Soutenance mémoire
Physiopathologie de l’asthme (hypersensibilté de type I)
L’inflammation asthmatique est la conséquence de mécanismes complexes avec des interactions entre les cellules de la paroi bronchique, les cellules immuno-compétentes, les cellules de l’inflammation (essentiellement polynucléaires éosinophiles, mais aussi neutrophiles) ainsi que les médiateurs libérés par ces cellules (histamine, leucotriènes, prostaglandines) et le système nerveux autonome (BOULET, 1997 ; PIN, 2004). La réaction d’hypersensibilité chez les asthmatiques est de type I (ou immédiate), c’est-à-dire médiée par les IgE, et implique une série de réactions de la part du système immunitaire menant à une anaphylaxie pulmonaire. Ainsi, lorsqu’un individu atopique inhale un antigène exogène (allergène), ce dernier entre en contact avec des cellules présentatrices de l’antigène (CPA), c’est-à-dire les cellules dendritiques, les macrophages, les éosinophiles et les lymphocytes B. Ces cellules captent l’allergène, et après lyse intracellulaire, associent les peptides dérivés de l’antigène aux molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH) II et les présentent à leur surface.
Les CPA migrent ensuite vers les ganglions lymphatiques « locaux », où elles interagissent avec les cellules T naïves, de manière à induire leur différenciation en cellules Th2, qui sécrètent des cytokines dont l’IL-4, l’IL-5, et l’IL-13. Ces cytokines jouent un rôle important dans la division et la différentiation (activation) des lymphocytes B producteurs d’IgE spécifiques. Les anticorps sécrétés se répartissent ensuite dans l’ensemble de l’organisme, via la circulation sanguine, et se fixent sur le récepteur à haute affinité pour le fragment Fc des IgE ou FcεRI situé à la surface à des cellules inflammatoires (mastocytes et basophiles) (BLANC, 2008 ; ROBERT et al., 2011 ; PLE et al., 2012 ; SCARINO, 2012). L’inhalation d’un allergène par un sujet sensibilisé aboutit à une bronchoconstriction et une inflammation bronchique, représentés par les réactions immédiate et tardive (Figure 1).
Réponse initiale de la réaction asthmatique
La réponse initiale de la réaction asthmatique survient dans les premières minutes suivant le contact entre l’hôte et l’allergène. Celle-ci est principalement caractérisée par la libération de divers médiateurs de la part des mastocytes, agissant sur les tissus ayant été en contact avec l’allergène. Les médiateurs proviennent de trois mécanismes distincts, tous résultant de la cascade de réactions intracellulaires faisant suite à la liaison croisée (ou pontage) des récepteurs FcεRI en présence de l’allergène (Figure 2). Tout d’abord, les granules cytoplasmiques migrent, à travers le cytosquelette, vers la membrane plasmique pour fusionner avec cette dernière et libérer leur contenu vers le milieu extracellulaire. Le résultat de cette dégranulation est la libération de plusieurs composés, tels que les amines biogéniques (histamine, sérotonine), des cytokines, des facteurs de croissances et des protéases (CAUGHEY, 2007). Ensuite, la phosphatidylcholine, présente dans la membrane plasmique, est clivée par la phospholipase A2, produisant l’acide arachidonique. Ce dernier est métabolisé en prostaglandine D2 et en leucotriène A4, deux puissants médiateurs lipidiques agissant en faveur d’une bronchoconstriction, d’une vasodilatation et de l’accumulation de mucus au niveau des bronches. Le facteur d’agrégation plaquettaire (PAF), un autre médiateur lipidique, peut également être sécrété par les mastocytes (BOYCE, 2007 ; FINKELMAN, 2007). Enfin, la cascade de réactions intracellulaires impliquant entre autre les voies RAS, RAF, MEK et ERK peut stimuler la transcription de certains gènes et ainsi promouvoir la formation de protéines telles que les cytokines et les chimiokines. Ces dernières sont, entre autre, responsables de la migration, vers le site affecté, de leucocytes, impliqués dans la phase tardive de la réaction asthmatique. Lorsque libérés localement tous les médiateurs contribuent aux effets néfastes associés à la réponse initiale, c’est-à-dire une augmentation de la perméabilité vasculaire, une vasodilatation, une bronchoconstriction et le recrutement leucocytaire. Par contre, la libération rapide de ces mêmes médiateurs au niveau systémique provoque une réaction globale beaucoup plus sévère, appelée anaphylaxie (SCARINO, 2012).
Réponse tardive de la réaction asthmatique
La réponse tardive n’apparait que quelques heures suivant le contact entre l’allergène et l’hôte et est caractérisée par l’afflux pulmonaire de globules blancs, notamment les neutrophiles et les éosinophiles. L’accumulation de ces derniers est facilitée par la sécrétion de cytokines par les mastocytes, qui augmentent l’expression des molécules d’adhésion cellulaires au niveau des cellules endothéliales (MUNITZ et LEVI-SCHAFFER, 2004 ; GALLI et al., 2008). Les granulocytes peuvent d’ailleurs demeurer dans les poumons pendant de nombreuses heures, voir même des journées, et contribuent au maintien de l’inflammation. La liaison croisée des récepteurs stimule également la synthèse de nouvelles cytokines, chimiokines et facteurs de croissance qui seront libérés plus lentement durant la réponse tardive. De plus, de nouvelles protéines (ex. protéine basique majeure ou MBP) sont introduites dans les voies aériennes par l’arrivée des granulocytes pouvant causer des lésions aux cellules épithéliales et, en retour, ces dernières peuvent sécréter d’autre médiateurs contribuant au maintien de l’inflammation (RIVERA et GILFILLAN, 2006 ; SCHLEIMER et al., 2007).
Marqueurs de l’asthme allergique
Acteurs cellulaires
❖ Cellules épithéliales des voies respiratoires
Sous la stimulation des allergènes et/ou des microbes (virus, bactéries, champignons), les cellules épithéliales libèrent les cytokines comme TLSP, IL-25, GM-CSF qui déclenchent et amplifient les réponses immunitaires caractéristiques (HAMMAD et LAMBRECHT, 2008 ; BARRETT et AUSTEN, 2009).
❖ Cellules mastocytaires
Elles sont localisées dans la muqueuse du tractus respiratoire et jouent un rôle clé dans la physiopathologie de l’asthme. Elles possèdent sur leurs membranes des FcεRI qui permet la fixation des allergènes et active ces cellules par déclenchement instantané de la libération de plusieurs cytokines (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF, IFN-γ et TNF) et d’autres médiateurs dont l’histamine, la PGD2, le LTC4 et la tryptase (GOSSELIN, 2001 ; BERGER et TUNON DE LARA, 2007).
❖ Éosinophiles
Ces cellules contiennent les enzymes inflammatoires, produisent des leucotriènes, et expriment une large variété de cytokines pro-inflammatoires. L’IL-3, l’IL-5 et le GM CSF favorisent le développement, la maturation, l’activation et la survie des éosinophiles qui sont attirés au niveau du site inflammatoire (BACH et CHATENOUD, 2002 ; PETSKY et al., 2007). Les éosinophiles activés, par l’IL-5 ou le PAF, libèrent des protéines cationiques cytotoxiques, comme : l’ECP (eosinophil cationic protein), la MBP (major basic protein), l’EPO (eosinophil peroxidase) et l’EDN (eosinophil-derived neurotoxin). A celles-ci s’ajoutent la libération de radicaux libres, d’éicosanoides (LTC4), de cytokines de type Th2 (IL-4, IL-5), de facteurs de croissance, d’élastase et des métalloprotéinases matricielles (MMP-9) (GOSSELIN, 2001).
❖ Neutrophiles
Chez les individus asthmatiques allergiques, et suite à la provocation allergénique, les neutrophiles sont les premiers globules blancs qui s’infiltrent dans les voies respiratoires (TERAN et al., 1995). Ces cellules ont la capacité de synthétiser de nombreux médiateurs comme les prostaglandines, les thromboxanes, le LTB4 et le PAF (SIBILLE et REYNOLDS, 1990). L’un des rôles principaux de ces cellules dans la pathogénèse de la réponse asthmatique est le remodelage des voies aériennes (BATRA et al., 2004).
• Basophiles
Les basophiles ont une expression élevée des récepteurs de l’IL-33 T1/ST2 et produisent, en réponse à cette cytokine, de l’IL-4, de l’IL-6, de l’IL-13 et de l’histamine (SCHNEIDER et al., 2005). Les basophiles peuvent également amplifier les réponses Th2 en produisant de l’histamine qui inhibe la réponse Th1 (SCHNEIDER et al., 2004).
• Cellules dendritiques
Ces cellules fonctionnent comme des cellules présentatrices d’antigènes qui interagissent avec des allergènes de la surface des voies aériennes et migrent alors aux ganglions lymphatiques régionaux pour agir avec les cellules régulatrices et pour stimuler finalement la production des cellules Th2 à partir des cellules T naïves (KUIPERS et LAMBRECHT, 2004).
• Macrophages
Les macrophages sont les cellules les plus nombreuses dans les voies aériennes et peuvent également être activées par des allergènes grâce aux récepteurs d’IgE de faible affinité FcεRII pour libérer les médiateurs inflammatoires et cytokines qui amplifient la réponse inflammatoire (PETERS-GOLDEN, 2004).
• Lymphocytes T
Les cellules T activées jouent un rôle important dans l’asthme. Pendant une longue période, la réponse des lymphocytes T dans l’asthme a été interprétée dans le cadre du fameux paradigme Th1/Th2 dans lequel le développement des cellules Th2 est considéré comme capital et essentiel dans le développement de l’asthme allergique. La participation des cellules T dans la pathogenèse de l’asthme allergique a été élargie pour inclure la contribution des cellules T régulatrices (Treg), des lymphocytes NKT et de la sous population T nouvellement décrite, Th17 (PHAM VAN, 2010).
• Lymphocytes B
Les cellules B jouent un rôle important dans les maladies allergiques, y compris l’asthme allergique, par la synthèse des IgE spécifiques aux allergènes. Chez la souris, les cytokines de type Th2, l’IL-4 ou l’IL-13, stimulent la commutation isotypique vers l’IgG1 et vers l’IgE (DEFRANCO et al., 2009). Chez l’homme, l’IL-4, induit la commutation vers l’IgE et vers un isotype d’IgG (IgG4) qui interagit d’une manière peu efficace avec les récepteurs RFcγ et active faiblement le complément. Ces anticorps se fixent rapidement à leurs récepteurs de haute affinité (FcεRI) présents essentiellement sur les mastocytes et les basophiles (PHAM VAN, 2010).
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Table des matières
INTRODUCTION
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I. L’ASTHME ALLERGIQUE
1. Epidémiologie de la maladie
2. Facteurs impliqués dans l’expression et le développement de la maladie
2.1. Influence génétique
2.2. Influence de l’environnement
3. Physiopathologie de l’asthme (hypersensibilité de type I)
3.1. Réponse initiale de la réaction asthmatique
3.2. Réponse tardive de la réaction asthmatique
4. Marqueurs de l’asthme allergique
4.1. Acteurs cellulaires
4.2. Médiateurs de l’inflammation asthmatique
5. Symptômes de l’asthme et traitement
CHAPITRE II. LE STRESS OXYDANT ET L’ASTHME ALLERGIQUE
1. Définition
2. Stress oxydant et asthme allergique
3. Génération endogène et exogène des marqueurs du stress
4. Déséquilibre entre les système oxydants et antioxydants dans l’asthme
5. Lutte phyto-thérapeutique contre le stress oxydant
CHAPITRE III. LES METABOLITES SECONDAIRES D’ORIGINE VEGETALE
1. Composition chimique
1.1. Les terpénoïdes
1.2. Les alcaloïdes
1.3. Les composés phénoliques
2. Méthodes d’étude des métabolites secondaires
2.1. Techniques d’extraction
2.1.1. Extraction par distillation
2.1.2. Extraction par expression à froid
2.1.3. Extraction par solvant organique
2.1.4. Extraction par fluide à l’état supercritique
2.2. Techniques d’identification
2.2.1. Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
2.2.2. Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
2.2.3. Spectrométrie de masse (MS)
2.2.4. Spectrophotométrie UV-visible
2.2.5. Résonance magnétique nucléaire (RMN)
2.2.6. Spectrométrie infrarouge
3. Activités biologiques
3.1. Activité anti-oxydante
3.2. Activité anti-inflammatoire
3.3. Activité antiasthmatique
3.4. Activité antimicrobienne
PARTIE EXPERIMENTALE : BUT ET OBJECTIFS
CHAPITRE I. MATERIEL ET METHODES
1. ETUDE DE LA COMPOSITION CHIMIQUE ET DES PROPRIETES ANTI-OXYDANTES DE LA PLANTE CHOISIE
1.1. Monographie de la plante étudiée (Pistacia lentiscus)
1.2. Cueillette et extraction du matériel végétal
1.3. Dosages colorimétriques des composés phénoliques
1.3.1. Dosage des phénols totaux
1.3.2. Dosage des flavonoïdes totaux
1.3.3. Dosage des tanins condensés
1.4. Evaluation de l’activité antioxydante in vitro
1.4.1. Etude de l’activité antioxydante : Méthode DPPH
1.4.2. Etude de l’activité antioxydante : Méthode NBT
1.4.3. Etude de l’activité antioxydante : méthode ABTS
2. ETUDE DES ACTIVITES BIOLOGIQUES IN VIVO
2.1. Animaux et conditions d’élevage
2.2. Protocole expérimental
2.2.1. Formation des lots et traitements des rats
2.2.2. Sensibilisation des rats
2.2.3. Provocation des animaux par aérosols
2.3. Sacrifice et prélèvement des organes
2.3.1. Prélèvement sanguin
2.3.2. Technique du lavage broncho-alvéolaire
2.3.3. Prélèvement des organes
2.3.4. Préparation des homogénats de tissus
2.3.5. Préparation des lysats d’érythrocytes
2.4. Dosage des protéines totales
2.5. Dosage ELISA de l’IL-4
2.6. Dosage des paramètres hématologiques
2.7. Formule leucocytaire
2.7.1. Formule leucocytaire dans le sang
2.7.2. Formule leucocytaire dans le liquide du LBA
2.8. Etude histologique
2.8.1. Fixation
2.8.2. Enrobage et obtention des blocs
2.8.3. Confection des coupes
2.8.4. Coloration et montage
2.9. Dosage des paramètres du stress oxydant
2.9.1. Dosage du Malondialehyde (MDA)
2.9.2. Dosage de l’activité enzymatique du glutathion peroxydase (E.C. 1.11.1.9)
2.9.3. Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase (E.C.1.15.1.1)
2.9.4. Dosage de l’activité enzymatique de la catalase (E.C.1.11.1.6)
3. TRAITEMENT STATISTIQUE
CHAPITRE II. RESULTATS & DISCUSSION
1. LA COMPOSITION CHIMIQUE & LES PROPRIETES ANTIOXYDANTES DES DEUX EXTRAITS DE PISTACIA LENTISCUS
1.1. Dosage des composés phénoliques
1.2. Activité antioxydante
1.3. Etude des corrélations
Discussion
2. LES ACTIVITES BIOLOGIQUES DES DEUX EXTRAITS DANS UN MODELE D’ASTHME EXPERIMENTAL VARIATIONS DES PARAMETRES PHYSIO-HEMATOLOGIQUES & HISTOLOGIQUES
2.1. Etude du poids corporel et des poids absolu et relatif des organes
2.1.1. Variation de la croissance corporelle
2.1.2. Effet sur le poids corporel, le poids relatif et absolu des organes
2.2. Etude des paramètres de la réponse inflammatoire
2.2.1. Effet sur les paramètres hématologiques
2.2.2. Effet sur la population leucocytaire
2.2.2.1. Taux des leucocytes dans le sang
2.2.2.2. Numération des leucocytes dans le liquide du LBA
2.2.3. Dosage des protéines totales
2.2.3.1. Les protéines totales dans le sérum
2.2.3.2. Les protéines totales dans le liquide du LBA
2.2.4. Dosage de l’interleukine-4
2.2.4.1. L’IL-4 dans le sérum
2.2.4.2. L’IL-4 dans le liquide du LBA
2.2.5. Etude histologique
Discussion
VARIATIONS DES PARAMETRES DU STRESS OXYDANT
2.3. La glutathion peroxydase
2.4. La catalase
2.5. La superoxyde dismutase
2.6. La peroxydation lipidique (dosage du malondialdehyde)
2.7. Etude de la corrélation entre les paramètres mesurés
2.7.1. Corrélations entre les paramètres in vivo
2.7.2. Corrélations entre les paramètres in vivo versus in vitro
Discussion
CONCLUSION
