PHYSIOPATHOLOGIE DE LA TUBERCULOSE

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Identification de la cible du TMC207

L’identification de la cible du TMC207 a été faite par notre équipe en collaboration avec Andries et collègues (Andries, Verhasselt et al. 2005). Pour cela, des mutants résistants au TMC207 issu de deux espèces, M. tuberculosis et M. smegmatis, ont été sélectionné in vitro. Les génomes de ces mutants résistants ont été entièrement séquencés et comparés aux génomes des souches sauvages. Les seules mutations identifiées dans les souches résistantes sont deux mutations ponctuelles (une pour chaque espèce) dans le gène atpE qui code pour la sous-unité c de l’ATP synthase. Les modifications en acides aminés correspondantes étaient A63P dans la sous-unité c de M. tuberculosis et D32V dans celle de M. smegmatis (Figure 10). L’ATP synthase qui est l’enzyme responsable de la synthèse d’ATP cellulaire a donc été proposée pour être la cible du TMC207.
Suite à ce travail préliminaire, d’autres travaux ont été menés afin de caractériser la cible du TMC207. D’autres mutations ont été identifiées dans la sous-unité c de l’ATP synthase à partir d’autres mutants résistants au TMC207 sélectionnés in vitro. Les mutations D28G, E61D, A63P et I66M (Figure 10) ont été identifiées dans les mutants de M. tuberculosis (Andries, Verhasselt et al. 2005; Petrella, Cambau et al. 2006; Huitric, Verhasselt et al. 2010).
La sous-unité c de l’ATP synthase est extrêmement conservée parmi les espèces mycobactériennes (Figure 10) et tous les résidus impliqués dans la résistance au TMC207 touchent des résidus conservés dans les différentes espèces, à l’exception du résidu en position 63 (Figure 10). L’amplification et le séquençage du gène atpE de M. xenopi par notre équipe a montré la présence d’un polymorphisme à cette position par rapport aux autres espèces mycobactériennes (Figure 10) (Petrella, Cambau et al. 2006). Cette modification d’une Ala en Met à la position 63 existe aussi dans deux autres espèces, M. novocastrense et M. shimoidei (Huitric, Verhasselt et al. 2007). Or, ces trois espèces, M. xenopi, M. novocastrense et M. shimoidei sont les seules espèces mycobactériennes naturellement résistantes au TMC207, le polymorphisme Ala63M pouvant expliquer ce phénomène.

Etudes chez la souris

Les études réalisées chez la souris ont permis d’établir les caractéristiques essentielles du TMC207 dans le cadre du traitement de la TB. Administré en monothérapie le TMC207 est plus actif que n’importe quel drogue en monothérapie et il est aussi efficace que la trithérapie rifampicine-isoniazide-pyrazinamide (Andries, Verhasselt et al. 2005; Ibrahim, Andries et al. 2007).
L’association avec les antibiotiques de première ligne et de deuxième ligne a donné des résultats très encourageants, et il a été montré que la durée du traitement peut être drastiquement réduite grâce au TMC207 (Lounis, Veziris et al. 2006; Ibrahim, Andries et al. 2007; Ibrahim, Truffot-Pernot et al. 2009).
L’effet bactéricide du TMC207 est modeste dans la première semaine, mais il devient important dans les trois semaines successives (Lounis, Gevers et al. 2008). Les bactéries ont probablement une réserve d’ATP dans la cellule qui fait que le TMC207 n’est actif qu’après 4-7 jours de son utilisation.
Il existe une synergie entre le TMC207 et le pyrazinamide, ainsi qu’une interaction avec la rifampicine (Andries, Verhasselt et al. 2005; Ibrahim, Andries et al. 2007).

Etudes chez le cochon d’Inde

Le cochon d’Inde a été utilisé comme deuxième modèle animal pour étudier l’activité du TMC207. Le cochon d’Inde a l’avantage, par rapport à la souris, de développer une TB très similaire à celle de l’homme avec la formation de granulomes. Dans ce modèle, le TMC207 a montré une capacité stérilisatrice (Lenaerts, Hoff et al. 2007).

Etudes chez l’homme

Les phases clinique I, 81 volontaires sains, et II, monothérapie pendant 7 jours chez des patients malades de TB jamais traités, n’ont pas mis en évidence d’effets adverses du TMC207. Si l’activité bactéricide initiale du TMC207 est plus faible que celle de l’isoniazide et de la rifampicine, elle augmente progressivement pour devenir identique à celle de deux autres drogues de première ligne aux jours 4-7. Le TMC207 a été considéré sûr et bien toléré, sans effets collatéraux importants (Andries, Verhasselt et al. 2005; Rustomjee, Diacon et al. 2008). Une étude avec des patients atteints de MDR-TB jamais traités a également donné des résultats très encourageants : le TMC207 n’a pas causé d’effets secondaires graves, il a été bien toléré, et, ajouté au traitement standard pour les MDR-TB, la négativation des cultures est plus rapide que celle obtenue pour le traitement standard (Diacon, Pym et al. 2009).
Le TMC207 est aujourd’hui en autorisation temporaine d’utilisation chez des patients sur lesquels aucun des autres traitements antituberculeux ne fonctionne.
Il est également envisagé de le tester en l’associant à des antirétroviraux afin de déterminer si le TMC207 peut être utilisé chez les patients VIH-positifs.

Le TMC207 et les bactéries en phase non-réplicative

La durée très longue du traitement de la TB est due à la présence d’une sous-population de bacilles en hypoxie qui sont capables de survivre dans un état de croissance lente, voire nulle, pendant de longues périodes, et qui sont donc difficiles à éliminer par les antituberculeux classiques. La rifampicine et la moxifloxacine par exemple ont une activité 50 fois moins forte contre les bactéries non-réplicatives, et l’isoniazide et l’éthambutol sont complètement inactifs. Toute la chaîne respiratoire des mycobactéries, y compris l’ATP synthase, est sous-régulée pendant la phase non-réplicative de dormance (Rao, Alonso et al. 2008; Bald and Koul 2010). Le niveau d’ATP cellulaire est inferieur de 90% par rapport aux bactéries en phase active de réplication, mais l’ATP est toujours indispensable à la bactérie et l’ATP synthase reste active et fonctionnelle (Koul, Vranckx et al. 2008). La synthèse de novo de l’ATP est nécessaire afin de garder la bactérie vivante, les bacilles non-réplicatifs sont donc hautement vulnérables à l’inhibition de l’ATP synthase par le TMC207, même à des concentrations basses en antibiotique (Koul, Vranckx et al. 2008; Gengenbacher, Rao et al. 2010).
Le TMC207 est pour le moment la seule drogue capable de tuer avec la même efficacité les bacilles en phase active de réplication et les bacilles en état de dormance (Koul, Vranckx et al. 2008).

Etudes in vivo sur les autres mycobactéries pathogènes

M. leprae est la bactérie responsable de la lèpre chez l’homme. Cette maladie touche les nerfs périphériques, la peau et les muqueuses, et provoque des infirmités sévères. Les régions du monde les plus touchées par la lèpre sont l’Asie du Sud-est, l’Amérique du Sud et l’Afrique. Le TMC207 a montré une activité bactéricide contre M. leprae, et dans le modèle murin, une seule dose est capable de tuer 95% des bactéries (Ji, Chauffour et al. 2006).
L’ulcère de Buruli est une maladie de la peau rencontrée dans plus de 30 pays du monde, surtout tropicaux. C’est la troisième maladie à mycobactéries après la TB et la lèpre. Elle est causée par M. ulcerans. L’infection entraîne une destruction étendue de la peau et des tissus mous avec la formation d’ulcères de grande dimension, se localisant en général sur la jambe ou le bras. En l’absence de traitement précoce, la maladie peut laisser des incapacités fonctionnelles durables. Dans le modèle murin, le TMC207 est bactéricide contre M. ulcerans, et en association avec la rifampicine, il pourrait devenir un traitement possible contre l’ulcère de Buruli (Ji, Lefrancois et al. 2006).
M. avium est une mycobactérie atypique, pathogène opportuniste chez les patients atteints de SIDA et associée à la maladie de Chron. Le TMC207 a une forte activité in vitro contre M. avium, mais chez la souris, il a un effet bactériostatique et non bactéricide (Lounis, Gevers et al. 2009).

La famille des ATPases

La famille des ATPases contient les F-, A-, V- P-, et E-ATPases. Il s’agit de complexes protéiques composés de plusieurs sous-unités et ancrés à la membrane. Leur mécanisme catalytique est très similaire : elles couplent le transport d’ions à travers la membrane à l’hydrolyse/synthèse d’ATP. Leur structure générale a une forme globale de « champignon », avec un domaine catalytique hydrophile qui lie les nucléotides et un domaine transmembranaire qui agit comme pompe/canal ionique (Muench, Trinick et al. 2011).
Les F-ATPases sont communément appelées ATP synthases, la lettre “F” vient de « phosphorylation Factor ». Elles sont présentes chez les bactéries, les mitochondries et les chloroplastes. Leur fonction principale, comme l’indique leur nom, est la synthèse d’ATP, mais elles peuvent aussi hydrolyser l’ATP dans certaines conditions. Le principal ion transporté est l’ion H+, mais il existe aussi des ATP synthases à Na+ chez quelques bactéries anaérobies (Hicks, Liu et al. 2010).
Les V-ATPases ont été initialement trouvées dans les Vacuoles eucaryotes mais elles sont aussi présentes dans la membrane plasmique bactérienne. Ce sont des pompes à H+ ou à Na+ ATP-dépendant et leur fonction est de permettre l’acidification de la vacuole ou du compartiment extracellulaire par l’hydrolyse de l’ATP. Les enzyme de la famille des V-ATPases sont constituées d’un nombre plus important de sous-unités par rapport aux F-ATPases et, chez certaines bactéries, elles peuvent également permettre la synthèse d’ATP (Nakanishi-Matsui, Sekiya et al. 2010).

L’ATP synthase : généralités et place dans la cellule

Paul D. Boyer définit l’ATP synthase comme « une machine moléculaire splendide ». Il s’agit d’une enzyme très complexe, avec au moins 20 sous-unités parmi lesquelles plus de la moitié sont membranaires. Cette enzyme unique, essentielle à la vie, est étudiée depuis longtemps mais pose encore un nombre important de questions non résolues.
Le mécanisme unique de l’ATP synthase est l’utilisation du transfert de protons ou d’ions Na+ à travers la membrane selon leur gradient électrochimique, FPM (Force Proton Motrice) ou FSM (Force Sodium Motrice), afin de produire de l’ATP. Ce mécanisme, proposé par Peter Mitchell en 1961 et appelé « couplage chimio-osmotique » (Mitchell 1961), implique la présence d’une membrane imperméable aux ions et constamment énergisée.
L’activité de l’ATP synthase dans la cellule se fait en collaboration avec des pompes à H+ ou à Na+ (Figure 13), qui permettent de maintenir le gradient électrochimique (Cross and Taiz 1990). Chez les organismes hétérotrophes, les enzymes de la chaîne respiratoire réduisent le NADH et le succinate et utilisent l’oxygène comme accepteur final d’électrons ; l’énergie libérée est convertie en gradient protonique. Les chloroplastes et les bactéries phototrophiques utilisent l’énergie lumineuse pour produire le gradient protonique à travers la membrane tandis que les organismes anaérobies le couplent aux réactions de décarboxylation. Ce gradient de H+ ou de Na+ fournit l’énergie nécessaire à l’ATP synthase pour synthétiser l’ATP à partir d’ADP et Pi (von Ballmoos, Wiedenmann et al. 2009).

Structure du domaine FO de l’ATP synthase

Le domaine Fo contient les canaux permettant le transfert des ions à travers la membrane. Ce domaine est composé des sous-unités ab2c8-15 (Figure 12A et 14). Il s’agit d’un complexe protéique membranaire extrêmement hydrophobe. Les protéines membranaires étant encore aujourd’hui des protéines difficiles à manipuler, il existe à ce jour peu de structures des différentes sous-unités de FO (voir annexe 4 pour les codes PDB des structures résolues) et nous avons donc peu d’information sur leur conformation tridimensionnelle et sur leurs contacts au sein du domaine. Nous avons donc peu d’information sur le mécanisme d’action général de FO.

La sous-unité a

Il n’existe pour le moment aucune structure de la sous-unité a. Grâce à des expériences de mutagénèse dirigée, d’analyses de cross-linking et à des modèles basés sur l’homologie de séquence, il a été montré que cette protéine est composée de cinq hélices transmembranaires, avec une extrémité N-terminale située dans le périplasme et une extrémité C-terminale dans le cytoplasme (Muench, Trinick et al. 2011). Les deux boucles hydrophiles positionnées dans le cytoplasme sont importantes pour l’activité de l’enzyme, et les deux boucles périplasmiques sont indispensables pour l’assemblage de la sous-unité a. Les hélices α4 et α5 sont probablement en contact avec deux sous-unités c adjacentes. L’acide aminé Arg210 (numérotation E. coli) de l’hélice α4 a été identifié comme résidu clé de la sous-unité a, indispensable pour l’interaction avec la sous-unité c et le transfert des protons au travers de FO (Vik and Ishmukhametov 2005).

La sous-unité b

La sous-unité b est organisée en homodimère (il existe deux gènes différents chez le chloroplaste) et lie le domaine FO au domaine F1. Comme pour la sous-unité a, aucune structure complète n’a été déterminer à ce jour, même si nous avons à notre disposition des structures partielles : le domaine membranaire et une partie du domaine soluble (codes PDB 2CLY, 1B9U, 1L2P). Avec une structure hélicoïdale, son domaine N-terminal membranaire est situé à coté de la sous-unité a, tandis que le domaine C-terminal lie le domaine F1 et en particulier les sous-unités α et δ (Figure 12A). Son rôle n’est pas encore complètement clair mais l’hypothèse la plus probable est que grâce à sa flexibilité elle fasse principalement un lien élastique entre F1 et FO pendant la synthèse d’ATP (Dunn, Revington et al. 2000).

Transformation de M. smegmatis pour les tests de complémentation

La souche sauvage de M. smegmatis mc2155 a été transformée par électroporation avec 50 ng des différents plasmides utilisés dans les tests de complémentation. Les bactéries transformées sont cultivées dans du milieu BHI additionné de 0.5% Tween80 et incubées 2 heures à 37°C avant de les étaler sur un milieu BHI-Tween agar contenant 100 μg/ml de zéocine. Les colonies apparaissent après 3-4 jours à 37°C. La présence du plasmide recombinant dans les colonies obtenues a été vérifiée par amplification et séquençage du gène atpE à partir d’amorces spécifiques du plasmide d’intérêt.

Transformation de M. smegmatis pour les tests d’inactivation

Les souches de M. smegmatis ont été transformées avec environ 2 μg du produit d’amplification par PCR de la cassette d’inactivation purifiés par Microcon 100 (Millipore), ou avec 100 ng du plasmide suicide non-traité, ou avec le vecteur traité selon différents méthodes : 50 ng ou 100 ng du vecteur traité 20, 50 ou 90 seconds aux UV 1 μl ou 3 μl d’environ 1 μg du vecteur traité à la soude selon Hinds J, et al. (Hinds, Mahenthiralingam et al. 1999) 2 μg du vecteur linéarisé avec NotI ou avec BglII.
Les colonies transformées ont été incubées 3 heures à 37°C sous agitation avant d’être étalées sur une gélose BHI-Tween80 contenant 100 μg/ml de zéocine, permettant la sélection des clones contenant le vecteur de complémentation pLYG204.zeo, et 12 μg/ml de kanamicine, permettant la sélection des colonies inactivées. Le nombre de copie du gène aph étant inferieur quand il est inséré dans le génome par rapport à quand il est porté par le plasmide, nous avons choisi de sélectionner les clones inactivés avec 12 μg/ml de kanamicine (concentration bactéricide pour M. smegmatis sauvage) même si une souche de M. smegmatis qui porte un vecteur contenant le gène aph est résistante à 100 μg/ml de kanamicine.
Trois souches de M. smegmatis complémentées ont été transformées : la souche complémentée avec la sous-unité c sauvage, la souche complémentée avec la sous-unité c mutée à la position 63 (A63P) et la souche complémentée avec la sous-unité c mutée à la position 66 (I66M).

Mesure de la CMI pour les clones résistants au TMC207

La concentration minimale inhibitrice (CMI) du TMC207 a été mesurée pour les colonies de M. tuberculosis, M. fortuitum, M. smegmatis résistantes à la drogue et mutées dans la sous-unité c, et pour toutes les colonies de M. abscessus (mutées et non mutées dans la sous-unité c). Les bactéries ont été cultivées sur un milieu 7H11-OADC contenant des concentrations croissantes de TMC207 variant entre 0.0007 μg/ml et 64 μg/ml. Les géloses ont été incubées à 30°C (pour M. fortuitum, M. smegmatis et M. abscessus) ou à 37°C (pour M. tuberculosis) pendant 6-40 jours (6-12 jours pour M. fortuitum, M. smegmatis et M. abscessus, 30-40 jours pour M. tuberculosis).

Mesure de la CMI pour les souches de M. smegmatis complémentées

Pour les tests de complémentation, les souches de M. smegmatis complémentées avec une sous-unité c mutée ont été cultivées à 37°C dans du milieu BHI-Tween jusqu’à une DO600 de 0.7-0.8 (5-8 h). 100 μl de culture ont ensuite été étalés sur un milieu agar BHI-Tween additionné de 100 μg/ml de zéocine et de concentrations croissantes de TMC207 (entre 0.0007 μg/ml et 32 μg/ml). Les géloses ont été incubées à 37°C pendant 5 jours.

Amplification de la région de régulation de l’opéron atp des clones de M. abscessus et M. tuberculosis résistantes au TMC207

Le site de fixation de BlaI dans la région de régulation de l’opéron atp de M. tuberculosis a été identifié par Sala et al. (Sala, Haouz et al. 2009). Le site homologue chez M. abscessus a été identifié par recherche de séquences homologues dans le génome de la bactérie (ID NCBI CU458896 http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Un couple d’amorces a été construit pour chaque espèce (aoabsS et aoabsAS pour M. abscessus et aoBKS et aoBKAS pour M. tuberculosis) afin d’amplifier environ 600 pb contenant ce site :
aoabsS : TCTATGGGTGGCGATCATCGCC.
aoabsAS : GAAGACGCCGAACTGCCACTG.
aoBKS : CATCGGCGCGTGGTCCTGATCAT.
aoBKAS : CCAAGAACATCCCGACCGTCAGG.

Amplification des gènes rv1846c, rv1845c, mab_2414 et mab_2415 des souches de M. abscessus et M. tuberculosis résistantes au TMC207

Les gènes rv1846c et rv1845c sont respectivement les homologues de blaI et blaR identifiés chez M. tuberculosis par Sala et al. (Sala, Haouz et al. 2009). Nous avons identifié leurs homologues chez M. abscessus par homologie de séquence protéique en utilisant BLASTP (Basic Local Alignment Search Tool – alignement d’une séquence protéique contre une base de données protéiques, http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Les gènes correspondants sont respectivement mab_2415 et mab_2414 pour blaI et blaR. Deux couples d’amorces ont été construites afin d’amplifier et de séquencer les différents gènes. Pour M. tuberculosis nous avons utilisé les amorces Rv1846c_S et Rv1846c_S pour amplifier le gène rv1846c, et les amorces Rv1845c_S et Rv1845C_AS pour le gène rv1845c. Pour M. abscessus nous avons utilisé les amorces MAB_2415_S et MAB_2415_AS pour le gène mab_2415, et les amorces 2MAB_2414_S et 3MAB_2415_AS pour le gène mab_2414 :
Rv1846c_S : TACGCTGGTTTCAACCCGCAGG.
Rv1846c_S : ATGGTGAAGGCCAGCGCGGCAC.
Rv1845c_S : ATGGCAATCGGCCACCGGCT.
Rv1845c_AS : CGAACTCATGTCCTGCCTTTCAG.
MAB_2415_S : GATGTAGTACGGCATTGCGTCG.

Southern Blot pour l’analyse des clones de M. smegmatis obtenus lors des tests d’inactivation du gène atpE

Les colonies de M. smegmatis recombinantes obtenues dans les tests d’inactivation du gène atpE ont été analysées par Southern Blot. L’ADN génomique de chaque colonie recombinante a été extrait comme décrit dans le paragraphe 2.3.1 du matériel et méthodes et digéré avec BclI. Les sondes utilisées sont les produits d’amplification du gène atpB, du gène aph, et d’une portion du vecteur pCR2.1-TOPO. La position d’hybridation des trois sondes sur le génome de M. smegmatis sauvage ou sur le génome inactivé, ainsi que sur le plasmide utilisé pour l’inactivation après digestion, est présentée sur la Figure 30. Pour la sonde s’hybridant sur le gène aph, l’obtention d’un signal est possible dans deux cas : (1) si le gène atpE est inactivé par la cassette contenant le gène aph, nous obtiendrons un signal correspondant à un fragment de génome d’environ 2100 pb (Figure 30B), (2) si le plasmide d’inactivation est présent dans nos clones, la sonde pourra s’hybrider sur un des gènes aph porté par ce plasmide et un signal correspondant à un fragment d’environ 5000 pb sera obtenu (Figure 30C). Pour la sonde s’hybridant sur le gène atpB, l’obtention d’un signal est possible dans trois cas : (1) si le gène atpE chromosomique n’a pas été inactivé, nous obtiendrons un signal correspondant à un fragment d’environ 1200 pb (Figure 30B), (2) si le gène atpE chromosomique a été inactivé, nous obtiendrons un signal correspondant à un fragment d’environ 2100 pb (Figure 30B), (3) si le vecteur pTOPOcassette est présent, nous obtiendrons un signal correspondant à un fragment d’environ 5000 pb (Figure 30C). Enfin, la sonde s’hybridant dans le vecteur pTOPOcassette permet d’obtenir un signal correspondant à un fragment d’environ 5000 pb si ce dernier est contenu dans le génome des clones testés.

Table des matières

INTRODUCTION
1. LES MYCOBACTERIES
1.1. CLASSIFICATION DES MYCOBACTERIES
1.2. CARACTERISTIQUES BACTERIOLOGIQUES DES MYCOBACTERIES
1.3. PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DU GENOME DES MYCOBACTERIES
1.4. ENVELOPPE MYCOBACTERIENNE
2. LA TUBERCULOSE
2.1. NOMBRE DE CAS ET LOCALISATION DANS LE MONDE
2.2. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA TUBERCULOSE
2.3. LE TRAITEMENT DE LA TUBERCULOSE
2.3.1. Antibiotiques de première ligne et leur mode d’action
2.4. LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES
2.4.1. Resistance naturelle
2.4.2. Resistance acquise
2.4.3. MDR-TB et XDR-TB
2.4.3.1. MDR-TB
2.4.3.2. XDR-TB
2.4.3.3. Traitement des cas de MDR-TB et XDR-TB
3. LES NOUVEAUX ANTIBIOTIQUES ET LE TMC207
3.1. LES NOUVEAUX ANTITUBERCULEUX
3.2. LE TMC207
3.2.1. Identification de la cible du TMC207
3.2.2. Essais cliniques
3.2.2.1. Etudes chez la souris
3.2.2.2. Etudes chez le cochon d’Inde
3.2.2.3. Etudes chez l’homme
3.2.3. Le TMC207 et les bactéries en phase non-réplicative
3.2.4. Etudes in vivo sur les autres mycobactéries pathogènes
4. ATP SYNTHASE
4.1. LA FAMILLE DES ATPASES
4.2. L’ATP SYNTHASE : GENERALITES ET PLACE DANS LA CELLULE
4.3. STRUCTURE DU DOMAINE F1 DE L’ATP SYNTHASE
4.3.1. Les sous-unités α et β
4.3.2. La sous-unité γ
4.3.3. La sous-unité δ
4.3.4. La sous-unité ε
4.4. STRUCTURE DU DOMAINE FO DE L’ATP SYNTHASE
4.4.1. La sous-unité a
4.4.2. La sous-unité b
4.4.3. La sous-unité c
4.5. MECANISME D’ACTION DE L’ATP SYNTHASE
4.5.1. La synthèse de l’ATP via le domaine F1
4.5.2. Le transfert des ions via le domaine FO
4.5.3. La synthèse de l’ATP via le domaine F1 se fait grâce au transfert des ions via le domaine FO
4.6. L’ATP SYNTHASE DES MYCOBACTERIES
4.6.1. La chaîne respiratoire mycobactérienne
4.6.2. Caractéristiques de l’ATP synthase mycobactérienne
4.6.3. Régulation de l’ATP synthase mycobactérienne
4.6.4. Régulation de l’ATP synthase dans les bacilles en phase de dormance
5. OBJECTIFS DU PROJET
MATERIEL ET METHODES
1. TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
1.1. SELECTION DES MUTANTS RESISTANTS AU TMC207
1.2. PREPARATION DES CELLULES ELECTROCOMPETENTES
1.3. TRANSFORMATION PAR ELECTROPORATION DE M. SMEGMATIS
1.3.1. Transformation de M. smegmatis pour les tests de complémentation
1.3.2. Transformation de M. smegmatis pour les tests d’inactivation
1.4. CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE (CMI) DU TMC207
1.4.1. Mesure de la CMI pour les clones résistants au TMC207
1.4.2. Mesure de la CMI pour les souches de M. smegmatis complémentées
2. TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
2.1. AMPLIFICATIONS PAR POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
2.1.1. Amplification des gènes atpE et atpB des clones résistants au TMC207
2.1.2. Amplification de l’opéron atp de M. tuberculosis
2.1.3. Amplification de la région de régulation de l’opéron atp des clones de M. abscessus et M. tuberculosis résistantes au TMC207
2.1.4. Amplification des gènes rv1846c, rv1845c, mab_2414 et mab_2415 des souches de M. abscessus et M. tuberculosis résistantes au TMC207
2.1.5. Analyse des clones de M. smegmatis obtenus dans le cadre de l’inactivation du gène atpE
2.2. SEQUENÇAGE DES PRODUITS D’AMPLIFICATION
2.3. SOUTHERN BLOT
2.3.1. Southern Blot pour déterminer le nombre de copie du gène atpE dans le génome de M. smegmatis et M. tuberculosis
2.3.2. Southern Blot pour l’analyse des clones de M. smegmatis obtenus lors des tests d’inactivation du gène atpE
2.3.3. Transfert des fragments de la digestion sur une membrane et hybridation de la sonde
2.4. LES CLONAGES
2.4.1. Les vecteurs pLYGatpEsme et pLYGatpEBK : clonage du gène atpE de M. smegmatis et de M. tuberculosis dans le vecteur pLYG204.zeo pour les tests de complémentation
2.4.1.1. Amplification du gène atpE de M. smegmatis et de M. tuberculosis
2.4.1.2. Premier clonage dans le vecteur pMOSBlue
2.4.1.3. Clonage dans le vecteur pLYG204.zeo
2.4.2. Clonage du gène atpD de M. smegmatis dans le vecteur pLYG204.zeo pour les tests d’expression et purification de l’ATP synthase : vecteur pLYGatpDsme6H
2.4.3. Clonage du gène atpE de M. tuberculosis dans le vecteur pET29a pour les tests d’expression et purification de l’ATP synthase : vecteurs pET29atpEBK et pET29atpEBK6H77
2.4.4. Clonage du gène atpE de M. tuberculosis dans le vecteur pET28a pour les tests d’expression et purification de l’ATP synthase : vecteur pET28atpEBK6H
2.5. MUTAGENESE DIRIGEE
2.5.1. Mutagénèse dirigée des vecteurs de la complémentation génique
2.5.2. Mutagénèse dirigée pour la construction d’un plasmide d’expression de la sous-unité c de M. smegmatis avec un His-Tag
2.6. CONSTRUCTION D’UNE CASSETTE D’INACTIVATION DU GENE ATPE DE M. SMEGMATIS
2.6.1. Amplification de 1000 pb en amont et en aval du gène atpE de M. smegmatis et amplification du gène aph
2.6.1. Long-flanking homology (LFH)- PCR
2.7. CONSTRUCTION D’UN VECTEUR D’INACTIVATION
2.7.1. Première stratégie pour la construction du vecteur suicide
2.7.1.1. Clonage de la cassette d’inactivation dans le vecteur pCR2.1-TOPO
2.7.1.2. Clonage de la cassette d’inactivation dans le vecteur pGOAL19
2.7.2. Deuxième stratégie pour la construction du vecteur suicide
2.7.2.1 Amplification de 1000 pb aux extrémités du gène atpE de M. smegmatis et amplification du gène aph
2.7.2.2. Clonage dans le plasmide pCR2.1-TOPO
2.7.2.3. Clonage dans le vecteur p2NIL
2.7.2.4. Insertion des autres marqueurs de sélection dans le plasmide p2NIL contenant la cassette d’inactivation
2.8. REVERSE TRANSCRIPTION – PCR EN TEMPS REEL
2.8.1. Extraction de l’ARN total de M. abscessus
2.8.2. Réaction de RT-PCR en temps réel – TaqMan
2.8.3. Analyse des résultats de RT-PCR en temps réel
3. TECHNIQUES DE BIOLOGIE STRUCTURALE
3.1. CONSTRUCTION DU MODELE STRUCTURAL DE L’ANNEAU DE SOUS-UNITE C MYCOBACTERIEN
3.2. DOCKING DU TMC207 DANS LES MODELES
4. TECHNIQUES DE PURIFICATION DES PROTEINES MEMBRANAIRES
4.1. EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA SOUS-UNITE C DE M. TUBERCULOSIS
4.1.1. Expression hétérologue chez E. coli et purification de la sous-unité c de M. tuberculosis avec ou sans un His-Tag
4.1.2. Expression in vitro de la sous-unité c de M. tuberculosis
4.1.3. Expression hétérologue chez E. coli et purification de la sous-unité c de M. tuberculosis sous forme d’une protéine de fusion avec la Maltose Binding Protein
4.1.3.1. Production de la protéine
4.1.3.2. Purification de la protéine
4.1.3.3. Digestion de la protéine de fusion MBP-His-suc avec la thrombine
4.1.3.4. Digestion de la protéine de fusion His-MBP-suc avec la protéase TEV
4.2. EXPRESSION ET PURIFICATION DE L’ATP SYNTHASE DE M. SMEGMATIS
4.2.1. Expression homologue de la sous-unité c de M. smegmatis chez M. smegmatis sans tag
4.2.2. Expression homologue de la sous-unité c de M. smegmatis chez M. smegmatis avec un His-Tag
4.2.3. Expression homologue de la sous-unité β de M. smegmatis chez M. smegmatis
4.3. PRECIPITATION DES PROTEINES A L’ACIDE TRICHLOROACETIQUE (TCA)
4.4. WESTERN BLOT
4.5. BLUE NATIVE (BN) – PAGE
5. TECHNIQUES DE BIOPHYSIQUE
5.1. LA CRISTALLISATION
5.1.2. Principe de la cristallisation
5.1.2. Test de cristallisation de la protéine de fusion MBP+His-suc
5.1.3. Test de cristallisation de l’ATP synthase de M. smegmatis
5.2. LA SPECTROMETRIE DE MASSE
5.2.1. Principe de la spectrométrie de masse
5.2.2. MALDI-TOF
5.2.3. NanoLC-ESI-MS/MS
5.2.4. Préparation de l’échantillon pour la spectrométrie de masse
5.2.5. Analyse des résultats obtenus en spectrométrie de masse
5.3. MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
5.3.1. Principe de la microscopie électronique
5.3.2. Préparation des échantillons pour la microscopie électronique et analyses des images
ETUDE DE LA RESISTANCE AU TMC207
1. ETUDE DES MUTANTS RESISTANTS AU TMC207
2. COMPLEMENTATION GENIQUE
3. INACTIVATION DU GENE ATPE
4. UN AUTRE MECANISME DE RESISTANCE ?
5. MODELES STRUCTURAUX DES ANNEAUX C DE M. TUBERCULOSIS ET DE M. SMEGMATIS
6. DOCKING DU TMC207 DANS LE MODELE DE L’ANNEAU DE SOUS-UNITES C DE M. TUBERCULOSIS
EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA SOUS-UNITE C DE L’ATP SYNTHASE MYCOBACTERIENNE
1. LES PROTEINES MEMBRANAIRES
2. LES DETERGENTS
3. EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA SOUS-UNITE C DE M. TUBERCULOSIS
4. EXPRESSION ET PURIFICATION DE L’ATP SYNTHASE DE M. SMEGMATIS : PREMIERES ANALYSES EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES
ANNEXE 1 : CARTE DES VECTEURS UTILISES
ANNEXE 2 : SCHEMA DES ETAPES DE LA PURIFICATION D’UNE PROTEINE MEMBRANAIRE
ANNEXE 3 : TABLEAU RECAPITULATIF DES TESTS D’EXPRESSION DE LA SOUS-UNITE C DE M. TUBERCULOSIS CHEZ E. COLI
ANNEXE 4 : CODES PDB DE TOUTES LES STRUCTURES RESOLUES DES SOUS-UNITES DE LA F1FO-ATP SYNTHASE
ANNEXE 5 : PUBLICATION
REFERENCES

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