Physiopathologie de l’hyperreactivite bronchique et de l’asthme

l’adventice

Elle est constituée d’un tissu conjonctif soutenant l’arbre bronchique et dans lequel cheminent les vaisseaux et nerfs allant aux voies aériennes.

la tunique fibro-musculo-cartilagineuse

Elle connait quelques différences régionales dans sa constitution.
Au niveau de la trachée et des bronches souches, l’armature est très développée et est constituée d’un empilement d’anneaux cartilagineux en fer à cheval qui permettent de maintenir la béance du conduit. Les bords libres postérieurs sont réunis par des fibres musculaires lisses organisées en bandelettes et du tissu conjonctif qui constitue le ligament annulaire de la trachée et la paroi membraneuse. Les fibres musculaires lisses constituent un muscle bronchoconstricteur.
Au niveau des bronches intra pulmonaires, la structure est globalement identique avec cependant quelques modifications :
– la structure cartilagineuse est fragmentée en îlots cartilagineux reliés entre eux par du tissu conjonctif et du muscle lisse
– les bandelettes musculaires s’organisent progressivement de manière à former une structure circulaire.
Cette organisation permettra des mouvements tridimensionnels des bronches pendant le cycle respiratoire tout en maintenant leur béance.
Au niveau des bronchioles, l’armature ne contient théoriquement plus d’éléments cartilagineux et le tissu conjonctif est organisé en tube. Les fibres musculaires lisses y sont organisées en anneaux concentriques permettant de régler le calibre des conduits. C’est le muscle de Reissessen.
Ces conduits dépourvus de cartilage et logés dans le parenchyme pulmonaire sont ainsi soumis aux forces de traction du poumon et de la cage thoracique.

LE MUSCLE LISSE DES VOIES AERIENNES

Le muscle lisse des voies aériennes est réparti tout le long de l’arbre trachéo bronchique depuis la trachée jusqu’aux bronchioles terminales. Au niveau de la trachée, il est organisé en faisceaux transversaux à la partie postérieure. Puis, à mesure que le calibre bronchique se réduit, le tissu musculaire devientprédominant et les faisceaux sont organisés en hélices qui portent le nom demuscle de Reissessen.
Comme toutes les cellules musculaires lisses (CML), les cellules musculaires lisses des voies aériennes (CMLVA) présentent des caractéristiques communes à toutes les CML et des caractéristiques propres. Les cellules musculaires lisses des voies aériennes sont allongées, fusiformes, de 5 à 50µm de diamètre, avec un noyau central. Elles contiennent un appareil de golgi et un réticulum endoplasmique granuleux près du noyau et des lysosomes. Les mitochondries sont aussi situées près du noyau. Les mitochondries sont en quantité faible et permettent une production d’ATP de l’ordre de 10% de celle du muscle squelettique. Le réticulum sarcoplasmique paraît peu développé et représente seulement deux à cinq pour cents du volume cellulaire total, bien qu’il joue un rôle fonctionnel important.
Du point de vue ultrastructural, la membrane, constituée d’une bi-couche de phospholipides, n’est pas différente de la membrane plasmique d’autres typescellulaires. Elle est recouverte, notamment chez l’homme, d’une membran e basale épaisse [70]autour de laquelle sont présentes des fibres de collagène et d’élastine ainsi que de la fibronectine et de la laminine.
La cellule musculaire lisse est dépourvue de la striation caractéristique des cellules musculaires striées car les myofilaments sont orientés en diagonale par rapport au grand axe de la cellule et constituent un réseau diffus. Chaque myofilament est formé d’une succession de filaments d’actine (4 à 7 nm d’épaisseur) et de filaments de myosine (12 à 20 nm). Les myofilaments sont ancrés en deux points opposés du corps cellulaire sur la membrane. Ils sont également fixés au cytosquelette par des points d’ancrage denses aux électrons appelés corps denses visibles en microscopie électronique. Il y existe également des protéines associées aux filaments fins d’actine : la caldesmone et la calponine. Ce sont des protéines qui inhibent l’activité ATPasique de la myosine. Lorsqu’elles sont phosphorylées, elles perdent cette propriété inhibitrice et participent ainsi à l’augmentation de la sensibilité de l’appareil contractile.
La membrane plasmique forme des invaginations superficielles ou caveolaequi communiquent avec le milieu extérieur et sont associées au réticulum sarcoplasmique et aux mitochondries. Les caveolae joueraient un rôle proche de celui des tubules T du muscle strié pour ce qui concerne les transferts du calcium de l’extérieur au réticulum sarcoplasmique et ils confèrent à la CMLVA un aspect très irrégulier.
Les membranes plasmiques de cellules musculaires adjacentes dans les voies aériennes s’accolent pour former des jonctions intercellulaires, soit de types «intermédiaire», soit de type «gap». Les «gap-junctions» qui pourraient permettre un couplage électrique de cellule à cellule, ont une densité relativement importante au niveau du muscle trachéal chez l’homme, et disparaissent à partir des bronches de la 4 ème génération.

Système inhibiteur non adrénergique

C’est le seul système nerveux bronchodilatateur chez l’homme. Son existence fonctionnelle a été démontrée chez l’homme après stimulation in vivo, les systèmes adrénergiques et cholinergiques ayant été bloqués. Des réflexes d’origine laryngée peuvent entrainer sa mise en action chez l’animal et chez l’homme. Enfin le système NANC inhibiteur interviendrait dans la régulation de la sécrétion du mucus. Son action se fait grâce à différents neuropeptides : Le Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) et ses dérivés. Le VIP entraine une relaxation des muscles lisses bronchiques in vitro, qui n’est pas modifiée par des substances antagonistes des systèmes cholinergiques et adrénergiques. Il a été localisé dans le poumon humain sur les terminaisons nerveuses, adjacentes aux muscles lisses bronchiques, autour des glandes sous muqueuses sur les vaisseaux bronchiques et pulmonaires. De même, il existe des récepteurs au VIP dans tout le poumon.
Le VIP ou les peptides apparentés (Peptide Histidine Isoleucine PHI, peptide Histidine Méthionine PHM, PHV 42 dérivé du PHI) peuvent être détruits par les enzymes libérées par les cellules de l’inflammation dans l’asthme, et cette dégradation favoriserait l’action des nerfs cholinergiques dans le sens d’une réponse bronchospastique exagérée. L’absence de terminaisons nerveuses VIPergiques a été rapportée chez certains asthmatiques. Le dosage plasmatique du VIP est possible et au cours d’une attaque d’asthme, le dosage plasmatique du VIP est significativement inférieur à celui mesuré chez des sujets sains. Ces constatations sont certainement secondaires à la libération massive de médiateurs plutôt qu’à une anomalie primitive à la base de l’hyperréactivité bronchique des asthmatiques.
Après l’injection intraveineuse, il a un effet bronchodilatateur faible chez l’asthmatique. Ce paradoxe peut être expliqué par la difficulté d’accès de cette grosse molécule aux récepteurs, la dégradation enzymatique rapide « in situ » et la limitation des doses injectées liée aux effets cardiovasculaires (vasodilatation).
Le NANC inhibiteur exercerait une modulation de l’effet cholinergique plutôt qu’un effet bronchodilatateur direct.

Système bronchoconstricteur non cholinergique

Ce système aurait comme neurotransmetteurs les tachykinines, et le Calcitonine Gene Related Peptide (CGRP), libérés par les terminaisons nerveuses sensitives des fibres C bronchiques. Les tachykinines constituent une famille de peptides inflammatoires parmi laquelle deux contractent le muscle lisse respiratoire humain: il s’agit de la substance P (SP) et de la Neurokinine A (NKA) qui agissent respectivement sur les récepteurs NK1 et NK2.
Le CGRP est colocalisé avec les tachykinines dans les neurones sensitifs. Il contracte le muscle lisse bronchique humain par action sur deux récepteurs probablement spécifiques car son action est insensible à celle des autres agents bronchoconstricteurs.

MECANISMES DE LA CONTRACTION DU MUSCLE LISSE

Le muscle lisse des voies aériennes est l’un des effecteurs principaux de la réactivité bronchique. Dans le muscle lisse des voies aériennes, comme dans beaucoup d’autres cellules excitables, l’ion calcium joue le rôle de second messager et la variation
de la concentration en calcium libre cytoplasmique contrôle le fonctionnement de l’appareil contractile. Classiquement, on distingue deux mécanismes de couplage excitation-contraction [38, 178]. Dans beaucoup de muscles lisses, un potentiel d’action de nature calcique, c’est-à-dire un potentiel lié à l’influx de calcium extracellulaire, précède la contraction. Ce couplage entre variation de potentiel de membrane et contraction est appelé couplage électromécanique.
D’autre part, des messagers extracellulaires peuvent entrainer une contraction indépendamment d’une variation de potentiel de membrane et le couplage est alors appelé pharmacomécanique ou chimiomécanique.

COUPLAGE ELECTROMECANIQUE

Les canaux ioniques qui permettent l’établissement de courants ioniques transmembranaires dans la cellule musculaire lisse des voies aériennes sont de deux types : calcique et potassique [131]. Des expériences de potentiel imposé par la technique du « patch-clamp» ont précisé les caractéristiques de ces canaux. Il n’existe qu’un seul type de canal calcique dépendant du potentiel dans le muscle lisse bronchique (Figure 12). La valeur seuil d’ouverture du canal est d’environ -30 à -20 mV et l’amplitude du courant calcique entrant est maximale lorsque le potentiel de membrane atteint +10 à +20 mV. Le courant entrant est modulé par les dihydropyridines. Il est notamment bloqué par les dérivés de la nifédipine.
Un canal potassique dépendant du potentiel (KDR pour « delayed rectifier») contribue à stabiliser le potentiel de membrane et à limiter la dépolarisation lorsque s’établit un courant sortant d’ions K + .
La dépolarisation membranaire active un courant K + sortant qui tend à limiter la dépolarisation de la membrane.
Des canaux K + sont activés par l’augmentation de Ca ++ intracellulaire liée au relargage du calcium des compartiments intracellulaire au cours de l’interaction agoniste-récepteurs.

CELLULES ET MEDIATEURS DE L’INFLAMMATION BRONCHIQUE DE L’ASTHME

Cellules de l’inflammation

Lymphocytes

L’infiltrat inflammatoire dans l’asthme est caractérisé par le recrutement et l’activation de lymphocytes et d’éosinophiles. Le lymphocyte T module la réponse immunologique. Lorsqu’il est activé, le lymphocyte libère de nombreuses cytokines qui vont s’impliquer dans les interactions cellulaires et vont à leur tour recruter et activer d’autres cellules inflammatoires notamment les éosinophiles [78,101, 102]. Il existe deux populations de lymphocytes T auxiliaires (helper) : TH1 et TH2 très importantes dans tous les types d’asthme.

Polynucléaires éosinophiles

Ils possèdent une capacité pro-inflammatoire très importante dans l’asthme. Ils sont nombreux, leur cytoplasme contient de nombreux granules chargés de protéines à pH très alcalin (ECP ou Eosinophilic Cationic Protein, MBP ou Major Basic Protein, EPO ou eosinophil peroxidase, EDN ou eosinophil derived neurotaxin). Les éosinophiles et leurs protéines sont présents dans le liquide de lavage broncho alvéolaire de sujets souffrant d’asthme même léger. Il existe cependant une corrélation positive entre leur nombre et l’intensité de l’HRB.
L’éosinophile libère aussi le Platelet Activating Factor (PAF) et les leucotriènes, notamment C4 , qui provoquent la contraction des muscles bronchiques, augmentent la perméabilité des vaisseaux et favorisent le recrutement et l’activation d’autres éosinophiles. L’éosinophile semblerait aussi impliqué dans la libération de cytokines plus particulièrement les interleukines qui, par le recrutement et l’activation d’autres cellules, entretiennent l’inflammation.

Mastocytes

Les mastocytes sont des cellules essentielles dans tous les processus inflammatoires. Peu de mastocytes existent au niveau de l’épithélium pulmonaire mais ils sont suffisants pour déclencher la réaction allergique.
Localisée da ns la muqueuse du tractus respiratoire, cette cellule possède des récepteurs de haute affinité pour les immunoglobulines E et est en majeure partie responsable de la réaction allergique immédiate. Ils emmagasinent et produisent une grande quantité de médiateurs (histamine, leucotriènes, prostaglandines, PAF) qu’ils libèrent après stimulation antigénique ou d’autre origine. L’activation des mastocytes déclenche le processus de dégranulation des mastocytes et la libération de médiateurs tels que l’histamine ou la prostaglandine D2 qui exercent un effet bronchoconstricteur, d’autres médiateurs interviennent en recrutant ou en activant d’autres cellules (éosinophiles, neutrophiles…) qui vont entretenir les phénomènes inflammatoires.

Macrophages alvéolaires

Ils sont présents au niveau de tout l’arbre aérien, à la surface des muqueuses bronchiques ou bronchiolaires. Leur activation se fait grâce à leur récepteur de faible affinité (FCεR2).
Par ailleurs, les macrophages participent activement au remodelage permanent du parenchyme pulmonaire de l’asthmatique en libérant des facteurs de croissance et des protéases.
Polynucléaires neutrophiles : Ils jouent un rôle dans la réaction inflammatoire. Lors de la dégranulation mastocytaire, la libération de LTB4 et NCFA attire un polynucléaire neutrophile vers le site de l’inflammation. Le polynucléaire neutrophile va à son tour libérer des médiateurs (LTB4 et le PAF) qui attirent et activent le polynucléaire éosinophile.

Animaux

L’espèce animale utilisée lors de nos expérimentations a été le rat Wistar mâle.
Les animaux ont été maintenus dans des cages dont la litière était renouvelée fréquemment pour éviter tout risque d’irritation des voies aériennes par les déjections ou la poussière.
Les rats ont été hébergés dans une pièce aérée de l’animalerie du laboratoire de toxicologie de la Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontologie de l’Université Cheikh Anta Diop de Dakar avec une température ambiante comprise entre 25 et 30°C.
Les rats avaient accès à l’eau à volonté et leur alimentation était composée essentiellement de granulés à base de farine de maïs et de poisson.

METHODOLOGIE

Extraction du matériel végétal

Broyage

Les plantes ont été broyées à l’aide d’un broyeur RM 100 (pour l’obtention d’une faible granulométrie) et un broyeur de marque Moulinex (pour obtenir une poudre fine).

Macération

Les poudres de plantes ont été macérées pendant 2 heures dans un mélange d’alcool à 60% :100g de poudre pour 300ml de Méthanol (MeOH) et 200ml d’eau distillée en prenant soin de remuer le ballon toutes les 15 min.
Après les 2 heures de macération, nous avons filtré le macérat sous vide à l’aide de la fiole de Kissato et de l’entonnoir. L’extrait méthanolique ainsi obtenu a été évaporé à l’aide du rotavapor jusqu’à obtention d’un résidu sec qui a étéconservé au réfrigérateur et nous a servi à réaliser les tests in vitro.

CARACTERISATION BIOLOGIQUE

Après la mise en marche du système d’organe isolé, nous avons procédé aux étapes suivantes :

Sacrifice du rat et isolement de la trachée cervicale

Après anesthésie au Pentobarbital sodique par voie intra péritonéale (60mg/Kg), nous avons ouvert la cavité abdominale et réalisé une exsanguination par rupture de l’aorte abdominale.
Puis la paroi cervicale antérieure du rat a été ouverte et les muscles du cou sectionnés pour exposer la trachée qui a été prélevée par abord postérieur en longeant l’œsophage pour préserver l’intégrité du muscle lisse trachéal. La trachée a été plongée dans du liquide physiologique de Krebs et ensuite nettoyée sous loupe binoculaire de tous les tissus connexes. Elle a ensuite été découpée en quatre segments égaux d’environ 3 à 4mm de long.

CARACTERISATION DES EFFETS ANTI RADICALAIRES OU ANTI OXYDANTS

Un radical libre est une espèce chimique possédant un électron non apparié. Les espèces radicalaires dérivées de l’oxygène sont connues pour leur toxicité dans l’organisme. Elles sont à l’origine du stress oxydant dont l’importance dans de nombreuses maladies en l’occurrence inflammatoires a été largement démontrée. La composante oxydative dans l’asthme a été décrite par de nombreux auteurs [39, 166, 191, 199,…] et sa prise en charge permetd’améliorer les stratégies préventives ou thérapeutiques de cette pathologie.
Le radical superoxyde O 2- provient de la réduction monoélectronique de l’oxygène. Le radical Hydroxyle quant à lui (OH.) est produit à partir de la dismutation de l’eau oxygénée en présence de cations métalliques (réaction de Fenton) c’est l’un des radicaux les plus dommageables des espères réactives de l’oxygène.
Les dommages du stress oxydant peuvent être limités par les molécules antioxydantes qui sont capables de capter les radicaux libres et sont d’autant plus efficaces qu’elles peuvent être régénérées in vivo.
Nous nous sommes ainsi intéressés aux potentielles propriétés anti oxydantes des composés naturels utilisés dans le traitement de l’asthme.
Pour ce faire, nous avons d’abord préparé des extraits végétaux enrichis à partir de deux plantes parmi celles qui se sont révélé les plus actives au cours des testsde réactivité trachéale.

Inflammation des voies aériennes par instillation intra nasale de LPS

La souris est endormie par injection intra péritonéale de 150µL de l’anesthésique léger.
Lorsque la souris est endormie, la tenir verticalement dans la main en maintenant la tête puis instiller 12,5 µL de solution de LPS à 40µg/ml dans chaque narine.
La maintenir verticale après l’instillation pendant quelques secondes pour éviter le reflux du liquide puis la remettre dans sa cage en position semi verticale sur la litière et attendre son réveil.
Les effets de l’inflammation peuvent être étudiés au bout de 24 heures après l’instillation intra nasale par la réalisation du lavage broncho alvéolaire.

Table des matières
PREMIERE PARTIE : INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1 : PROBLEMATIQUE ET JUSTIFICATIONS DE L’ETUDE
CHAPITRE 2 : RAPPELS ANATOMO HISTOLOGIQUES SUR L’ARBRE AERIEN 
II.1. L’ARBRE AERIEN
II.1.1. ANATOMIE
II.1.1.1. Voies aériennes supérieures
II.1.1.2. Voies aériennes inférieures
II.1.2. HISTOLOGIE DES VOIES AERIENNES
II.1.2.1. l’adventice
II.1.2.2. la tunique fibro-musculo-cartilagineuse
II.1.2.3. la muqueuse
II.2. LE MUSCLE LISSE DES VOIES AERIENNES
II.3. INNERVATION DE L’ARBRE BRONCHIQUE
II.3.1. SYSTEME CHOLINERGIQUE
II.3.2. SYSTEME ADRENERGIQUE
II.3.3. SYSTEME NON ADRENERGIQUE NON CHOLINERGIQUE
II.3.3.1. Système inhibiteur non adrénergique
II.3.3.2. Système bronchoconstricteur non cholinergique
CHAPITRE 3 : RAPPELS PHYSIOLOGIQUES
III.1. LA BRONCHOMOTRICITE
III.1.1. RECEPTEURS ET MEDIATEURS IMPLIQUES DANS LA BRONCHOMOTRICITE
III.1.1.1. Récepteurs
III.1.1.2. Médiateurs
III.2. MECANISMES DE LA CONTRACTION DU MUSCLE LISSE
III.2.1. COUPLAGE ELECTROMECANIQUE
III.2.2. COUPLAGE PHARMACO-MECANIQUE
CHAPITRE 4 : PHYSIOPATHOLOGIE DE L’HYPERREACTIVITE BRONCHIQUE ET DE L’ASTHME
IV.1. L’HYPERREACTIVITE BRONCHIQUE
IV.2. L’ASTHME
IV.2.1. SIGNES DE L’ASTHME
IV.2.1.1. Obstruction bronchique
IV.2.1.2. Hypersécrétion de mucus
IV.2.1.3. Réaction inflammatoire bronchique
IV.3. CELLULES ET MEDIATEURS DE L’INFLAMMATION BRONCHIQUE DE L’ASTHME
IV.3.1. Cellules de l’inflammation
IV.3.2. Médiateurs
CHAPITRE 5 : ASTHME ET PLANTES 
DEUXIEME PARTIE 
TRAVAIL PERSONNEL 
CHAPITRE 6 : APPROCHES EXPERIMENTALES
VI.1. MESURE DE LA REPONSE TRACHEALE INDUITE PAR DIFFERENTS AGONISTES CONTRACTILES
VI.1.1. MATERIEL UTILISE
VI.1.1.1. Appareillage
VI.1.1.2. Agents pharmacologiques
VI.1.1.4. Matériel Végétal
VI.1.1.5. Animaux
VI.1.2 METHODOLOGIE
VI.1.2.1. Extraction du matériel végétal
VI.1.3. CARACTERISATION BIOLOGIQUE
VI.1.3.1. Sacrifice du rat et isolement de la trachée cervicale
VI.1.3.2. Réactivité trachéale
VI.2. CARACTERISATION DES EFFETS ANTI RADICALAIRES OU ANTI OXYDANTS
VI.2.1. MATERIEL UTILISE
VI.2.1.1. Matériel d’extraction
VI.2.1.2. Matériel des tests anti radicalaires
VI.2.2. PREPARATION DES EXTRAITS ENRICHIS
IV.2.3. TEST RADICAL HYDROXYLE
VI.2.4. TEST RADICAL SUPEROXYDE
VI. 3. ETUDE DE LA MODULATION DE LA CELLULARITE DU LIQUIDE DE LAVAGE BRONCHOALVEOLAIRE
VI.3.1. MATERIEL
VI.3.2 : PREPARATION DES SOLUTIONS DE TRAVAIL
VI.3.3. MODELE D’INFLAMMATION INDUITE CHEZ LA SOURIS
VI.3.3.1. Randomisation et traitement des animaux
VI.3.3.2. Inflammation des voies aériennes par instillation intra nasale de LPS
VI.3.4. PROTOCOLE DU LAVAGE BRONCHO ALVEOLAIRE CHEZ LA SOURIS
VI.3.5. COMPTAGE CELLULAIRE SUR LAME DE NEUBAUER
VI.4. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE PRELIMINAIRE
CHAPITRE 7: RESULTATS
ARTICLE 1: PUBLIE
In vitromodulation of tracheal smooth muscle reactivity by extracts of some Senegalese medicinal plants
ARTICLE 2: SOUMIS
Differential inhibition of agonists-induced tracheal contraction after in vitro enriched-extracts treatment
ARTICLE 3 : EN PREPARATION
Abstract soumis
Inhibition de la production de radicaux libres dérivés de l’oxygène et modulation de la cellularité broncho-alvéolaire par des bioactifs naturels dans un modèle d’inflammation des voies aériennes
CHAPITRE 8 : DISCUSSION 
VIII. 1. DISCUSSION SELON LES APPROCHES METHODOLOGIQUES
VIII.2. DISCUSSION SELON LES RESULTATS
CONCLUSION 
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES 
ANNEXE 1 : MONOGRAPHIES DES PLANTES 
ANNEXE II : CHROMATOGRAMMES (HPLC) DES EXTRAITS Guiera senegalensis et Hymenocardia acida

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