phase de croissance rapide du filament qui se termine par un plateau. L’actine-G est une protéine asymétrique, cette asymétrie du monomère rend les filaments formés également asymétriques. On distingue ainsi les deux extrémités en parlant du « bout moins » (dit aussi bout pointu) où l’actine polymérise plus lentement et du « bout plus » (ou bout barbé) où la croissance du filament est rapide. Les liaisons entre monomères dans le filament sont des liaisons faibles. L’actine polymérisée constitue donc une chaîne dynamique constamment en équilibre avec la forme monomérique présente en solution. Pour une extrémité donnée du filament, le taux d’association (nombre de monomères qui s’ajoutent par unité de temps) est proportionnel à la concentration C en actine-G du milieu. Au court du temps, les monomères sont consommés et la concentration en sous unités libres diminue jusqu’à atteindre une valeur critique Cc pour laquelle à chaque instant la dépolymérisation équilibre la polymérisation et le filament arrête de croître. Dans les conditions habituellement rencontrées dans la cellule, c’est à dire notamment en présence d’ATP et à force ionique physiologique, ce sont des monomères d’actine G ATP qui vont préférentiellement polymériser. Une fois dans le filament, il va tout d’abord y avoir clivage de l’ATP en ADP-Pi puis relargage du phosphate dans un deuxième temps. Ce processus est relativement lent, ainsi au bout barbé où la croissance est rapide, il peut se former une coiffe d’actine-ATP [Carlier, 1984]. On se retrouve alors avec des formes différentes d’actine aux deux extrémités du filament : Actine-ATP au bout plus, Actine-ADP au bout moins et de l’Actine-ADP-Pi au centre [Carlier, 1986 et 1991] (figure I.5 ).

Dès lors, la nature de la liaison brisée lors de la dépolymérisation est différente à chacune des extrémités du filament. Cela a pour effet de déplacer les états d’équilibre des deux extrémités et impose d’avoir des concentrations critiques en actine différentes au bout pointu et au bout barbé. Or, l’hydrolyse de l’ATP diminue l’affinité du monomère pour ses voisins, ce qui favorise la dépolymérisation. On se retrouve donc avec une concentration critique au bout pointu supérieure à celle du bout barbé. Cet évènement est la conséquence la plus importante de l’hydrolyse de l’ATP. Ainsi, comme on a Cc(pointu) > Cc (barb) , la croissance du filament va se faire jusqu’à une concentration en actine-G qui sera supérieure à Cc(barbé) et inférieure à Cc(pointu). Ce qui signifie qu’à ce stade, la cinétique du bout plus est dominée par l’ajout de monomères alors qu’au bout moins les monomères se détachent. On a donc un mécanisme dit de « tapis roulant » ou « treadmilling » où la longueur du filament reste constante avec addition de sous unités au bout barbé et dissociation au bout pointu (figure I.6 ).

Contrôle de la polymérisation de l’actine in vivo

On vient de voir les mécanismes de polymérisation de l’actine in vitro. Il s’avère que in vivo, les cinétiques de l’actine et notamment du treadmilling sont très différentes et peuvent être supérieures de plusieurs ordres de grandeur à celles observées in vitro. Ce phénomène est dû à l’action de protéines régulatrices de la cellule que nous présentons ici. In vivo, la polymérisation de l’actine contrôle d’importants événements cellulaires et doit donc être régulée dans l’espace et dans le temps. Certains évènements nécessitent des changements très localisés (comme lors de la formation de filopodes), alors que d’autres engendrent des restructurations plus importante du cytosquelette d’actine comme c’est le cas par exemple pour la formation du lamellipode lorsque la cellule se met en mouvement. Dans tous les cas, ces différents processus sont orchestrés par des protéines liant l’actine, appelées ABPs (Actin Binding Proteins). Leur action se fait selon différentes voies et à différentes échelles, que se soit au niveau du monomère unique ou dans l’organisation des filaments en une structure tridimensionnelle.

Table des matières

INTRODUCTION
I Polymérisation de l’actine et motilité cellulaire
I.1 Introduction
I.1.1 Rôles et modes d’action de la polymérisation de l’actine dans la cellule
I.1.2 Motilité cellulaire
I.2 Polymérisation de l’actine
I.2.1 Actine monomérique et polymérisation in vitro
I.2.1.1 Généralités
I.2.1.2 Le monomère
I.2.1.3 Polymérisation in vitro
I.2.2 Contrôle de la polymérisation de l’actine in vivo
I.2.2.1 Contrôle de la polymérisation des filaments individuels
I.2.2.2 Contrôle de la superstructure
I.3 Listeria monocytogenes et systèmes biomimétiques
I.3.1 Présentation générale de Listeria monocytogenes
I.3.2 Listeria comme modèle d’étude
I.3.3 Systèmes biomimétiques
I.3.3.1 Billes de latex
I.3.3.2 Milieu reconstitué
I.3.4 Etudes physiques
I.3.4.1 Cliquet thermique élastique et filaments attachés : Approche théorique [Mogilner, 2003]
I.3.4.2 Croissance d’un gel d’actine en symétrie sphérique : approche théorique et expérimentale
I.3.4.3 Modèle élastique pour le mouvement : Approche théorique [Gerbal, 2000]
I.3.4.4 Courbure et Brisure de symetrie
I.4 Conclusion
II Croissance d’un gel d’actine et brisure de symétrie
II.1 Approche théorique à une dimension
II.1.1 Position du problème
II.1.2 Modèle des points de réticulation
II.1.2.1 Idées générales du modèle
II.1.2.2 Détail des équations
II.1.2.3 Conclusion du modèle
II.1.3 Modèle de diffusion des monomères d’actine
II.1.3.1 Idées générales du modèle
II.1.3.2 Détail des équations
II.1.3.3 Conclusion du modèle
II.2 Approche expérimentale
II.2.1 Protocole expérimental et observations
II.2.1.1 Préparation des échantillons
II.2.1.2 Observations
II.2.1.3 Conclusion
II.3 Modèle à deux dimensions
II.3.1 Présentation du modèle
II.3.1.1 Distribution des contraintes dans un gel symétrique
II.3.1.2 Concentration des contraintes latérales dans un gel d’épaisseur inhomogène
II.3.1.3 Couplage mécano-chimique : croissance et dissociation d’un gel sous contrainte
II.3.1.4 Instabilité et brisure de symétrie
II.3.2 Etudes des modes de Fourrier et limitations expérimentales
II.3.3 Conclusion
II.4 Conclusion
III Mouvement par l’actine d’un objet déformable
III.1 Présentation du sujet et position du problème
III.2 Expériences
III.2.1 Préparation des gouttes d’huile
III.2.2 Influence des extraits cellulaires
III.2.3 La protéine nucléatrice
III.2.3.1 Densité de greffage
III.2.3.2 Répartition de la protéine nucléatrice
III.3 Mesure de la tension interfaciale
III.3.1 Position du problème
III.3.2 Méthodes et mesures
III.3.2.1 Micropipettes
III.3.2.2 Goutte pendante et goutte montante
III.3.3 Conclusion
III.4 Déformation de vésicules lipidiques
III.4.1 Forces de compressions générées par une comète d’actine sur une vésicule lipidique [Giardini, 2003]
III.4.2 Mise en évidence des forces induites par polymérisation de l’actine sur une vésicule lipidique [Upadhyaya, 2003]
III.5 Observations expérimentales et modélisation
III.5.1 Etat stationnaire
III.5.2 Taille et déformation
III.6 Analyse élastique de la déformation
III.6.1 Présentation du modèle
III.6.1.1 Détermination de la forme
III.6.1.2 Force de propulsion et contraintes
III.6.1.3 Améliorations à apporter au modèle
III.6.2 Influence de l’ajout de protéines réticulant l’actine sur la déformation
III.7 Conclusion
CONCLUSION

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