Pistes en développement pour l’aide au diagnostic

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Variants génétiques

Les travaux de K. Kühn95, de J. Laliberté, L. Momparler et leurs collaborateurs96, complétés par les nombreux travaux de S. Vincenzetti et ses collaborateurs 97 ont mis en évidence l’existence de deux variants majoritaires d’ARN messager de la CDA qui diffèrent par le codon 27 et qui donnent alternativement une Glutamine ou une Lysine. Ces deux protéines appelés respectivement CDA1 et CDA2 sont capables de former les différentes combinaisons de tétramères, soit 5 isoformes enzymatiques qui ont sensiblement les mêmes propriétés physico-chimiques et enzymatiques car l’acide aminé n’est pas situé dans le site actif de l’enzyme.97 La seule différence, d’après ces auteurs, résiderait dans la charge nette de chaque monomère, leur conférant une capacité différente de migration sous électrophorèse, CDA1 étant visualisé légèrement plus bas que CDA2 sur gel de polyacrylamide (PAGE)97. Ces travaux ont néanmoins été complétés par de nombreux essais cliniques visant à démontrer une éventuelle corrélation entre ces deux variants et une activité plus ou moins forte de l’enzyme (voir partie « Régulation de l’activité de la CDA »). Ces polymorphismes sont retrouvés dans la population avec des fréquences plus ou moins importantes selon l’ethnicité. Le variant CDA2 est celui majoritairement retrouvé dans la population caucasienne98 (80%). L’équipe de S. Koizumi a également mis en évidence un autre variant sur le codon 70 qui consiste en une thréonine à la place d’une alanine, mais retrouvé dans uniquement dans 4,3% de la population japonaise étudiée99. D’autres études montrent que ce variant semble concerner exclusivement les populations africaines et asiatiques100.

Fonction de la CDA

Le recyclage des pyrimidines

La CDA a une fonction de désaminase qui lui permet de catalyser la transformation des cytidines et désoxycytidines en uridines et désoxyuridines respectivement101 en réalisant l’hydrolyse du groupement amine en cétone avec libération d’ammoniac89. La désamination de la cytidine en uridine participe d’une part, à assurer un maintien de l’équilibre du pool de nucléotides pour la synthèse d’ADN et d’ARN mais est également nécessaire pour le catabolisme du cycle pyrimidique, source de carbone et d’azote, et qui aboutit à la formation de bêta-alanine102,103 (voir figure 8). La CDA, au sein de la voie de recyclage des pyrimidines, a donc un rôle complémentaire avec la voie de novo de synthèse des pyrimidines.

Autres enzymes de recyclage de la famille des désaminases

La CDA n’est pas la seule désaminase cytoplasmique impliquée dans le recyclage des nucléotides. En contraste avec la CDA qui réalise l’hydrolyse de la cytosine sous forme nucléosidique, la désamination de l’adénine peut être réalisée sous forme nucléosidique (adénosine) par l’adénosine désaminase ou sous forme nucléotidique (AMP) par l’AMP désaminase. La guanosine, quant à elle est désaminée par la guanosine désaminase pour donner une xanthosine105.
Il existe également une famille d’enzymes, appelées APOBEC (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like), capable de désaminer les nucléotides engagés dans des liaisons ARN comme l’AI-CDA (activation-induced CDA)83, souvent confondue avec la CDA. Ces deux enzymes sont cependant bien différentes, tant par leur structure et leur domaine catalytique, que par leur localisation subcellulaire.

Localisation de la CDA

Les bases de données référencent la CDA comme étant une protéine cytoplasmique106 dont la fonction d’édition des cytidines lui permet de recycler les pyrimidines libres du cytoplasme, par la suite transportées passivement dans le noyau ou activement dans les mitochondries (par la famille des transporteurs d’adénine nucléotide ANT ou encore SLC25A19107) où elles seront intégrées à l’ADN ou à l’ARN. Il est donc communément admis que la CDA est contenue principalement dans la fraction cytoplasmique. Cependant, A. Somasekaram et ses collaborateurs rapportent que la CDA semble avoir une localisation nucléaire possible due à une séquence NLS bipartite reconnue par le récepteur à importine108. Ce sont les seuls à avoir mentionné une telle localisation, la taille sous forme tétramérique de la CDA ne lui permettant pas d’être transportée de façon passive à la membrane nucléaire (>40-50kDa).
La CDA est également retrouvée dans le sérum de patients109. L’activité sérique de la CDA est d’ailleurs étudiée en relation avec plusieurs cancers pour prédire la réponse chimio thérapeutique ou les toxicités liées à la chimiothérapie110–113. De plus, l’activité sérique de la CDA est mesurée dans le cadre de grossesses anormales avec complications114, une inflammation aiguë dans l’arthrite rhumatoïde et certaines autres conditions115. En effet, il est connu que le CDA est libérée dans le sérum lorsque la membrane des PMN (polymorphonucléaires neutrophiles) est endommagée116. L’augmentation de l’activité sérique de la CDA chez les patients atteints de ces différentes conditions pourrait ainsi s’expliquer par la libération de l’enzyme par les cellules endommagées des tissus exprimant des niveaux élevés de CDA (comme le placenta et les neutrophiles).

Mécanismes de régulation transcriptionnelle de la CDA

Peu de mécanismes de régulation du niveau d’expression de la CDA sont réellement connus à l’heure actuelle. Tout d’abord, S. Watanabe et T. Uchida ont montré que l’injection de vitamine D3 induit une augmentation du niveau d’expression protéique de la CDA danscertaines tumeurs118. S. S. Shord et R. P. Patel ont montré que l’administration de paclitaxel (anticancéreux antinéoplasique) a un effet sur le niveau d’ARN messager de la CDA dans certaines lignées cancéreuses120. Cependant, aucun mécanisme n’est proposé par ces deux équipes pour expliquer la modulation du niveau d’expression de la CDA. K. K. Frese et ses collaborateurs ont montré que le nab-paclitaxel réduit le niveau de protéine CDA, mais pas le niveau d’ARN in vivo. Ils ont montré que c’est la production de ROS qui induit une diminution du niveau de CDA, puisque le taux de CDA est rétabli lorsqu’on utilise la N-acétylcystéine (NAC, une molécule antioxydante)121. Plus récemment, l’équipe de M. Amor-Gueret a montré que le niveau d’expression de la CDA dans les tumeurs est régulé négativement par méthylation du promoteur de la CDA122.
En effet, l’utilisation d’un médicament inhibant les méthyltransférases de l’ADN sur des cellules à faible expression de CDA augmente l’expression de CDA dans ces cellules. Aussi, plusieurs sites de liaison à des facteurs de transcription dans la région du promoteur de la CDA ont été décrits dans la littérature : cEBPs, SP1, AP1, Myc/Max, HFH2, Lyf1, ARP185 et GATA1123.
D’autre part, plusieurs mutations naturelles du gène de la CDA sont retrouvées dans la population, et en particulier, dans le domaine proche du promoteur. Ces mutations sont susceptibles de modifier les sites de liaison aux facteurs de transcription et donc d’altérer le niveau de transcription de la CDA. L’équipe de R. E. Ferrell a mis en évidence trois polymorphismes à un seul nucléotide (SNP) -92A>G, -451C>T et -897C>A qui forment un haplotype où ATC induit une plus faible expression de la CDA124.
De plus, l’équipe de Z.-M. Shao a corrélé négativement miR-484 à l’expression de la CDA et a montré que la surexpression de miR-484 contrecarre la chimiorésistance induite par la CDA. Il semblerait que ce micro ARN puisse se lier directement à la partie 3’UTR de son ARN messager et d’induire une diminution de l’expression protéique de la CDA125. A. Rajabpour et ses collaborateurs ont également montré que l’expression de miR-608 est diminuée lors de l’induction de chimiorésistance dans des cellules cancéreuses pancréatiques, dans lesquelles l’expression de CDA est alors augmentée126. Enfin, l’équipe de Z. Gil a montré que les macrophages participent à la chimiorésistance de la tumeur en augmentant l’expression de CDA79,127 et ils ont mis en évidence le rôle du miR-365 comme régulateur de l’expression de CDA128.

Polymorphismes activateurs et réducteurs de l’activité de la CDA

Les deux polymorphismes les plus étudiés sont les substitutions nucléotidiques simples 208G>A et 79A>C. Malgré certaines études non conclusives voire des résultats contradictoires sur la corrélation entre l’activité enzymatique de la CDA et ses variations géniques, il semblerait que la présence du SNP 208G>A (A70T) résulte en une plus faible activité de la CDA113,129 tandis que la mutation 79A>C (K27Q) est activatrice vis-à-vis de la cytidine et de la désoxycytidine130,131. S. Vincenzetti et ses collaborateurs mettent également en évidence un haplotype activateur de la CDA (-451T/-92G/-31Del/79C/435C)100. Ces polymorphismes ont également des répercussions sur la métabolisation des drogues avec une diminution de 68% de l’activité vis-à-vis de l’Ara-C avec la mutation protéique A70T rapporté par L. Yue, et ses collaborateurs129. Etrangement, plusieurs résultats sont contradictoires concernant la mutation K27Q. Une équipe a montré une diminution de 23% à 70% de l’activité de la CDA visà- vis de l’ara-C132 et une diminution de 34% de l’activité de cette même enzyme vis-à-vis de la gemcitabine133, tandis qu’une autre montre une augmentation de l’activité de la CDA vis-à-vis de l’Ara-C mais une diminution vis-à-vis de la décitabine130. Ces incohérences entre l’activité de la CDA et ses SNP suggèrent que les polymorphismes du gène ne suffisent pas à expliquer l’hétérogénéité de l’activité sérique de la CDA entre patients. Malheureusement, les données sur les mécanismes de modulation de l’activité de la CDA sont rares.

Importance fonctionnelle de la CDA dans les pathologies

À ce jour, aucun modèle de souris knock-out pour la CDA n’a été publié. Par conséquent, nous n’avons aucune connaissance de l’importance de la CDA dans le Résumé des paragraphes 2.6 et 2.7 :
Les deux polymorphismes de la CDA les plus étudiés sont les substitutions nucléotidiques simples 208G>A et 79A>C qui sont associés à une variation de l’activité de l’enzyme. Plusieurs inhibiteurs pharmacologiques de la CDA ont été développés, en particulier le THU, le DR et la zébularine présentent une bonne efficacité. Ce sont des inhibiteurs catalytiques compétitifs qui bloquent le site actif de l’enzyme.

Le syndrome de Bloom

La CDA a un rôle important dans le maintien du pool de nucléotides et il est connu qu’un déséquilibre de ce pool peut amener à un fort stress réplicatif délétère pour la cellule150.
Le syndrome de Bloom est une maladie autosomique rare provoquée par une mutation du gène BLM sur les deux allèles qui résulte en une forte instabilité génétique151. À ce jour, plusieurs mutations du gène BLM ont été décrites, l’une d’entre elles en particulier notée BLMAsh est retrouvée de façon récurrente et aboutit à une protéine tronquée152. Le gène BLM code pour une protéine nucléaire du même nom dont les principales fonctions, en tant qu’hélicase à ADN, sont le maintien de l’intégrité génomique153. BLM est notamment relocalisé au niveau des cassures de l’ADN au sein d’un complexe contenant également RAD51, qui signale les dommages et participe ainsi à leur prise en charge par les mécanismes de réparation. Généralement, les mutations retrouvées sur le gène BLM sont des délétions ou des insertions de bases qui résultent en une diminution de la transcription du gène ou la terminaison de la traduction due à un non-sens de lecture de l’ARNm153. Un défaut ou une altération de cette protéine induit donc une mal-fonction du système de réparation par recombinaison homologue. Des mutations spontanées des cellules somatiques sont ainsi beaucoup plus fréquentes que chez un individu normal. En conséquence, les patients atteints de cette pathologie présentent des rougeurs congestives de la peau, appelées érythèmes télangiectatiques, ainsi que des retards de croissance, voire d’autres malformations154. Ces patients sont également prédisposés à la formation précoce de tous types de cancers, ce qui réduit considérablement leur espérance de vie149. Une caractéristique systématique de l’instabilité génétique liée au syndrome de Bloom est la présence d’échanges de segments entre les chromatides soeurs d’un chromosome, ce qui a d’ailleurs longtemps constitué une méthode de diagnostic de cette maladie, aujourd’hui confirmé par séquençage155.
L’équipe de M. Amor-Guérêt a montré qu’une mutation du gène BLM est associée à une perte d’expression de CDA. Parmi les nombreux défauts de ségrégations des chromatides, la formation de ponts chromatiniens (conséquences d’une mauvaise ségrégation de chromatides soeurs) sont directement du à l’absence de BLM, tandis que la présence de ponts ultra-fins (UFB) (qui succèdent à une réplication incomplète de l’ADN quand les cellules entrent en mitose) résultent d’un déséquilibre du pool de pyrimidines dû à la dérégulation deCDA156. Le mécanisme expliquant ce phénomène serait l’accumulation de dCTP dû à l’absence de CDA, qui induit une diminution de l’activité de PARP-1, une protéine impliquée dans la réponse aux dommages de l’ADN. L’équipe de C.P. Witte a complété cette hypothèse dans un autre modèle en montrant que l’accumulation d’espèces intermédiaires du catabolisme des pyrimidines dû à l’invalidation de CDA est toxique102. Il a également été proposé qu’un fort stress oxydatif, retrouvé dans les cellules de Bloom, soit en partie responsable de l’instabilité génétique présente dans ces cellules157,158.

La reprogrammation énergétique tumorale

D. Hanahan et R.-A. Weinberg ont défini pour la première fois en 2000 une cellule cancéreuse d’après six caractéristiques principales : la mise en place d’une signalisation pour soutenir la prolifération, l’indépendance vis-à-vis des suppresseurs de croissance, la résistance à la mort cellulaire, l’immortalité réplicative, l’induction de l’angiogenèse et l’activation de l’invasion pour former des métastases180. Une décennie plus tard, deux nouvelles caractéristiques ont ensuite été ajoutées : l’évasion immunitaire et la reprogrammation du métabolisme énergétique (voir figure 17)181. C’est cette dernière caractéristique qui ser détaillé dans les paragraphes suivants. En présence d’oxygène, les cellules normales réalisent le catabolisme du glucose en le transformant en pyruvate via la glycolyse puis en dioxyde de carbone, NADH, FADH2 ou GTP dans les mitochondries. En condition anaérobie, le catabolisme du glucose est incomplet car le pyruvate n’est pas transporté dans les mitochondries mais transformé en lactate. Une des caractéristiques des cellules cancéreuses et qu’elles reprogramment leur métabolisme énergétique vers la glycolyse même en présence d’oxygène. Cet état énergétique de glycolyse aérobie porte le nom d’effet Warburg.

Organisation et structure du métabolisme mitochondrial

Comme indiqué précédemment, la théorie énoncée par Otto Warburg que la reprogrammation énergétique des cellules cancéreuses proviendrait de dysfonctions mitochondriales, fait aujourd’hui débat. Cependant, bien que des dysfonctions mitochondriales ne suffisent pas à expliquer l’effet Warburg, de nombreux travaux de recherche montrent tout de même une accumulation de modifications mitochondriales dans les cancers190. Aussi, la découverte de mutations dans les enzymes métaboliques mitochondriales, comme la fumarate hydratase (FH), la succinate déshydrogénase (SDH) ou encore l’isocitrate déshydrogénase 2 (IDH2), suggère le rôle du métabolisme mitochondrial dans la carcinogénèse. En particulier, F. Weinberg et ses collaborateurs ont montré que la génération de ROS par les mitochondries est essentielle à la carcinogénèse induite par Kras191.

Les mitochondries

Les mitochondries sont des organites dynamiques cytoplasmiques dont l’origine proviendrait de bactéries192 et qui représentent en moyenne environ 10% du volume du cytoplasme193. Elles sont présentes chez la majorité des organismes eucaryotes194. Les mitochondries ont une forme ellipsoïdale avec des tailles comprises entre 0.75μm et 3μm de long (grand diamètre) et d’environ 0.5μm de large (petit diamètre). Elles sont formées d’une membrane externe et d’une membrane interne structurée en de nombreux replis appelés crêtes mitochondriales, d’un espace inter membranaire et d’une matrice au centre. Elles contiennent leur propre ADN (ADNmt), double brin et circulaire, et leur propre système de codage195 (par exemple AGA, qui code pour une arginine dans le code nucléaire, est un codon stop pour la mitochondrie chez l’homme). Cet aspect est un des arguments majeurs pour soutenir l’hypothèse d’une origine exogène à la cellule. Lynn Margulis est l’auteure de cette théorie argumentée en 1966, et actuellement admise, que les mitochondries proviendraientde l’endocytose d’une α-protéobactérie il y a environ 2 milliards d’années dans une cellule eucaryote avec laquelle elle a développé une relation symbiotique (endosymbiose).
Les cellules cancéreuses se caractérisent par un ensemble de voies dérégulées dont une reprogrammation du métabolisme énergétique. Otto Warburg est le père fondateur de cette théorie, qui a commencé par l’observation que les cellules cancéreuses consomment plus de glucose et produisent plus de lactate que les cellules normales, malgré un apport en oxygène suffisant. L’effet Warburg (ou glycolyse aérobie) est ainsi mesuré dans laplupart des tumeurs. L’augmentation du flux glycolytique sert à soutenir les trois besoins fondamentaux des cellules cancéreuses : une biosynthèse accrue des macromolécules qui permet l’augmentation de biomasse, un maintien rigoureux de l’équilibre d’oxydoréduction (RedOx) essentiel à de nombreuses réactions cellulaires et une production suffisante d’ATP pour soutenir l’état énergétique.génome mitochondrial a subi de nombreuses mutations au cours du temps et peut être particulièrement hétérogène entre différentes espèces. La mitochondrie aurait même transféré quelque uns de ses gènes à l’ADN nucléaire au cours du temps. Les mitochondries ont la capacité de croître, de répliquer leur ADN et de se dupliquer (uniquement par fission), ainsi que de fusionner. L’ensemble de ce processus est appelé biogénèse mitochondriale. Il semble que leur croissance soit constante et indépendante du cycle cellulaire chez les mammifères, mais que la réplication de leur ADN et la transcription soit principalement effective en fin de phase S et G2193 où les précurseurs d’ADN et d’ARN sont synthétisés. Elles se divisent en deux groupes aléatoires lors d’une mitose et sont transmises à la descendance dans le règne animal par le gamète femelle uniquement196, les mitochondries apportées par le gamète male étant ubiquitinées pour dégradation ultérieure. Cette dernière caractéristique, ajouté au fait que la fréquence de mutations sur le génome mitochondrial soit uniforme dans le temps (1.665 × 10−8 mutations par nucléotide par an)197, permet de faire des datations de lignées assez précises et des études de filiation maternelle. Cependant, une certaine hétérogénéité (hétéroplasmie) peut également être observée parmi l’ensemble des mitochondries d’un même organisme, voire à l’échelle du chondriome de la cellule, notamment à un âge avancé où les mutations se sont accumulées.

Table des matières

I. Introduction bibliographique
1. Les cancers du pancréas
1.1. Le pancréas
1.2. Le cancer du pancréas
Epidémiologie
Symptômes
Facteurs de risques
1.3. Mutations retrouvées dans le cancer du pancréas
Les lésions prénéoplasiques
1.4. Diagnostic de la maladie
Imagerie et classification par grade
Classification moléculaire
Pistes en développement pour l’aide au diagnostic
1.5. Les traitements actuels
1.5.1. Protocoles de traitement
1.5.2. Les principales chimiothérapies
Le FOLFIRINOX
Le nab-paclitaxel
La gemcitabine
Mécanisme d’action et de résistance à la gemcitabine
2. La cytidine désaminase
2.1. Définition de la CDA
2.2. Structure de la CDA
Structure de la CDA
Variants génétiques
2.3. Fonction de la CDA
Le recyclage des pyrimidines
La synthèse de novo des pyrimidines
Autres enzymes de recyclage de la famille des désaminases
2.4. Localisation de la CDA
2.5. Régulation de l’expression de la CDA
Niveau d’expression tissus-spécifique de la CDA
Mécanismes de régulation transcriptionnelle de la CDA
2.6. Régulation de l’activité de la CDA
Polymorphismes activateurs et réducteurs de l’activité de la CDA
Régulation post-traductionnelle
Régulation par le pool de nucléotides
2.7. Inhibiteurs pharmacologiques de la CDA
2.8. Importance fonctionnelle de la CDA dans les pathologies
Le syndrome de Bloom
Le rôle de la CDA dans la chimiorésistance
2.9. Stratégies thérapeutiques impliquant la CDA
3. Le métabolisme énergétique tumoral
3.1. La reprogrammation énergétique tumorale
3.1.1. L’effet Warburg
3.1.2. Organisation et structure du métabolisme mitochondrial
a. Les mitochondries
La biogénèse mitochondriale
La réplication de l’ADNmt
b. L’oxydation phosphorylante
c. Les modifications mitochondriales dans les cancers
Mutations des gènes nucléaires codant des protéines mitochondriales
Mutations des gènes mitochondriaux
Les ROS
Le stress réplicatif mitochondrial
Problèmes de dynamique mitochondriale
3.1.3. La glutaminolyse
Le cycle de Krebs
La synthèse de glutathion
La synthèse de nucléotides
Autres utilisations du groupement amine γ de la glutamine
Autres fonctions de la glutamine
3.1.4. Activation des voies anaboliques
3.2. La régulation du métabolisme énergétique
3.2.1. Le rôle des oncogènes et des suppresseurs de tumeur dans la modulation du métabolisme énergétique
Oncogènes
Suppresseurs de tumeurs
L’activation de HIF
Les mutations d’enzymes métaboliques responsables de la reprogrammation énergétique
3.2.2. Le rôle de l’environnement tumoral
3.2.3. Les traitements ciblant le métabolisme énergétique
3.3. Particularités métaboliques du cancer du pancréas
4. Hypothèses initiales et objectifs de la thèse
II. Résultats
1. Contexte de l’étude
2. Résultats
3. Conclusion
III. Discussion
Annexe

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