Plasmas froids à la pression atmosphérique et applications biomédicales

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La thérapie photodynamique

La thérapie photodynamique (PDT) dite aussi photochimiothérapie fonctionne à partir de deux composants non toxiques. Le premier est une substance chimique photosensibili-sante qui doit dans un premier temps atteindre les cellules cancéreuses avant d’être activée. Le photosensibilisant doit dans l’idéal être non toxique et ne pas posséder d’activité thé-rapeutique propre. Le second composant est une source lumineuse dont la longueur d’onde correspond exactement à l’excitation du photosensibilisant. Cette lumière peut être trans-portée jusqu’à la zone de traitement par voie endoscopique ce qui rend le traitement peu invasif. L’irradiation interne de la zone à traiter permet de limiter également la détérioration des cellules saines dans le corps.
L’excitation du photosensibilisant va conduire à deux types de réactions photochimiques majeures. La première consiste à une oxydoréduction des molécules biologiques lors du retour à l’état fondamental du photosensibilisant. Dans ce cas, diﬀérent radicaux vont être générés conduisant à une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules notamment le peroxyde d’hydrogène (H2O2), l’anion superoxyde (O•2−) et le radical hydroxyle (•OH). La seconde réaction est le transfert d’énergie sur l’oxygène moléculaire représenté figure 1.3.2. Ce transfert permet la formation de l’oxygène singulet excité (1O2) dont la toxicité est importante dans son environnement proche [68]. Cette molécule a une durée de vie très courte dans les milieux organiques (inférieure à 40 nanosecondes [69]) ce qui correspond à un rayon d’action d’environ 20 nn [69]. Dans les deux cas la présence d’oxygène dans les tissus est essentielle pour la production de ROS.
L’action de destruction des tumeurs par photochimiothérapie est contrôlée par trois prin-cipaux mécanismes pouvant interagir entre-eux [70] :
— Action directe : production de ROS et d’oxygène singulet à l’intérieur des cellules cancéreuses induisant d’importants dommages à l’ensemble des organites présents dans le cytoplasme mais également aux diﬀérentes membranes. En fonction du type et de la sévérité des dommages les processus de mort peuvent être l’apoptose, la nécrose ou l’autophagie. La présence d’oxygène mais également de photosensibilisant en quantité suﬃsante dans les cellules est primordiale pour une bonne eﬃcacité du traitement. Des recherches ont montré que la distribution en photosensibilisant dans les cellules est inversement proportionnelle à la distance séparant les cellules du plus proche système vasculaire [71] ;
— Action indirecte : destruction de la vascularisation tumorale. La thérapie photodynamique induit des dommages vasculaires dus à une vasoconstriction immédiate des vaisseaux suivie quelques heures plus tard d’un collapsus [72]. Sans aﬄux sanguin, les cellules cancéreuses passent alors en hypoxie et en anoxie avant de mourir [73] ;
— Action indirecte : Réponse inflammatoire induite par PDT. Suite à un traitement photodynamique des infiltrations de lymphocytes, leucocytes et macrophages ont été observées dans les tissus traités [74, 75]. En comparant l’eﬀet du traitement sur des souris immunocompétentes et immunodéprimées, Korbelik et al. ont constaté un eﬀet immédiat similaire pour les deux populations de souris mais un eﬀet à long terme en défaveur des souris immunodéprimées avec une reprise tumorale [74, 75].

La radiothérapie

La radiothérapie (RT) est une stratégie thérapeutique impliquant l’utilisation de radia-tions pour détruire des cellules cancéreuses. Cette stratégie est l’une des plus anciennes et l’une des plus utilisées en complément de la chirurgie. On définit le Transfert d’Éner-gie Linéaire (LET) pour caractériser la dose, c’est-à-dire la quantité d’énergie que reçoit une cible. L’augmentation de cette énergie se traduit par une augmentation des dommages induits par ces radiations. Le LET décrit également la capacité de pénétration des rayon-nements dans les tissus humains. Les radiations utilisées sont de toutes sortes : rayons X, gamma, radiations avec protons, neutrons, électrons, ions carbone ….
Il existe deux catégories de radiothérapie : la radiothérapie interne et la radiothérapie externe. La radiothérapie externe (ou trans-cutanée) utilise une source de radiation (géné-ralement gamma) placée à l’extérieur du patient. La source utilisée était anciennement un télécobalt à base de cobalt 60. Plus récemment les accélérateurs linéaires de particules se sont imposés. Les rayonnements émis par la source sont dirigés sur le patient dont ils traversent la peau afin d’atteindre la tumeur où ils sont focalisés. Le principal eﬀet secondaire de la radiothérapie est l’irradiation de cellules et de tissus sains. Afin de limiter cela, de nouvelles technologies dite de radiothérapies conformationnelles 3D permettent de faire correspondre le plus précisément possible le volume de la tumeur et la distribution des radiations sur le patient. Nombre d’examen médicaux sont réalisés (scanners, IRM…) dans le but d’obtenir une image en 3D la plus fidèle possible de la tumeur mais également des organes sains qui lui sont proches. Ces données permettent ainsi de réaliser un traitement plus sécurisé pour le patient tout en réduisant l’exposition des tissus sains aux radiations. Il en résulte un taux de survie beaucoup plus élevé qu’avec une méthode conventionnelle [76].
A partir d’une démarche similaire, une nouvelle stratégie a été développée : la RT stéréo-taxique. Pour cette technique il est impératif d’avoir la représentation en 3D de la tumeur et des organes proches. Les radiations gamma ne sont plus émises par une seule source mais par 201 (ou 192 suivant la date de fabrication) sources de cobalt 60 de plus basse intensité et réparties autour du patient. Un logiciel optimise l’orientation et la focalisation de chaque source afin d’adapter la zone irradiée à la morphologie de la tumeur. Ainsi, les zones saines proches de la tumeur ne reçoivent que peu de radiations alors que la tumeur reçoit une dose extrêmement importante. On peut observer une représentation de ce mode de traitement et l’estimation de la dose reçue sur la figure 1.3.3. On estime ainsi que la zone de focali-sation des radiations reçoit une dose environ mille fois supérieure à la dose reçue par les cellules saines alentours. Cette technique est particulièrement indiquée pour le traitement de tumeurs à risques où la chirurgie et les autres modes de radiothérapie sont trop risqués ce qui est notamment le cas des tumeurs sur la moelle épinière [77].
Le second mode de traitement, dit interne, consiste à utiliser une source de rayonnement (généralement une source radioactive) à l’intérieur du patient ou à proximité immédiate des cellules cancéreuses. La méthode la plus couramment utilisée est la Curiethérapie. Diﬀé-rentes sources radioactives sont utilisées dont : l’iridium 192, l’iode 125 et le césium 137. L’implantation de ces sources se fait sous la forme de billes et de petits fils pour une durée limitée (dans le cas de traitements à forte dose) ou permanente (traitement à bas débit de dose) dans le corps du patient.
Les radiations ionisantes vont permettre un certain nombre d’interactions avec les atomes des milieux visés. Ainsi par transfert d’énergie et même par ionisation, les molécules irradiées vont induire des dommages à l’ADN des cellules et altérer les protéines de leur environne-ment. La cellule étant composée principalement d’eau, la génération de radicaux libres par radiation ionisante va conduire in fine à des dommages importants pour la cellule. On peut donc facilement comprendre que la présence d’oxygène est importante pour la génération des radicaux oxygénés utilisés par la radiothérapie pour le traitement des cellules cancéreuses.

Caractéristiques des plasmas froids à la pression atmosphérique pour des applications biomédicales

Le terme plasma regroupe l’ensemble des gaz en partie ou en totalité ionisés. Pour pouvoir réaliser une classification plus précise, nous disposons de nombreux critères :
— Le degré d’ionisation α (Eq2.1.1) par exemple compare la concentration des électrons libres (ne : nombre d’électrons libres par unité de volume) par rapport à celle des éléments neutres (n0). La génération de ces porteurs de charges électriques à partir d’un gaz composé uniquement d’éléments neutres électriquement demande une énergie suﬃsamment importante pour pouvoir modifier la structure électronique des espèces produisant ainsi des espèces excitées puis des espèces ionisées. Le degré d’ionisation peut ainsi varier de 10−8 pour des gaz très faiblement ionisés comme le plasma inter-stellaire jusqu’à 1 pour un gaz complètement ionisé rencontré dans le cœur des étoiles ou les plasmas de fusion nucléaire. Les plasmas utilisés pour des applications médicales à la pression atmosphérique ont un degré d’ionisation généralement compris entre 10−7
et 10−4. ne α = ne + n0 (2.1.1)
— La température des plasmas est un critère complexe dans le domaine des plasmas. En eﬀet, dans un plasma, il peut exister une seule et unique température pour toutes les espèces 1 composant ce dernier comme il peut en exister une multitude. Suivant la nature des transferts d’énergie entre les particules du plasma, chacune des espèces peut avoir une distribution d’énergie (à laquelle on associe une température) qui lui est propre ou qui est commune avec les autres espèces. Ainsi on classe généralement les plasmas en deux grandes catégories : les plasmas à l’équilibre thermodynamique ou les plasmas hors équilibre thermodynamique. Dans le cas de l’équilibre thermodynamique les particules possèdent une température identique T = Te = Ti = Tn (avec pour indice e correspondant aux électrons, i aux ions et n pour les neutres). A l’inverse, pour des plasmas hors équilibre thermodynamique, les électrons ont généralement une énergie moyenne (et donc une température) beaucoup plus élevée que celle des autres espèces du plasma (ions et neutres). Ces plasmas, généralement faiblement ionisés, présentent un intérêt certain pour les applications biomédicales car leur température apparente est proche de la température ambiante. Leur dénomination la plus courante est « plasmas froids ».
— La pression n’est pas à proprement dit une propriété du plasma mais est au contraire un paramètre qui va conditionner en partie le type de plasma obtenu. En eﬀet, à basse pression les collisions sont relativement peu nombreuses et le transfert de quantité de mouvement entre les électrons et les atomes reste faible. Ainsi le plasma n’est pas à l’équilibre thermodynamique avec une température des électrons bien supérieure (d’un à deux ordres de grandeur) par rapport à la température des espèces lourdes. En augmentant la pression, le libre parcours moyen entre les particules du plasma diminue, le nombre de collisions augmente et les diﬀérentes températures se rapprochent faisant tendre le plasma vers l’équilibre thermodynamique.
Alors que la température élevée que l’on peut obtenir avec un plasma à l’équilibre thermodynamique est essentielle pour un grand nombre d’applications, la plupart (pour ne pas dire la totalité) des applications biomédicales nécessite au contraire des températures rela-tivement basses pour ne pas porter atteinte aux tissus biologiques ou au matériel médical exposés au plasma. Cette contrainte de température va de paire avec la pression. En eﬀet, si un plasma basse pression peut être utilisé pour la stérilisation de matériel médical, il n’est pas envisageable de soumettre un patient à la basse pression. C’est pourquoi de nombreuses techniques ont été développées pour générer des plasmas froids à la pression atmosphérique. Nous dresserons dans la suite de ce chapitre une liste non exhaustive des sources plasmas utilisées pour des applications biomédicales à la pression atmosphérique en mettant en avant les sources de plasma qui ont été utilisées au cours de ces travaux. Nous aborderons ensuite l’action indirecte des plasmas froids à la pression atmosphérique sur le vivant.

Dispositifs générant des plasmas froids à la pression atmosphérique pour des applications biomédicales

Pour les applications biomédicales à la pression atmosphérique, on recense quatre grandes familles de dispositifs plasma : Les décharges couronnes, les micro-décharges à cathode creuse, les décharges à barrière diélectrique (DBD) et les jets de plasma froid. Ces dispositifs et leurs applications biomédicales vont être détaillés dans la suite de cette section.

Décharge couronne

L’eﬀet couronne ou eﬀet corona correspond à une décharge partielle (sans passage à l’arc) dans un fluide neutre, généralement de l’air, où règne un fort champ électrique. Ce champ électrique peut être induit entre deux électrodes reliées à un générateur de haute tension continue, alternative ou pulsée. L’eﬀet couronne se produit avec des électrodes dissymé-triques. On distingue les configurations, pointe-plan, fil-cylindre et fil-plan (voir fig.2.2.1). Si l’électrode ayant le rayon de courbure le plus faible (la pointe ou le fil) est alimentée avec une tension continue positive par rapport à l’autre électrode, on parle de décharge couronne positive et de décharge couronne négative dans le cas contraire. Cette distinction est particulièrement importante car les phénomènes induits lors de la décharge diﬀèrent significativement tant par leur nature que par la quantité des espèces chimique formées par la décharge. Par exemple, une décharge couronne négative produit une concentration beaucoup plus importante d’ozone qu’une décharge couronne positive. Plus de précisions pourront être trouvées dans les références suivantes [78, 79].
L’inconvénient majeur des décharges couronnes continues est le risque de passage à l’arc entre les deux électrodes si la tension appliquée entre ces dernières est trop importante 2. Il en résulte une forte détérioration des pointes dans les configurations pointe-plan, une contamination de l’environnement à proximité de la pointe et un échauﬀement du gaz qui peut devenir significatif. Afin de réduire le risque d’apparition de ce phénomène et pour produire davantage d’espèces chimiques, on alimente les électrodes avec un générateur haute tension alternative avec une fréquence de quelques kHz généralement ou mieux encore, en utilisant un générateur de tension impulsionnelle dont la durée d’impulsion est choisie de sorte que la tension inter-électrode repasse à zéro avant l’apparition d’un arc électrique inter-électrode.
Les décharges corona sont utilisées depuis plus de 100 ans pour générer de l’ozone. On les retrouve dans des dispositifs pour purifier l’eau ou les circuits de ventilation. Concer-nant les applications médicales des décharges corona, de nombreux travaux ont été menés avec diﬀérents types de décharges couronne. On peut citer par exemple des travaux sur la stérilisation de surface par le traitement de bactéries [80, 81, 82, 83] et de biofilms bacté-riens [84, 85, 86, 87] ou bien encore des expériences sur des cellules cancéreuses in vitro [88].
Figure 2.2.1 – Photographie d’une décharge corona multi-pointes pulsée au laboratoire LAPLACE. Conditions expérimentales : tension d’alimentation 8kV, durée d’impulsion 40µs, fréquence de répétition 100Hz, distance anode/cathode 8mm et rayon de courbure des pointes 25µm, 14 pointes disposées en deux rangées de 7 pointes. D’après[6]

Micro décharges à cathode creuse

La tension de claquage est une caractéristique propre à chaque gaz dépendant d’un pro-duit pression×distance. Cette relation est généralement connue sous le nom de courbe de Paschen dont un exemple est donné figure 2.2.2 pour l’air à la pression atmosphérique.
Contrairement aux prédictions de cette loi, la tension de claquage n’augmente pas exponen-tiellement pour de très faibles distances inter-électrode. En eﬀet, Slade et al ont montré que, pour des distances inter-électrodes très faibles (globalement inférieure à 5 µm et à la pression atmosphérique), la tension de claquage est proportionnelle à la distance inter-électrode [7]. Il est donc possible de former des plasmas à la pression atmosphérique avec des tensions d’alimentations relativement basses en diminuant l’espace inter-électrodes. C’est le principe d’une catégorie de plasmas froids référencée sous le terme Micro Décharge à Cathode Creuse (Micro Hollow Cathode Discharges) dont un dispositif est représenté figure 2.2.3. Avec ces dispositifs, il est possible d’obtenir des plasmas froids d’un rayon de quelques centaines de micromètres dans des gaz très variés parmi lesquels l’argon, l’air, le néon et xénon sont les plus étudiés avec ce type de dispositif [89].
L’inconvénient majeur de ces dispositifs pour les applications biomédicales concerne les dimensions géométriques limitées des dispositifs qui imposent une multiplication des cellules élémentaires afin d’obtenir une surface suﬃsante de traitement [90]. La taille réduite de plasma oblige également à prendre en compte le déplacement du dispositif lors du traitement pour obtenir un résultat homogène.
Ce type de dispositif a été utilisé dans des applications biomédicales traitant particuliè-rement de l’inactivation de bactéries [91, 92, 93] ou du blanchiment des dents [94, 95].

Décharges à barrière diélectrique

La contrainte majeure dans la conception d’un dispositif de plasma froid est d’éviter le passage à un régime d’arc électrique. Une des solutions les plus utilisées consiste à interca-ler au moins une barrière diélectrique entre les électrodes du dispositif. Lorsque le champ électrique induit par une diﬀérence de potentiel électrique imposée entre les électrodes est suﬃsamment élevé on assiste à la formation d’un canal conducteur d’une électrode vers l’autre à travers le gaz. Alors que le déplacement des charges électriques dans le gaz produit une avalanche électronique, un diélectrique, placé entre les deux électrodes, accumule les charges qui atteignent sa surface. Il en résulte un champ électrique qui, étant opposé au champ géométrique, empêche l’apparition de l’arc électrique et conduit à l’extinction de la décharge. La durée de vie du canal conducteur étant un phénomène estimé à une centaine de nanosecondes, il n’y a pas suﬃsamment de collisions entre les espèces chargées et les neutres pour générer un échauﬀement significatif du gaz [96]. En raison du caractère tran-sitoire de ce type de décharge, il est indispensable d’utiliser une alimentation alternative pour permettre la génération successive de décharges.
Les dispositifs fonctionnant sur le principe des décharges à barrière diélectrique ont gé-néralement une configuration plan-plan ou cylindre-cylindre (voir figure 2.2.4.a) avec au minimum un diélectrique solide recouvrant l’une des électrodes. La configuration plan-plan est privilégiée dans le cas de traitement de surface alors que la configuration cylindrique est plus adaptée aux traitements d’eﬄuents gazeux. Les dimensions caractéristiques du dispo-sitif DBD sont conditionnées par le produit pression × distance. Ce type de décharge peut facilement avoir lieu à pression atmosphérique avec une distance inter-électrode générale-ment de l’ordre du millimètre au centimètre en fonction du type de gaz et de la source de tension utilisés.
Le principal inconvénient de ce type de dispositif est lié au caractère filamentaire de ces décharges produisant par conséquent des inhomogénéités de traitement. Cependant il est possible de générer des plasmas homogènes ou diﬀus dans l’espace inter-électrodes dans cer-taines conditions [97, 98]. Il est également possible de remplacer la contre électrode reliée à la masse de l’alimentation par un corps humain ou tout support suﬃsamment conducteur. Ce type de dispositif se retrouve sous le terme FE-DBD dans la littérature pour « Floa-ting Electrode – Dielectric Barrier Discharge ». Un exemple de ce dispositif est donné figure 2.2.4.b avec un support biologique conducteur faisant oﬃce de contre électrode. L’utilisation d’un tel dispositif oﬀre de nombreux avantages. Le premier est de pouvoir placer l’élément à traiter directement au contact du plasma. Ceci permet un traitement en profitant d’un champ électrique important et un flux de particules chargées pouvant apporter une contri-bution significative lors d’un traitement biomédical. Le second intérêt est que, dans ce type de décharge, l’énergie dissipée est importante ce qui entraîne une forte réactivité chimique. C’est la raison pour laquelle ce type de décharge a été étudié pour la première fois par la société Siemens au milieu du XIX`emesiècle afin d’augmenter la synthèse de l’ozone [99].
Les applications biomédicales des décharges à barrière diélectrique sont essentiellement orientées sur le traitement de graines avec un intérêt pour la décontamination et un autre pour favoriser la germination [100, 101]. Les DBD à électrodes flottantes sont quand à elles plus adaptées pour le traitement de la peau [102, 103, 104].

Les jets de plasma

Il existe de très nombreuses configurations de jets de plasma avec ou sans barrière diélec-trique actuellement en développement dans les laboratoires. Nous allons en présenter deux types : le jet DBD et le jet surfatron.

Jets de plasma DBD

Ce jet de plasma sera utilisé dans les chapitres 6 et 7 pour des applications de traitement de cellules cancéreuses. De plus, le chapitre 7 traitera du développement d’un jet de plasma fonctionnant avec de l’argon et une configuration d’électrode diﬀérente.
Un exemple de jet plasma DBD est montré sur la figure 2.2.5. La configuration de ce jet est relativement commune (voir par exemple [105, 106]). Des électrodes en aluminium sont enroulées autour d’un tube de quartz de petit diamètre (2 mm de diamètre intérieur et diamètre extérieur de 4 mm). Elles sont séparées par un espace de 10 mm. De l’hélium est injecté dans le tube de quartz avec un débit de quelques litres.min−1. Des impulsions carrées de haute tension sont appliquées entre les électrodes avec une intensité, une fréquence de ré-pétition, et un rapport cyclique ajustables. L’alimentation qui permet d’obtenir des tensions pulsées utilise un circuit push-pull approprié alimenté par un générateur de haute tension continue. Les caractéristiques typiques du signal à haute tension sont les suivantes : temps de montée et de descente de 80 ns à plusieurs centaines de nanosecondes, tension continue allant jusqu’à 10 kV, fréquence de répétition de 1 Hz à 9.69 kHz et largeur d’impulsion de 250 ns à 1.75 s.
Ce genre de dispositif présente l’avantage d’une flexibilité importante permettant le trai-tement de tissus ou de surfaces. En eﬀet, la géométrie des dispositifs peut être adaptée aux diﬀérentes applications. On peut citer par exemple la combinaison de plusieurs jets plasma DBD pour augmenter la surface de traitement et également certaines propriétés [107, 108] ainsi que des dispositifs générant un rideau de plasma pour le traitement de surface [109].
Un second avantage est que, contrairement aux DBD classiques de type plan-plan, la pro-pagation du plasma en dehors du dispositif va provoquer l’excitation des molécules contenues dans l’air dans une zone que l’on appelle la plume plasma. Ainsi, une faible quantité de gaz plasmagène est suﬃsante pour déclencher des réactions chimiques dans l’air menant à la for-mation d’une quantité significative d’espèces oxydantes particulièrement intéressantes dans un contexte biomédical.

Jets de plasma Surfatron

Un dispositif Surfatron [110, 111, 112] génère des ondes de surface (généralement dans le domaine micro-onde et plus particulièrement à 2.45 GHz) qui sont capables d’initier une décharge dans un gaz circulant à l’intérieur d’un tube en matériau diélectrique (par exemple du quartz) comme indiqué sur la figure 2.2.6. À la pression atmosphérique, le plasma ne remplit pas toute la section transversale du tube de quartz (voir la figure 2.2.7.a).
L’inconvénient majeur concernant ces dispositifs est la température du jet de plasma qui est trop élevée pour traiter sans dommages des supports thermosensibles. Pour parer à ce problème, on fait circuler de l’air comprimé autour du tube de quartz 2.2.6. Cela présente l’avantage de refroidir le tube et de créer des turbulences au niveau de la sortie du tube où le jet de plasma émerge dans l’air ambiant. Ces turbulences, en se mélangeant avec le jet de plasma, permettent d’abaisser significativement la température apparente du jet de plasma. En eﬀet, cette méthode permet de maintenir la température apparente du jet au dessous de 325 K au voisinage de la sortie du tube de quartz alors qu’en l’absence de refroidissement, le jet émerge dans l’air avec une température avoisinant les 1000 K [11]. Il est à noter également que la structure du jet de plasma est modifiée avec le refroidissement par air comprimé. On assiste alors à l’apparition aléatoire de structures filamenteuses comme observées figure 2.2.7.b.
Les dispositifs Surfatron sont particulièrement flexibles et permettent de générer des jets de plasma (ou des flux d’espèces chimiques créées par plasma) à base de mélanges gazeux très variés et sur une très large plage de pression allant de quelques dixièmes de mbar jusqu’à plusieurs bars. La géométrie du dispositif est également modulable. En eﬀet, bien que la plupart des dispositifs Surfatron utilisent un tube de quelques mm de diamètre, il est possible de générer, dans des conditions particulières, un plasma avec un Surfatron dont le tube a un diamètre de 25 cm.
Même si la majorité des applications biomédicales des jets de plasma Surfatron a été réalisée à basse pression (cf. par exemple [113]), des essais à la pression atmosphérique ont donné des résultats intéressants, en particuliers en ce qui concerne la décontamination de bactéries par plasma [10, 114, 115].

Applications biomédicales des jets de plasma

Les jets de plasma DBD fonctionnant avec de l’hélium et de l’argon comme gaz por-teur sont, dans la littérature, les dispositifs plasma les plus utilisés pour les traitements biomédicaux. On peut citer de manière non exhaustive :
— La décontamination, traitement de bactérie, stérilisation [10, 54, 116, 117] ;
— Le blanchiment ou les soins des dents [106, 118, 119, 120, 121] ;
— La coagulation du sang [102, 122, 123, 124] ;
— Le traitement des ulcères et des plaies chroniques [125, 126, 127, 128] ;
— La modification de surface de matériaux biomédicaux [129, 130, 131] ;
— Le traitement de cellules cancéreuses [132, 133, 134] ;
— Le traitement de fruits et légumes pour augmenter la durée de conservation [135, 136, 137] ;
— Le traitement de graines pour favoriser la germination et la productivité [138, 139, 140].

Action du plasma sur le vivant

De nombreux processus physiques et chimiques interviennent dans un plasma, en par-ticuliers lorsque ce dernier est en contact direct avec des cellules vivantes ou indirect par l’intermédiaire d’un liquide activé par plasma. Dans cette partie, nous avons recensé les principaux mécanismes dont l’activité sur le vivant est (ou est supposée) significative. Ces diﬀérents mécanismes ont une part très variable d’un dispositif plasma à un autre dans l’eﬃcacité du traitement réalisé. En eﬀet, la nature et la quantité des espèces produites par un plasma dépendent énormément des conditions opératoires ce qui rend particulièrement délicate la comparaison des diﬀérents jets de plasma. Nous écarterons d’emblée le rôle direct de l’élévation de la température due au plasma car les jets de plasma froids utilisés pour des applications biomédicales n’induisent pas une augmentation significative de la tempéra-ture des objets traités. Toutefois, l’eﬃcacité d’un traitement plasma peut être améliorée en augmentant la température de l’échantillon exposé au plasma [113].

Eﬀet du champ électrique

Le mouvement des espèces chargées dans le plasma ainsi que le champ géométrique des dispositifs peuvent conduire à un champ électrique localement important au niveau d’un support biologique exposé au plasma. De nombreux groupes de recherche suggèrent par conséquent que l’eﬀet du champ électrique généré par un plasma sur les cellules et les bactéries n’est pas négligeable [141] et pourrait même être, dans certaines configurations particulières, le vecteur principal de stérilisation [142, 143]. À partir de résultats extraits des travaux de Laroussi et al [143], Mendis et al proposent un scénario connu sous le nom de disruption électrostatique de la membrane cellulaire [142]. Ce phénomène se produit lors de l’accumulation de charges électriques à la surface d’une cellule à un niveau tel que la résistance à la traction de la membrane n’est plus assez importante pour garantir l’intégrité membranaire. L’inégalité suivante est proposée comme condition nécessaire à la disruption de la membrane cellulaire : | Φ(V) |≥ 0.2 q (2.3.1) r(µm) Δ(µm) FT(dynes.cm−2)
Cette formule traduit le fait que le potentiel Φ a la surface de la cellule dépend du produit du rayon de courbure local r de la membrane cellulaire, de l’épaisseur de la membrane Δ et de la force de traction de la membrane FT. De nombreuses simulations ont montré que le potentiel à la surface des cellules peut être suﬃsamment élevé pour surpasser la résistance à la traction de la membrane [141]. Cette formule reste cependant diﬃcile à utiliser car la force de traction de la membrane n’est pas une donnée connue à ce jour. Cependant, compte tenu de l’estimation de ce facteur par Mendis et al [142], il est envisageable que le champ électrique induit un eﬀet au niveau cellulaire notamment sur les cellules Gram négatif dont la membrane possède des irrégularités diminuant ainsi le rayon de courbure local.
Si le champ électrique peut éventuellement produire un eﬀet lors de l’exposition directe de supports biologiques au plasma, sa contribution est discutable dans le cas de traitements indirects au cours desquels les cellules ne sont pas exposées au plasma ce qui, nous le verrons plus tard, est le cas des applications biomédicales réalisées lors de cette thèse.

Eﬀet du rayonnement ultraviolet

Le rayonnement UV-C (190-280 nm) est particulièrement eﬃcace pour induire des dom-mages à l’ADN, ce dernier étant très absorbant sur cette plage de longueurs d’ondes. C’est donc une solution intéressante pour inhiber le développement d’une infection bactérienne lors d’une opération chirurgicale ou d’une préparation d’échantillons microbiologiques [144, 145]. Fort de ce constat, l’entreprise Steril-Aire Inc. a développé un dispositif à base de rayonne-ment UV-C permettant de réduire très fortement la contamination par des micro-organismes (biofilm gram-positif et négatif, champignons) des installations de chauﬀage, ventilation et climatisation. Jusqu’à très récemment, on ne trouvait pratiquement que des lampes conte-nant du mercure (dont une transition radiative se trouve à 253 nm) pour générer des rayon-nements UV-C. Ces dernières sont désormais concurrencées par l’arrivée de la dernière génération de LED UV-C qui comble toutes les lacunes qui empêchaient les précédentes générations de LED de s’imposer sur ce secteur.
Un autre moyen de produire un rayonnement UV-C est de générer un plasma. Plus pré-cisément, il s’agit d’un plasma dans lequel se trouvent des molécules excitées de monoxyde d’azote (NO) qui produisent un spectre caractéristique dans l’UV-C. A la pression atmosphé-rique, les plasmas à base d’argon sont généralement plus eﬃcaces que ceux à base d’hélium ou d’air pour produire un rayonnement UV-C à partir des impuretés du gaz plasmagène et/ou du mélange de ce dernier avec l’air ambiant.
Lors d’expériences préliminaires, nous avons déterminé qu’un jet de plasma Surfatron à base d’argon projeté dans l’air ambiant était capable de générer une irradiance UV-C de 46 µW.cm−2 à une distance de 17 mm de la sortie du tube amenant le gaz plasmagène. Cela correspond, pour une durée de traitement de 300 secondes, à un niveau d’exposition de 14 mJ.cm−2 [10]. Ce niveau d’exposition UV-C étant, d’après les travaux de Guo et al, capable d’induire 5 log de diminution relative de la population (0.001% des bactéries toujours viables après traitement) de la souche sauvage de la bactérie E. coli à l’état planc-tonique [146]. Toutefois lors de nos travaux, la réduction bactérienne observée n’était que d’environ 1 log (10% de survie), la diﬀérence étant probablement imputable à la concentra-tion bactérienne initiale qui était était mille fois plus importante dans notre cas 3 [10]. Nous avons également constaté que la part de mortalité bactérienne induite uniquement par le rayonnement UV-C du jet Surfatron sur des bactéries E. coli était d’environ 84% dans nos conditions expérimentales [10].
L’eﬀet des radiations émises par le plasma n’est a priori envisageable que pour des expo-sitions directes de supports biologiques au plasma. Cependant, le rayonnement ultraviolet contribue à la production d’électrons germes dans le plasma et favorise également la pro-duction de certaines espèces chimiques très actives sur le vivant et à longue durée de vie comme c’est le cas par exemple de l’ozone.

Eﬀet des espèces réactives

Le plasma est une excellente source d’espèces réactives chargées électriquement (électrons, ions) ou neutres. Pour les applications biomédicales des plasmas, ces espèces neutres sont souvent classées en deux catégories : les espèces réactives oxygénées et les espèces réactives nitrogénées. Un exemple de concentrations des principales espèces réactives dans un plasma froid de type DBD est donné tableau 2.1 à partir des résultats de Kalghatgi et al [13]. La concentration de ces espèces réactives varie en fonction de la configuration du plasma mais la liste des espèces est quant à elle relativement commune dans les DBDs et les jets de plasmas à la pression atmosphérique. Ces espèces, présentent en phase gazeuse, sont connues pour produire des eﬀets importants sur les cellules du vivant. Les radicaux superoxyde et hydroxyle, l’oxygène singulet et l’oxyde nitrique font d’ailleurs partie des éléments clés de la thérapie photodynamique et de la radiothérapie pour le traitement du cancer (cf. chapitre 1).
Pour un traitement de supports biologiques en suspension dans un liquide, les espèces réactives du plasma vont se solubiliser et entraîner à leur tour la formation d’espèces se-condaires à la suite de réactions chimiques avec les composants du liquide traité. Il est également envisageable que les espèces produites par le plasma interagissent entre-elles une fois solubilisées. L’ensemble des produits issus de l’interaction entre le plasma et un liquide a une durée de vie limitée. On définit alors deux catégories que sont les espèces à courte durée de vie telles que les radicaux dont la durée de vie après l’arrêt du plasma ne dépasse généralement pas la seconde et les espèces à longue durée de vie telles que le peroxyde d’hydrogène, l’ozone et les nitrites/nitrates dont la durée de vie dans le liquide activé peut atteindre plusieurs jours (tab. 2.1).

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Table des matières

Contexte de l’étude: La biologie du cancer et méthodes de traitement
1 Physiopathologie du cancer et traitements
1.1 Le cancer en France
1.2 Caractéristiques des cellules tumorales
1.2.1 Développement des cellules tumorales
1.2.2 Caractéristiques des cellules tumorales
1.2.3 Définition, classification histologiques de la tumeur
1.3 Stratégies Thérapeutiques
1.3.1 La Résection
1.3.2 La chimiothérapie
1.3.3 La thérapie photodynamique
1.3.4 La radiothérapie
2 Plasmas froids à la pression atmosphérique et applications biomédicales
2.1 Caractéristiques des plasmas froids à la pression atmosphérique pour des applications biomédicales
2.2 Dispositifs générant des plasmas froids à la pression atmosphérique pour des applications biomédicales
2.2.1 Décharge couronne
2.2.2 Micro décharges à cathode creuse
2.2.3 Décharges à barrière diélectrique
2.2.4 Les jets de plasma
2.3 Action du plasma sur le vivant
2.3.1 Effet du champ électrique
2.3.2 Effet du rayonnement ultraviolet
2.3.3 Effet des espèces réactives
2.4 Bilan des applications biomédicales des plasmas froids
Matériels et méthodes
3 Supports biologiques et diagnostics
3.1 Caractéristiques des cellules
3.1.1 HCT 116: Cancer du colon
3.1.2 GM637: Fibroblaste
3.2 Méthode de culture
3.2.1 Culture cellulaire
3.2.2 Formation du sphéroïde pour les analyses in vitro
3.2.3 Formation des tumeurs pour les analyses in vivo
3.3 Diagnostics des sphéroïdes in vitro
3.3.1 Évaluation de l’efficacité du traitement plasma
3.3.2 Étape de fixation, découpe
3.3.3 Marquage immunofluorescent
3.3.4 Viabilité cellulaire
3.3.5 Perméabilisation cellulaire
3.3.6 Activation de l’apoptose
3.4 Diagnostics des tumeurs in vivo
3.4.1 Suivi de la croissance tumorale
3.4.2 Coupes histologiques
4 Détection et quantification des espèces générées par le plasma dans les milieux de culture
4.1 Diagnostic par résonance paramagnétique électronique
4.1.1 Effet Zeeman et interaction atome-molécule avec un champ magnétique
4.1.2 Spectromètre de résonance paramagnétique électronique
4.1.3 Analyse des spectres RPE
4.1.4 Méthode de piégeage d’un radical
4.2 Fluorométrie
4.2.1 Dosage du peroxyde d’hydrogène (H2O2)
4.3 Mesure d’absorbance pour le dosage des nitrates et nitrites
4.3.1 Dosage des nitrites et nitrates (NO2/NO3)
5 Caractérisation des jets de plasma froid
5.1 Outils de diagnostic optique
5.1.1 Le spectromètre
5.1.2 L’irradiance mètre UV-C
5.1.3 Caméra haute vitesse
5.2 Caractérisations optiques des jets de plasma
5.2.1 Estimation de l’irradiance UV-C
5.2.2 Estimation de la température apparente du jet de plasma
5.2.3 Température d’excitation
5.2.4 Densité électronique du plasma
5.2.5 Concentration d’oxygène atomique
5.2.6 Détermination de la longueur et de la vitesse de propagation du jet de plasma DBD
Résultats expérimentaux
6 Traitements du cancer colorectal : investigation in-vitro
6.1 Activation du milieu par jet plasma et traitement cellulaire
6.2 Analyse de l’éfficacité du PAM en fonction de la durée d’activation
6.3 Influence du temps de transfert sur les effets génotoxiques et cytotoxique du PAM
6.4 Relation entre taux de dommage à l’ADN observé et temps d’activation/temps
de transfert
6.5 Influence de la température de stockage du PAM
6.6 Rôle du peroxyde d’hydrogène (H2O2) dans les dommages à l’ADN
6.7 Évaluation de la concentration en peroxyde d’hydrogène dans le PAM après traitement plasma
6.8 Analyse de la sélectivité PAM
6.9 Viabilité cellulaire
6.10 Identification du processus de mort cellulaire induit par le PAM
6.11 Effet du PAM lors d’un traitement avec un temps contact cours
6.12 Conclusion
7 Interaction entre le jet de plasma DBD hélium et le milieu de culture
7.1 Radical hydroxyle (•OH) et anion superoxyde (O•− 2 )
7.1.1 Radical hydroxyle (•OH)
7.1.2 Présence de l’anion superoxyde (O•− 2 )
7.2 Peroxyde d’hydrogène (H2O2)
7.3 Oxygène singulet (1O2)
7.4 Oxyde nitrique (NO•)
7.5 Nitrite/nitrate (NO2/ NO3)
7.6 Radical hydrogène (H•)
7.7 Mécanismes d’interaction PAM/cellules cancéreuses
7.8 Conclusion
Développement et caractérisation d’un jet de plasma DBD Argon
8 Conception d’un jet de plasma d’argon
8.1 Configuration du générateur jet de plasma DBD d’argon
8.2 Distribution du champ électrique
8.3 Caractérisation électrique de la décharge
8.4 Caractérisation optique du jet de plasma
8.4.1 Identification des espèces radiatives
8.4.2 Analyses quantitatives basées sur l’émission du plasma
8.5 Longueur du jet de plasma et vitesse de la balle plasma
8.6 Traitement des sphéroïdes HCT
Conclusions et perspectives
Annexes
A Influence de la présence de sérum de veau dans le milieu activé par plasma sur les dommages à l’ADN
B Protocole de quantification de l’adenosine triphosphate dans le sphéroïde et le surnageant
Bibliographie