Soutenance mémoire
Simple préparation d’échantillons
À l’heure où les techniques de séparation et de détection viennent de rencontrer l’essor fulgurant de ces dernières années, l’analyste toxicologue concentre son énergie à l’amélioration de la préparation d’échantillons. L’évolution de l’instrumentation permet de réaliser des séparations chromatographiques rapides et efficaces couplées à une détection par spectrométrie de masse performante permettant une analyse spécifique et complexe.
Néanmoins, la complexité des échantillons biologiques à traiter concentre l’attention du toxicologue analyste sur les points suivants :
– l’utilisation de faibles quantités de matrices afin de réaliser un maximum d’analyse sur un même échantillon, particulièrement intéressant lorsque les quantités de prélèvements sont réduites ;
– l’amélioration de la sensibilité par l’utilisation de procédures d’extraction plus spécifiques comme les empreintes moléculaires ;
– la diminution des délais de rendu des résultats par l’utilisation par exemple de procédure de préparation d’échantillons « on line » ;
– la simplification des méthodes pouvant passer par l’uniformisation des méthodes de préparation, quelle que soit la matrice ;
– l’automatisation de la préparation d’échantillons ayant pour objectifs d’améliorer le rendement et de diminuer les erreurs manuelles.
Avant d’aborder les différentes méthodes de prétraitement des échantillons, il faut rappeler qu’il est tout de même possible d’analyser soit directement certains échantillons biologiques liquides (urine ou liquide cérébrospinal), soit des échantillons sanguins précipités. Les échantillons biologiques liquides sont des matrices qui en général contiennent de faibles concentrations en protéines et une simple dilution dans de l’eau dés ionisée peut suffire.
Cependant, les préparations d’échantillons nécessitent souvent de passer par des procédures d’extraction. À côté des prétraitements les plus simples (dilution, centrifugation) pour les matrices les moins chargées (urine) avant une étape d’extraction en extraction liquide-liquide (ELL) ou en extraction en phase solide (EPS), les matrices biologiques plus chargées en protéines (sang, humeur vitrée, liquide cérébrospinal) nécessitent avant l’étape d’extraction des étapes de prétraitement supplémentaires comme la précipitation des protéines.
De plus, les problèmes d’homogénéisation sur certains échantillons de tissus nécessitent une étape d’homogénéisation supplémentaire à l’aide d’un broyeur mécanique ou de ciseaux, suivie d’une étape de digestion enzymatique (trypsine ou peptidases), étapes souvent nécessaires avant le prétraitement et l’extraction. Enfin, pour des tissus putréfiés pouvant être obtenus en post mortem, l’échantillon peut être prétraité dans un bain à ultrasons et après centrifugation et/ou filtration, le surnageant pourra subir une étape d’extraction.
Techniques de prétraitement
Ces techniques regroupent l’ensemble des techniques réalisées avant l’analyse ou avant une technique d’extraction comme l’homogénéisation, la dilution, la centrifugation, l’hydrolyse des conjugués ou la précipitation des protéines.
Hydrolyse des conjugués
Les métabolites β-glucuroconjugués et sulfoconjugués des xenobiotiques sont des dérivés très stables dont la présence peut gêner l’analyse. Leur hydrolyse rend disponible les fractions libre des molécules parents ou celles issues du métabolisme de phase I pour une meilleur identification.
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Table des matières
Introduction Générale
Chapitre I : Revue bibliographique
I : Screening toxicologique
A : Définition du criblage toxicologique
B : Place du screening en toxicologie d’urgence médicolégale
C : Etapes de screening toxicologique
1 : Etapes pré-analytique
2 : Etapes analytique
2.1 : Simple préparation d’échantillons
a : Techniques de prétraitement
a.1 : Hydrolyse des conjugués
a.2 : Précipitation des protéines
b : Techniques d’extraction
b.1 : Extraction liquide-liquide
b.2 : Extraction en phase solide
c : Dérivation des échantillons
2.2 : Méthodes analytiques
a : Méthodes séparatives
a.1 : Chromatographie en phase gazeuse
a.2 : Spectroscopie de masse
a.3 : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse
D : Hydrolyse
1 : Hydrolyse des toxicants
a : Enzyme β- Glucuronidase
2 : Intérêt d’hydrolyse
Chapitre II : Matériels et méthodes
I : Objectif
A : Matériels et méthodes expérimentales
1 : Réactifs
a : Préparation d’enzyme
b : Extraction
2 : Instrumentations
a : Matériels
B : Mode opératoire
1 : Hydrolyse enzymatique et acide
2 : Extraction
Chapitre III : Résultats et discussion
I : Analyse des chromatogrammes par couplage CPG/SM
1 : Hydrolyse enzymatique
1.1 : Hydrolyse enzymatique + extraction sans tampon
a : Analyse qualitative de l’échantillon 1
b : Analyse quantitative de l’échantillon 1
1.2 : Hydrolyse enzymatique + extraction avec tampon
a : Analyse qualitative de l’échantillon 3’
b : Analyse quantitative de l’échantillon 3’
2 : Hydrolyse acide
a : Analyse qualitative de l’échantillon 7’
b : Analyse quantitative de l’échantillon 7’
II: Comparaison des résultats
1 : Comparaison des résultats de trois échantillons hydrolysés par les trois méthodes différentes
2 : Comparaison des résultats d’analyse des sept échantillons étudiés
Conclusion
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