Place de la délétion d’IKAROS dans l’allogreffe

Protocole de traitement

En France, en fonction des centres de référence, les patients sont traités selon le protocole franco-belge EORTC ou le protocole français FRALLE 2000. Lors de l’inclusion dans ces deux protocoles, les patients sont répartis en groupe de risque en fonction des facteurs pronostiques précédemment décrits, influençant alors l’intensité thérapeutique.
Le CHU de Rouen travaille avec le protocole FRALLE 2000.
Au diagnostic, les patients sont répartis en groupe de bas risque (FRALLE A) et groupe de risque intermédiaire et élevé (FRALLE B). Un seul critère suffit pour que le patient soit traité selon le groupe B.
Tableau 2 : Critères d’inclusion dans les deux protocoles de traitement.

Réponse et toxicité

Cette intensification de traitement comporte de nombreux risques de complications aiguës et tardives, ainsi que des risques de séquelles. Les indications d’allogreffe sont donc limitées et réévaluées régulièrement selon les résultats de protocoles prospectifs.
Le protocole d’allogreffe BFM 2003 [18] rapporte des résultats d’une cohorte multicentrique internationale de 411 patients allogreffés pour une LAL (B ou T), dont 209 patients allogreffés en première RC. La toxicité était majeure : une maladie du greffon contre l’hôte(graft versus host disease, ou GVH) de grade III ou IV était apparue dans 11% des cas.
L’incidence cumulée à deux ans deGVH chronique étendue était de 14%. La mortalité liée à la greffe à 4 ans était de 4% (en cas de donneur géno-identique). Les résultats de cet essai sont meilleurs que dans les études publiées antérieurement.

Le gène IKAROS

Le gène IKAROSou IKZF1(IKAROSFamily Zinc Finger 1), codant pour un facteur de transcription en doigt de zinc, a été isolé en 1992 sur des modèles murins. IKAROSa été initialement décrit comme étant un facteur de transcription impliqué dans la maturation des lymphocytes T [19,20].

Structure du gène IKAROS

Le gène IKAROS a une taille de 120 kbases, il est situé sur le bras court du chromosome 7 (7p12.2). Il comprend huit exons. L’exon 1 est non codant mais il peut réguler la transcription du gène avec le promoteur. Les exons 2, 3 e t 7 ont des fonctions peu connues.
Les autres exons sont cruciaux pour la fonction propre d’IKAROS: les exons 4, 5 et 6 codent pour un domaine N-terminal de liaison à l’ADN comportant quatre doigts de zinc. L’exon 8 code pour un domaine C-terminal comportant deux doigts de zinc et il permet la dimérisation d’IKAROS, avec lui-même ou avec les autres membres de sa famille. En effet, IKAROS appartient à une famille de gènes comportant quatre autres membres : HELIOS(ou IKZF2),AIOLOS(ou IKZF3), EOS(ou IKZF4), et PEGASUS(ou IKZF5) [21,22].

Les isoformes de la protéine

La structure de la protéine est rendue plus complexe par le biais de l’épissage alternatif. En effet, l’épissage alternatif de l’ARN pré-messager permet l’expression de plusieurs isoformes protéiques. Toutes les isoformes contiennent les 2 premiers exons ainsi que le dernier, mais le nombre d’exons à l’intérieur varie : IK1, IK2 et IK3 sont des isoformes longues et fonctionnelles possédant 3 doigts de zinc centraux interagissant avec l’ADN. IK4, IK7, IK8 sont des isoformes courtes ayant perdu leur domaine à doigt de zinc central, c’est-à-dire leur domaine de liaison à l’ADN. Leur domaine C terminal est en revanche fonctionnel et donc interagit par homo- ou hétérodimérisation avec des isoformes longs. Ces isoformes courtes inhibent donc l’action des isoformes longues, et confèrent à ces dernières un effet dominant négatif [24]. IK6 est aussi une isoforme courte, mais il est rarement issu de l’épissage alternatif. Il résulte plutôt de la délétion génomique des exons 4 à 7 (Figure 5).

Expression du gène IKAROS

L’expression d’IKAROSest détectée très tôt au cours du développement embryonnaire (8,5 jours), au niveau des sites où se produisent l’hématopoïèse primitive (sac vitellin) et définitive (foie fœtal). Plus tard chez l’adulte, il est exprimé dans l’ensemble des cellules hématopoïétiques. Les isoformes sont en proportions différentes selon que les cellules s’orientent vers une différenciation myéloïde, lymphoïde ou érythroïde.
Les isoformes IK1 et IK2 sont également abondamment exprimées dans l’hypothalamus et la glande pituitaire, et sont essentielles dans le développement du système neuro-endocrine [25].

Fonction du gène IKAROS

Un rôle clé dans l’hématopoïèse

Sa fonction dans l’hématopoïèse a été démontrée à partir de modèles de murins mutés.
Le gène IKAROSintervient tout au long de la différenciation hématopoïétique. Chez la souris mutée, l’absence de protéine conduit à une hypoplasie voire une absence des organes lymphoïdes secondaires, associée à une absence de cellules précurseurs lymphoïdes et des lymphocytes matures B et T [20].

Méthode

Données générales

Les données générales ont été recueillies de manière rétrospective par analyse des dossiers médicaux. Le diagnostic, l’inclusion dans le groupe de traitement et le traitement étaient réalisés selon le protocole FRALLE 2000.

Aspects éthiques

En accord avec la réglementation en vigueur, les responsables de l’autorité des patients traités dans le service d’immuno-hémato-oncologie pédiatrique du CHU de Rouen ont signé, lors du diagnostic, des documents d’information sur l’informatisation et le traitement des données médicales, et sur l’utilisation à des fins de recherche des reliquats de prélèvements effectués à des fins diagnostiques.

Analyse du gène IKAROS

Pour les patients dont le diagnostic est antérieur à 2012.
Nous avons réalisé l’analyse du gène IKAROS rétrospectivement au laboratoire de biologie moléculaire du Centre Henri Becquerel.
L’ADN provenait des blastes médullaires ou sanguins au diagnostic. Pour certains patients, il n’y avait pas d’ADN conservé lors du diagnostic. Cependant nous avons pu en extraire à partir de culots de cytogénétique congelés.

Pour les patients de diagnostic postérieur à 2012

L’analyse a étéréalisée de manière prospective, en même temps que le diagnostic de LAL, au CHU de Lille, qui centralise toutes les analyses protocolaires. En effet, depuis 2012, les mutations d’IKAROSsont recherchées de manière systématique au diagnostic d’une LAL B.

Recherche de délétions par MLPA (Multiplex Ligation Probe-dependant Amplification)

Les délétions IKAROSont été analysées par la technique de MLPA, avec le kit P335-A3 ALL-IKZF1 (MRC-Holland, Amsterdam, Pays-Bas), selon le protocole du fournisseur.
Cette méthode s’effectue à partir de l’ADN. Chaque exon du gène IKAROSest hybridé par un ou plusieurs couples d’oligonucléotides adjacents correspondant à des séquences spécifiques d’exons. Ensuite se produit l’étape de ligation des oligonucléotides, formant une sonde seulement si les deux séquences spécifiques sont présentes. Les produits de ligation sont ensuite amplifiés par PCR multiplexe à l’aide d’amorces universelles. L’une des deux amorces est couplée à un fluorochrome. La détection des fragments amplifiés se fait sur un automate de séquençage. Les différents produits de ligation sont différenciés à l’aide d’une séquence synthétique de taille variable (« stuffer sequence ») [45].
Cette méthode est actuellement considérée comme une des méthodes de référence pour la détection des délétions d’IKAROS (Figure 7).

Avantages 

Cette technique est dotée d’une grande sensibilité et possède une grande capacité de multiplexage : 40 loci peuvent être analysés dans la même réaction.
Sa spécificité est élevée car elle emploie deux oligonucléotides adjacents comme sonde.
Elle nécessite de faibles quantités d’ADN (20ng suffisent).
Elle est moins sensible à la dégradation de l’ADN car les sondes utilisées sont courtes (50-70 pb).
Elle est rapide.

Limites de la technique 

Comme la MLPA utilise deux sondes adjacentes, la présence d’une mutation au niveau de la séquence cible spécifique de la sonde peut interférer avec la fixation de la sonde à sa cible ou interférer dans la phase de ligation. Cela aboutit à la diminution des produits de ligation, interprétée à tort comme une délétion (faux positifs).
Le coût des kits prêts à l’emploi est très élevé.
La détection des sous-clones minoritaires est difficile voire impossible.

Analyses statistiques

La survie sans événement (Event Free Survival, EFS) correspond à l’intervalle de temps écoulé entre la date du début du traitement et la date de survenue d’un événement, c’est-à-dire la progression de la maladie ou le décès du patient. La survie globale (Overal Survival, OS) correspond à l’intervalle de temps écoulé entre la date du début du traitement et la date du décès ou des dernières nouvelles du patient.
Le recul médian a été calculé entre la date de diagnostic et la date des dernières nouvelles ou de décès.
Les différences entre les groupes de patients ont été analysées par les tests exacts de χ2 et de Fisher.
L’estimation de la survie a été calculée en utilisant la méthode de Kaplan-Meier.

Description de la cohorte du FRALLE 2000

Nous avons analysé les données de tous les enfants porteurs d’une LAL B traités à Rouen selon le protocole FRALLE 2000 A ou B, non BCR-ABL, depuis l’ouverture du protocole (septembre 2000) jusqu’à décembre 2015. Il s’agit d’une cohorte de 147 enfants, avec un sex ratio de 0,8 (66 garçons et 81 filles), et un âge médian au diagnostic de 3,0 ans [1,0-15,9]. Le recul médian était de 7,3 ans [0,5-15,8].
Parmi ces patients, 19 ont rechuté, ce qui donne une EFS à 5 ans de 84,3%. Huit patients sont décédés, ce qui donne une OS à 5 ans de 92,8 %.

IKAROS et caractéristiques générales des patients

Les patients du groupe IKAROS-délété avaient tendance à être plus âgés, avoir une hyperleucocytose >50G/L au diagnostic, à avoir une atteinte du SNC, et un phénotype B-I mais sans significativité statistique.

IKAROS et caractéristiques génétiques

Les caractéristiques génétiques étaient significativement différentes selon le statut mutationnel.
Dans le groupe IKAROS-délété, on retrouve moins d’anomalies génétiques de bon pronostic telles que l’hyperdiploidie, et la translocation ETV6-RUNX1, et plus de B-other(p=0,01).

IKAROS et réponse précoce au traitement

La fréquence de corticorésistance et la chimiorésistance n’étaient pas différentes dans les deux groupes délété et non délété.

IKAROS et MRD à J35

La proportion de MRD positive n’était pas significativement différente dans les 2 groupes. Cependant on note une tendance à une fréquence de MRD positive plus importante dans le groupe délété, que ce soit au seuil de 10 -2 (6,3% vs2,3%), ou au seuil de 10 -3 (27,3% vs17,2%).
Concernant les 17 patients IKAROS-délété, le résultat de MRD était disponible au seuil de 10 -2 pour 16 d’entre eux, et au seuil de 10 -3 pour 11 d’entre eux.Dans ce groupe, la positivité de la MRD n’était pas associée à un taux derechute plus fréquent (p=0,85).

IKAROS et groupe de traitement

Compte tenu des caractéristiques cliniques au diagnostic, des groupes génétiques et de la réponse au traitement, les patients du groupe IKAROS-délété étaient donc moins fréquemment dans le protocole FRALLE A1/A2 (29,4% vs 63,4%, p<0,001), et plus fréquemment dans le FRALLE A3/B1/B2 (70,6% vs36,6%, p<0,001).

Devenir des patients pour l’ensemble de la cohorte

Concernant l’ensemble des 111 patients de la cohorte dont le statut IKAROSa pu être analysé, 15 patients ont rechuté (taux de rechute de 13,5%).
Parmi les 15 rechutes de la cohorte, 8 patients sont décédés.
Il est à noter que la MRD J35 au seuil de 10 -2 était négative pour tous les patients qui ont rechuté. En revanche la MRD J35 au seuil de 10 -3 était positive pour 4 des patients qui ont rechuté (3 MRD au seuil de 10 -3 non évaluables).
Après prise en compte de la MRD au seuil de 10 -2 et adaptation du traitement en fonction de sa positivité, la MRD n’est pas associée à un tauxde rechute plus important, ni à deux ans (p=0,37), ni à cinq ans (p=0,40).
Au seuil de 10 -3 , la MRD n’est pas non plus associée à un taux de rechute plus important, ni à deux ans (p=0,81), ni à cinq ans (p=0,46). IKAROSet rechute
Le taux de rechute était significativement plus élevé dans le groupeIKAROS-délété : 35,3 % contre 9,6 % dans le groupe IKAROSnon délété, (p<0,01).
L’EFS à 5 ans était significativement plus basse dans le groupe délété : 55% vs88%, p<0.005 (Figure 11).
La délétion IKAROS est donc associée à un risque significatif de rechute de 4,184 [1,18-11,80] (p<0,01).

Délai de rechute

Le délai médian de rechute, c’est-à-dire le délai médian entre la RC et l’apparition de la rechute, n’était pas significativement différent entre les groupes IKAROS-délété et IKAROS-non délété : respectivement 25 et 29 mois, p=0,52.
Dans la cohorte, 4 patients ont rechuté tardivement, c’est-à-dire plus de 36 mois après la mise en rémission. Deux d’entre eux présentaient unedélétion IKAROS. La proportion de rechutes tardives dans les deux groupes IKAROS-délété et non délété n’est donc pas différente significativement (p=0,9).

IKAROSet survie globale

Sur les 8 décès de la cohorte totale, 3 d’entre eux avaient une délétion IKAROS, Il s’agissaità chaque fois de la délétion Δ4-7.
Le taux de survie globale avait fortement tendance à être plus élevé dans le groupe IKAROS-non délété par rapport au groupe délété mais de façon non significative (94,7% vs 82,4%, p=0.07).
L’OS à 5 ans était plus élevée dans le groupe non délété par rapport au groupe délété de manière juste significative (94% vs76%, p=0,05).

Technique MLPA

La MLPA est la technique qui a été utilisée pour détecter les délétions IKAROS de notre cohorte. C’est la technique la plus utilisée actuellement, en raison de sa grande spécificité et de sa rapidité. En revanche, certaines délétions peuvent échapper à la MLPA, comme des délétions présentes dans des sous-clones.
Une autre technique, basée sur la PCR multiplexe est très utilisée également.
L’inconvénient decelle-ci est la faible détection des larges délétions ; mais elle a l’avantage de mieux détecter la sous-clonalité (breakpoint-specific multiplex polymerase chain reaction).
C’est pourquoi de nombreux laboratoires couplent les deux méthodes pour augmenter la sensibilité de l’analyse [47].
D’autres équipes [48,49] utilisent successivement deux kits MLPA : le premier kit teste également d’autres gènes, puis un deuxième kit n’est utilisé que si le premier retrouve une délétion. Le deuxième kit est moins sensible mais encore plus spécifique, il permet d’affiner la nature de la délétion.
Dans notre étude, nous n’avons utilisé qu’un seul kit MLPA. Il aurait été plus précis de compléter l’analyse par une PCR multiplexe afin d’affiner la caractérisation des délétions.
La fréquence des délétions retrouvées dans notre étude était de 15%, comparable à la plupart des autres études [47, 49], ce qui conforte la fiabilité de nos résultats.
Cas particulier de la monosomie 7
Deux enfants de notre cohorte avaient une délétion du chromosome 7, donc la perte complète d’un allèle du gène IKAROS.

DISCUSSION

Pour l’un d’entre eux, la technique MLPA n’a pas retrouvé cette large délétion IKAROS. En reprenant les résultats des analyses cytogénétiques, la monosomie 7 portait sur seulement 15% des cellules au diagnostic. Il s’agit donc probablement d’un sous-clone, inférieur à la limite de détection de la MLPA (environ 25% des cellules).
Concernant le second enfant, la recherche de délétion par MLPA a échoué à cause d’une quantité insuffisante d’ADN. Les résultats cytogénétiques n’ont pas permis de savoir si cette monosomie 7 était présente dans toutes les cellules ou dans un sous-clone. L’enfant a fait une rechute qui a été rattrapée par allogreffe.
Ces deux cas ont été classés dans le groupe IKAROS-non délété puisque la MLPA n’a pas détecté de délétion. Cela permettra de comparer la sensibilité de cette technique à une autre ultérieurement.

Aspects généraux de la cohorte rouennaise

Cette étude monocoentrique rétrospective a permis d’évaluer la cohorte globale rouennaise traitée selon le FRALLE 2000, depuis l’ouverture de ce protocole, et pendant 15 ans.
Les résultats d’EFS et d’OS sont tout à fait conformes à la moyenne nationale : l’EFS à 5 ans était de 84,3% pour notre cohorte, et de 84,0 % pour l’ensemble du FRALLE. L’OS à 5 ans était de 92,8 % pour notre cohorte, et de 91% pour l’ensemble du FRALLE (données non publiées).
Le protocole FRALLE 2000 intensifie le traitement en cas de MRD positive à 10 -2 , puisqu’il s’agit d’un facteur prédictif reconnu [16]. Dans notre série, la MRD, au seuil de 10 -2 et de 10 -3 , n’était pas prédictive de rechute, ni à deux ans, ni à cinq ans. La prise en compte de la MRD dans la stratification des groupes de risques semble efficace.

Impact d’IKAROS sur les caractéristiques au diagnostic

Age, hyperleucocytose

Dans notre étude, les patients IKAROS-délété étaient plus âgés, mais de manière non significative, ce qui est concordant avec certaines études [49]. En revanche, d’autres retrouvent un âge significativement augmenté dans le groupe délété [48, 50].

Table des matières
INTRODUCTION
LEUCEMIES AIGUES
Epidémiologie 
Facteurs de risques étiologiques
Diagnostic des LAL
Facteurs pronostiques actuels : simplification des critères cliniques, complexification des critères génétiques
Traitement
Le gène IKAROS
Structure du gène IKAROS
Les isoformes de la protéine
Expression du gène IKAROS
Fonction du gène IKAROS
Mutations du gène IKAROS (cf figure 4)
OBJECTIFS 
PATIENTS ET METHODE
Patients
Méthode
Données générales
Aspects éthiques
Analyse du gène IKAROS
Analyses statistiques
RESULTATS 
Description de la cohorte du FRALLE 2000
Analyse de la cohorte pour laquelle le statut IKAROSest connu
Devenir des patients pour l’ensemble de la cohorte
IKAROSet rechute
IKAROSet survie globale
Fréquence et type de délétion IKAROS
DISCUSSION
Technique MLPA
Cas particulier de la monosomie 7
Aspects généraux de la cohorte rouennaise
Impact d’IKAROS sur les caractéristiques au diagnostic
Age, hyperleucocytose
Immunophénotype
Caractéristiques génétiques
Impact d’IKAROSsur la réponse précoce
Corticosensibilité
MRD en fin d’induction
Impact d’IKAROSsur la rechute
Faible impact dans le sous-groupe génétique ETV6-RUNX1
Impact majeur dans le sous-groupe génétique B-other
IKAROS et groupes de traitement
Place de la délétion d’IKAROS dans l’allogreffe
Pas d’impact sur le type de délétion d’IKAROS
IKAROSet délai de rechute
Statut IKAROSlors de la rechute
Impact d’IKAROSsur la survie
Autres délétions
CONCLUSION 
BIBLIOGRAPHIE
Annexe 1 : Schéma général du traitement FRALLE 2000A
Annexe 2 : Schéma général du traitement FRALLE 2000B
Annexe 3 : Revue de la littérature

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