Plomb et stress oxydatif

Plomb et stress oxydatif

Matériels et Méthodes

La partie expérimentale de la thèse a été réalisée en grande partie dans le laboratoire de BioToxicologie Expérimentale, Bio-Dépollution et Phytorémédiation, Université d’Oran 1 (Ahmed Benbella), Algérie.

Matériel végétal :

La plante étudiée dans ce travail est L’anis vert ou bien Pimpinella anisum L ainsi la partie utilisée est le fruit représenté par des petites graines dont les principales caractéristiques ainsi le lieu d’achat, sont mentionnés dans le tableau suivant :

Choix de la méthode d’extraction :

La méthode d’extraction choisie pour obtenir l’extrait de Pimpinella anisum L ; qui va être utilisé par la suite comme traitement pour les rats intoxiqués au plomb : est la décoction des graines de l’anis vert. Ainsi cette technique est facile, fiable, plus utilisée en pratique culinaire et moins couteuse.
Cependant, il y a une absence totale d’utilisation de solvant chimique qui généralement lors de son usage reste sous forme de trace dans l’extrait. Pour cela, la décoction de la plante étudiée dans l’eau pourrait être administrée aux jeunes rats sans aucun risque, puisque le traitement commence juste après le sevrage dont à cet âge-là, le système de détoxication des rats reste
encore immature.

Préparation de l’extrait aqueux (E .A.P) de Pimpinella anisum L (Anis vert) :

La préparation de l’extrait queux d’anis vert est réalisé par la décoction selon la méthode de Hosseinzadeh et al., (2013), dont 100 g de plante sèche et broyée sont mélangés avec 1000 ml d’eau distillée, ainsi le tout est mis à feu (Température < à 100C°) avec une agitation continue pendant 15 minutes. Le mélange est ensuite filtré à travers papier Wathman N°1, puis on passe à la lyophilisation de l’extrait. Calcule de rendement : Le rendement d’extraction est calculé par la formule donnée par Falleh et al., (2008) :

Etude phytochimique de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L :

Cette étude permet d’identifier l’absence et /ou la présence de quelques groupes de composés bioactifs tout en utilisant des réactions de coloration, solubilisation et de précipitation .En plus des tests qualitatifs, nous avons opté à déterminer la quantité de trois grandes classes de composés bioactifs qui sont : polyphénols, flavonoïdes et Tannins. Cependant ce balayage phytochimique ne pourrait être complété sans avoir une idée sur le potentiel antioxydant de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L, pour cela trois tests ont été réalisés dans ce cadre : (a) Pouvoir réducteur, (b) Activité des antioxydants totaux et (c) Test de piégeage de DPPH.

Détermination des composés phénoliques :

Détection :

A 5 ml de l’extrait est ajouté 1 ml de Fe Cl3 (1%) et 1 ml de K3 (Fe(CN)6) à 1% . La solution est bien mélangée, ainsi l’apparition d’une couleur bleu indique la présence de phénols.

Dosage

Le taux des polyphénols totaux dans l’extrait aqueux d’anis vert est déterminé par la méthode colorimétrique de Folin –Ciocalteu (Wojdylo et al., 2007). Le principe de cette technique est basé sur la réduction de l’acide phosphotungstique phosphomolybdique qui est le réactif de Folin dans une solution alcaline. Brièvement, à 100 µl de l’échantillon, 0,2 ml de réactif FolinCiocalteu et 2 ml d’eau distillée sont ajoutés. Après 3 minutes d’incubation, 1 ml de carbonate de sodium (20%) est ajouté, ainsi la coloration bleu développée est mesurée au spectrophotomètre à 765 nm.

Détermination des flavonoïdes :

Détection :

2 ml de l’extrait de la plante sont traités avec le même volume d’une solution d’acétate de Plomb à 10%, ainsi l’apparition d’une couleur jaune–verte indique la présence des flavonoïdes. (Ramya et Ganesh, 2012).

Dosage :

Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires formés par deux cycles aromatiques reliés par 03 carbones, ainsi ils sont responsables de la couleur variée des fleurs et des fruits. Le dosage des flavonoïdes est effectué selon la méthode de Djeridane et al., 2006 , à 1 ml d’échantillon est ajouté 1 ml de trichlorure d’aluminium (Al Cl3 à 2%), ainsi après incubation, l’intensité de la couleur jaune formée est mesurée à 430 nm.

Détermination des Tannins :

Les tannins sont des métabolites secondaires des plantes qui peuvent précipiter les protéines à partir de leur solution aqueuse (Bruneton, 2008). Le taux des tannins est déterminé par la méthode de Schandrel (1970). Ainsi pour la mise en évidence de la présence des tannins, à 1 ml d’échantillon est ajouté 10 ml d’eau distillée et 150 µl de trichlorure de fer (FeCl3 à 1% d’H2O). L’apparition d’une couleur verte ou bleu-noire confirme la présence des tannins catéchols ou des tannins galliques respectivement (Trease et Evans, 2002).

Détection des alcaloïdes :

La mise en évidence des alcaloïdes se fait par la méthode de Sofowora (1993). A 0,2 ml d’échantillon, 5 ml d’HCl (10%) sont ajoutés, ainsi après filtration 150 µl de réactif de Meyer sont additionnés. L’apparition d’un trouble ou d’un précipité confirme la présence des alcaloïdes dans l’échantillon.

Détection des résines :

La mise en évidence des résines est réalisée par la méthode de Al- Balany (2004) dont 10 ml
d’échantillon est mélangé avec 20 ml d’HCl (4%), ainsi l’apparition d’une turbidité indique la
présence des résines dans l’extrait.

Détection des stéroïdes :

200 mg de la poudre de la plante sont dissoutes dans 3 ml d’acide acétique, ainsi à ce mélange est ajouté quelque gouttes d’acide sulfurique (H2SO4). L’apparition d’une couleur violet-bleu ou vert- bleu indique la présence des stéroïdes (Sofowora, 1993).

Détection des saponins :

1 g de poudre de plante est dissoute dans 10 ml d’eau distillée, ainsi le tout est mis à ébullition. A ce mélange 5 ml d’H2O distillée est ajouté puis agité pendant 5 minutes, la formation d’une mousse confirme la présence des saponins. (Sofowora, 1993).

Pouvoir antioxydant de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L :

Afin de déterminer le potentiel antioxydant de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L nous
avons utilisé trois types de tests comme suit :

Détermination de pouvoir réducteur :

Dans cet essai nous avons utilisé la technique de RAP (Reducing Antioxidant Power) selon la méthode décrite par Oyaizu (1986). Cette méthode est basée sur la capacité des polyphénols à réduire le fer ferrique Fe 3+ en fer ferreux Fe 2+ (la puissance de réduction est l’un des mécanismes antioxydants). Brièvement, à 1 ml de l’échantillon est ajouté 2,5 ml de tampon phosphate (0 ,2M ; pH= 6,6) et 2,5 ml de K3Fe (CN)6. Le mélange de la réaction est incubé 30 minutes à 50°C. Après incubation, 2,5 ml de TCA (10%) est ajouté suivit par une centrifugation à 4000 r.p.m pendant 10 minutes.
A 2,5 ml de surnageant récupéré est ajouté 2,5 ml d’eau distillée et 0,5 ml de FeCl3. L’intensité de la couleur développée est mesurée au spectrophotomètre à 700 nm. L’augmentation de l’absorbance dans le milieu réactionnel indique l’augmentation de la réduction de fer. L’acide ascorbique est utilisé comme contrôle positif. L’exploration des résultats se fait par une courbe d’absorbance en fonction de différentes concentrations utilisées de l’extrait de la plante étudiée.
Une augmentation de l’absorbance correspond à une augmentation du pouvoir réducteur de l’extrait testé.

Mesure de l’activité des antioxydants totaux :

L’activité des antioxydants totaux de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L a été déterminée selon la méthode décrite par Prieto et al, (1999). Brièvement, 300 µl de l’extrait aqueux sont mélangés avec 3 ml de solution réactionnelle (0,6 M d’acide sulfurique, 28 mM de phosphate de sodium et 4 mM de molybdate d’ammonium), le mélange est incubé à 95 °C pendant 90 minutes. L’absorbance des échantillons est mesurée à 695 nm, ainsi l’activité des antioxydants totaux est exprimée par le nombre équivalent d’acide ascorbique par gramme sec de la plante.

Test de piégeage de radical libre DPPH :

Le 1,1 – Diphenyl -2-PicrylHydrazyl (DPPH) est un radical libre de couleur violet qui donne une absorbance maximale à 517 nm ainsi lorsque un agent antioxydant réagit avec le DPPH, ce dernier est réduit en DPPH-H de couleur jaune et en conséquence l’absorbance diminue. Ainsi cette décoloration correspond au nombre des électrons capturés (Maataoui et al., 2006. Le test est réalisé selon la méthode de Sanchez –Moreno (1998). Brièvement, 50 µl de l’échantillon (à différentes concentrations) est mélangé avec 1,95 ml de solution méthanolique de DPPH (0,025 g /l). La lecture de l’absorbance se fait après 30 minutes à 517 nm, ainsi l’activité antioxydante de la plante est comparée avec celle de deux antioxydants de références : Acide ascorbique et le BHT (Butyled hydroxytoluéne).
Les résultats sont calculés par la formule suivante : Pourcentage d’inhibition de DPPH (%) = (Abs Contrôle – Abs Echantillon) / Abs Contrôle×100 Où : Abs Contrôle : absorbance de la solution méthanolique de DPPH sans échantillon. Abs Echantillon : absorbance de l’échantillon à tester.

Analyse qualitative et quantitative de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L par HPLC :

La chromatographie liquide à haute performance et à phase inverse est une technique de séparation dans la quel la phase mobile est un liquide et la phase stationnaire est une colonne emballée par des particules de C18. Ces particules possèdent un diamètre très fins ce qui nécessite de pomper la phase mobile à travers la colonne à haute pression. La pompe garde un débit bien précis pour que le temps de rétention de chaque pics peut être employé pour identifier  l’échantillon à tester tout en comparant les chromatogrammes des standards avec celui de l’échantillon (Rouessac et al., 2009) Figure 11.

Procédure :

L’extrait aqueux de Pimpinella anisum L a été analysé quantitativement et qualitativement par HPLC selon le protocole modifié de Sharma et al, (2010). 20 µl de l’extrait est injecté dans la colonne inverse C 18. Ainsi la phase mobile est constituée d’eau et de méthanol (30:70) qui s’écoule avec un débit de 0,7 ml /min. La détection se fait à 280 nm par un détecteur UVVisible. L’anéthol est utilisé comme standard.

Analyse de Pimpinella anisum L par spectre Infra-Rouge (FTIR) :

Le spectromètre infra rouge à transformée de Fourier (FTIR, alpha Bruker équipée d’une ATR Diamant, ATR : Attenuated Total Reflectance) a été utilisé pour réaliser l’analyse structurale de Pimpinella anisum L ; au niveau de laboratoire de chimie des polymères, Université d’Oran 1 (Ahmed Benbella, Algérie).

Modèle expérimental :

Dans cette étude le modèle animal utilisé est le rat blanc souche Wistar (Rattus norvigicus), des femelles et des mâles pesants entre 250 à 300 g. Les animaux sont maintenus à l’animalerie de Biologie (Université d’Oran 1). Le régime alimentaire administré au rats est celui de l’ONAB (Office national d’alimentation de bétails) qui est constitué de : 15% de protéines brutes, 14% d’humidité, 2,5% de matière grasse, 10% de cendres brutes, vitamine A, E et D 3 (les rats reçoivent la nourriture ad libitum). Après 06 jours de cohabitation, les mâles sont séparés et les femelles commencent à recevoir l’acétate de Plomb (Pb) dans l’eau de boisson.

Table des matières

Introduction 
Chapitre I : Revue Bibliographique 
Le plomb
Propriétés physico-chimiques du Plomb
Usage de plomb
Source d’exposition au plomb
Toxicocénitique du plomb
Toxicité du plomb
Intoxication aigue
Intoxication chronique
Effet du plomb sur le système nerveux
Aspect anatomo-histologique de l’imprégnation cérébrale par le plomb
Aspect neurobiologique de l’exposition au plomb : mécanismes moléculaires de neurotoxicité
Plomb et stress oxydatif
Relation entre Plomb, radicaux libres et dommages cérébraux
Plomb et neurotransmission
Effet du plomb sur le système monoaminregique et dopaminergique
Effets du plomb sur le système cholinergique
Effets du plomb sur le système glutamatergique et GABA ergique
Anis vert (Pimpinella anisum L)
Description et taxonomie
Etude phytochimique de Pimpinella anisum L
Usage d’anis vert
Propriétés thérapeutiques d’anis vert
Activités Biologiques de Pimpinella anisum L
L’effet bénéfique de Pimpinella anisum L sur le système nerveux
Toxicité de Pimpinella anisum L
Chapitre II : Matériels et Méthodes 
Matériel végétal   Choix de la méthode d’extraction
Préparation de l’extrait aqueux (E .A.P) de Pimpinella anisum L (Anis vert)
Etude phytochimique de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L
Détermination des composés phénoliques
Détermination des flavonoïdes
Détermination des Tannins
Détection des alcaloïdes
Détection des résines
Détection des stéroïdes
Détection des saponins
Détermination de pouvoir réducteur
Mesure de l’activité des antioxydants totaux
Test de piégeage de radical libre DPPH
Analyse qualitative et quantitative de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L par HPLC
Analyse de Pimpinella anisum L par spectre Infra-Rouge (FTIR)
Modèle expérimental
Induction de l’intoxication
Traitements des rats
Test de Champ Ouvert (Open field test)
Epreuve de la nage Forcée (Forced swimming test)
Détermination de Poids corporel et cérébral
Sacrifice
Dosage de la Plombémie
Préparation de l’homogénat tissulaire
Détermination de la peroxydation lipidique (TBARS)
Dosage des Hydroperoxydes
Dosage des marqueurs de stress oxydatif
Antioxydants totaux
Catalase
Superoxyde dismutase (SOD)
Glutathion S –Transférase (GST)
Dosage biochimiques
Dosage de glucose
Dosage de la Phosphatase alcaline (PAL)
Dosage de Phosphatase acide (PAC)
Etude Histologique de cortex cérébral et cervelet
Fixation
Inclusion
Coupe et Coloration
Etude statistique
Déroulement de l’analyse statistique
Chapitre III : Résultats  
Etudes phytochimiques de l’Extrait aqueux de Pimpinella anisum L (E .A.P)
Résultats qualitatifs
Résultats quantitatifs
Pouvoir Réducteur (Fe 3+ en Fe 2+)
Activité des antioxydants totaux
Test de Piégeage de radical libre DPPH
Analyse Qualitative et Quantitative de l’extrait aqueux de Pimpinella anisum L par HPLC
Analyse de l’extrait aqueux de P.anisum L., par le spectromètre infra-rouge à transformée de Fourier (FTIR)
Effet de Plomb sur la progéniture
Poids corporel et cérébral
Test de Champ Ouvert (Open Field)
Test de la nage forcée
Dosage de Plomb (Pb) dans le sang
Peroxydation lipidique
Taux des Hydroperoxydes
Les antioxydants totaux
Catalase
Superoxyde dismutase (SOD)  Glutathion S- Transférase (GST)
Glutathion réduit (GSH)
Dosages Biochimiques
Etude histologique
Cortex cérébral
Cervelet
Chapitre IV : Discussion 
Conclusion  
Références Bibliographiques
Annexes
Travaux Scientifiques
Publications

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