Physiopathologie de la listériose

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CARACTERES BIOCHIMIQUES

La production d’une catalase est essentielle pour le diagnostic : elle permet de différencier les Listeria des streptocoques.
L’hydrolyse rapide de l’esculine (en 2-3 heures) est un bon élément de présomption pour le genre Listeria.
D’autres caractères biochimiques sont utiles pour distinguer les Listeria des bactéries phénotypiquement proches. La croissance en milieux hostiles (biliés, hypersalés), à pH alcalin (9,6), la réduction du tellurite de potassium à 0,5% et du bleu de méthylène sont des caractères permettant une différenciation avec les autres espèces.
La fermentation du glucose est constante, tandis que celle des autres sucres est variable. Les réactions de Voges Proskaeur (VP) et du rouge de méthyle sont positives.
Par contre L. monocytogenes ne possède pas d’oxydase, ne sécrète pas d’indole à partir du tryptophane, ne dégrade pas l’urée et ne produit pas l’hydrogène sulfuré (SH2).

CARACTERES ANTIGENIQUES (23, 27)

A partir des antigènes somatiques (I à XV) et flagellaires (1 à 5), 17 types sérologiques (sérovars ou sérotypes) sont décrits dans le genre Listeria. En ce qui concerne L. monocytogenes, 13 sérovars sont reconnus et les plus fréquents lors d’infections humaines (95%) sont : 1/2a, 1/2b et 4b. Ces mêmes sérovars sont fréquents chez l’animal. Curieusement, le sérovar 4b qui représente 50% à 70% des souches d’origine humaine, ne correspond qu’à 10 à 20% des souches d’origine alimentaire. IL n’y a pas de corrélation étroite entre l’espèce et le sérovar ni entre le sérovar et la virulence. Le typage est réalisé par agglutination sur lame à l’aide d’antisérums spécifiques.
La lysotypie a un intérêt certain dans la différentiation des souches d’un même sérovar lors d’une épidémie. Les méthodes moléculaires (profils d’isoenzymes, ribotypage, micro-restriction, macro-restriction d’ADN suivies d’électrophorèse en champs pulsés) ont permis d’affiner le diagnostic des listérioses.
En résumé, plusieurs méthodes de typage (sérotypage, lysotypage et génotypage) sont indispensables lorsqu’une comparaison fine des souches est nécessaire.
En dehors des antigènes intervenant dans la classification, L. monocytogenes possède des antigènes de virulence dont les principaux sont :
la protéine de surface P60, responsable de l’adhésion et de la pénétration dans les cellules,
la lystériolysine O : c’est une cytotoxine ayant des similitudes avec la streptolysine O et la toxine tétanique,
l’actine F : elle facilite la pénétration des bactéries dans les cellules adjacentes,
la catalase et la superoxyde dismutase : ils assurent la résistance à l’oxydation entraînée par la pénétration de L. monocytogenes dans les macrophages chargés de la détruire.

SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES

In vitro, L. monocytogenes est généralement sensible à de nombreux antibiotiques tels que: pénicillines, aminosides, érythromycine, vancomycine, triméthoprime-sulfaméthoxazole, rifampicine et tétracyclines. Une résistance naturelle est observée aux céphalosporines de troisième génération (céfotaxime, céfépime), à l’aztréonam, à l’acide nalidixique, à certaines fluoroquinolones et à la fosfomycine (32).
La sensibilité est intermédiaire pour la céfalotine, la ciprofloxacine, le chloramphénicol et la clindamycine. Quelques rares souches sont capables d’acquérir une résistance à la streptomycine, à la kanamycine, à la gentamicine, au triméthoprime, aux tétracyclines ou à la rifampicine.
La résistance à la tétracycline est la plus fréquemment observée chez L. monocytogenes. En revanche aucune souche résistante aux pénicillines n’a été isolée (7, 19, 32).

EPIDEMIOLOGIE

HABITAT

L. monocytogenes est une bactérie saprophyte et ubiquitaire. Dans la nature, elle a été isolée de plusieurs sites : sols, eaux, végétaux (ensilages), légumes (chou, salade). Elle est très résistante dans l’environnement naturel où elle survit dans des conditions hostiles et où elle peut se multiplier à température basse.
L. monocytogenes peut survivre 1 à 2 ans dans le sol (où elle se ne multiplie pas ou très peu) et plusieurs années dans un produit pathologique ou un prélèvement environnemental maintenu à 4°C. La contamination des aliments est favorisée actuellement par le développement de la chaîne du froid.
Le taux de portage intestinal varie de 5 à 30% chez les animaux et chez l’homme. Ainsi 10 à 30% des bovins, ovins, porcins et poulets hébergent naturellement L. monocytogenes et contaminent l’environnement par leur excréments (11, 28, 29, 35). La principale source de contamination des animaux est représentée par les ensilages de mauvaise qualité (à pH bas).
Les taux de contamination des aliments sont variables : 45% pour le lait cru, 41% pour les viandes hachées surgelées, 32% pour les charcuteries crues. La contamination des poissons fumés peut atteindre 60%. Les autres Listeria sont peu retrouvées dans les aliments et sont non pathogènes pour l’homme (23).

TRANSMISSION

La listériose est essentiellement une maladie animale, précisément une saprozoonose. L’homme est contaminé très souvent par voie digestive, rarement par d’autres voies. La transmission se fait principalement sur un mode indirect. L’homme entre en contact avec la bactérie par l’intermédiaire du sol, de l’eau
des excreta d’animaux, des aliments et des végétaux. La contamination directe est rare à partir d’animaux infectés (cas des vétérinaires, éleveurs) ou de l’homme malade.

CARACTERISTIQUE EPIDEMIOLOGIQUE

Les listérioses humaines surviennent en général sous la forme de cas sporadiques.
Bactérie psychrophile, L. monocytogenes sévit dans les pays tempérés où la listériose est endémique. On note cependant des variations saisonnières (automne, printemps) dans la survenue des infections humaines.
Toutes les tranches d’âge sont concernées. Trois pics sont observés : avant l’âge de 1an (listériose néonatale), entre 20 ans et 39 ans (listériose de l’adulte y compris les cas maternels) et après 60 ans (listériose de l’immunodéprimé).
Le terrain sous-jacent joue un rôle important dans la survenue de la maladie chez l’homme: jeune âge, vieillard, immunodéprimé, cancer, grossesse.
Les vétérinaires, éleveurs, techniciens de laboratoire manipulant des produits carnés sont plus exposés au risque de listériose.
Les principaux aliments incriminés avec certitude dans la transmission de L. monocytogenes de l’animal ou de l’environnement à l’homme sont : charcuteries crues : rillettes, viande hachée, langue de porc lait cru, fromage au lait cru.
Le point commun à ces aliments est leur consommation crue ou leur conservation pendant longtemps à basses températures (réfrigération). La dose infectante pour l’homme n’est pas connue avec précision. Il a été cependant constaté que les aliments à l’origine de contamination humaine renfermaient au moins 1000 Listeria par gramme (6, 23).

POUVOIR PATHOGENE NATUREL

Seule L. monocytogenes est pathogène pour l’homme. Les listérioses animales sont dues à L. monocytogenes et L. ivanovii

PHYSIOPATHOLOGIE DE LA LISTERIOSE

Les études menées chez la souris ont permis la compréhension de la physiopathologie de la maladie. Ingérée avec les aliments, L. monocytogenes se fixe sur les entérocytes et les cellules des plaques de Peyer. Après avoir traversé la barrière intestinale, la bactérie est phagocytée par les macrophages et d’autres cellules phagocytaires qui, au lieu de la détruire, l’amènent au foie et à la rate par l’intermédiaire de la lymphe et du sang. Dans le foie, les cellules de Kupffer phagocytent et détruisent 90% des Listeria. Les survivantes infectent alors le foie d’où la lyse des hépatocytes. Deux possibilités s’offrent : si l’individu a une bonne immunité, les macrophages et les polynucléaires neutrophiles détruisent toutes les Listeria ; si l’immunité du sujet est déprimée, les bactéries survivent et gagnent la circulation générale et atteignent le placenta, le cerveau et d’autres organes. Le processus infectieux relève de plusieurs facteurs :
la multiplication intracellulaire de la bactérie : elle met à l’abri des défenses de l’homme, l’hémolysine : elle est responsable des lésions du système réticuloendothélial et de la multiplication intracellulaire du germe. Les souches qui en sont dépourvues ne sont pas virulentes. la catalase et la superoxyde dismutase : elles protègent la bactérie contre la destruction à l’intérieur des macrophages.

LISTERIOSE ANIMALE (18, 23, 31, 34)

Les manifestations cliniques sont variées :
avortement chez les femelles gravides, mammites. septicémies chez les agneaux avant le sevrage, encéphalites chez diverses espèces de ruminants, conjonctivites et kératites,

LISTERIOSE HUMAINE

Elle se résume à deux grands groupes d’infections : les formes foeto-maternelles et néonatales ainsi que les formes de l’adulte.
. Listériose fœto-maternelle (14, 23)
L’infection survient au cours des 6 premiers mois de la grossesse. Elle a alors pour conséquences l’avortement ou la naissance d’un enfant infecté. Chez la femme enceinte, le tableau clinique a une allure pseudo-grippale, sans manifestations neurologiques. Lorsque l’infection intervient après la 28ème semaine de grossesse, elle entraîne la mort in utero (20%), des enfants mort-nés (15%), des enfants nés infectés (40%) et des enfants indemnes (25%). Les enfants nés infectés souffriront de septicémie précoce (granulomatose septique infantile), de méningite aigue à liquide claire ou trouble. D’autres tableaux cliniques peuvent compliquer les formes ci-dessus citées : conjonctivite, anémie
hémolytique, infection respiratoire etc.
. Listériose de l’adulte
Elle revêt volontiers deux formes : les bactériémies et les infections du système nerveux central (méningite, méningo-encéphalite, encéphalite pure). Des formes rares ont été décrites : abcès, arthrite, endocardite, diarrhée….

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

DIAGNOSTIC DIRECT (24, 25)

L’isolement des Listeria est facile dans les produits pathologiques mono-microbiens (LCR, sang) car elles y sont en général abondantes. Par contre dans les aliments, les échantillons de l’environnement et les produits pathologiques poly-microbiens d’origine humaine (selles, sécrétions génitales, gorge….), les
Listeria sont rares et leur isolement nécessite une étape préalable d’enrichissement. De nombreuses techniques d’enrichissement et d’isolement sont proposées.

PRODUITS PATHOLOGIQUES

. Nature des échantillons
La recherche de L. monocytogenes chez l’homme se fait habituellement dans :
le liquide gastrique, le méconium, le LCR et le sang chez les nouveaux nés,
le placenta, les lochies et le liquide amniotique chez la mère,
le sang, le LCR, les selles et les sécrétions génitales chez l’adulte.
Les aliments faisant souvent l’objet d’enquêtes épidémiologiques sont :
les rillettes, la viande hachée, la langue de porc, le foie, le lait cru, le fromage au lait cru ou pasteurisé,
les eaux, les choux, le soja, la salade, le saumon fumé …
Par ailleurs L. monocytogenes peut et doit être recherchée dans les ensilages.
. Transport – Conservation des échantillons
La mise en culture immédiate est souhaitable. En cas de nécessité, le transport sur de longues distances se fera dans une glacière. La conservation au laboratoire se fera au réfrigérateur à 4°C, ce qui favorise un enrichissement préalable de l’échantillon en Listeria.

EXAMEN MICROSCOIPIQUE

Il est indispensable pour les produits pathologiques mono-microbiens (sang, LCR, pus, liquide amniotique). On recherchera de petits bacilles à Gram positif, courts, regroupés en chaînettes. L’examen microscopique des produits poly-microbiens, des aliments et des prélèvements de l’environnement est inutile.

ISOLEMENT DES LISTERIA

• A partir de produits mono-microbiens
Les échantillons seront directement ensemencés sur gélose au sang frais et en bouillon nutritif glucosé à 0.5%. L’étape d’enrichissement préalable est inutile.
• A partir de produits poly-microbiens
Les échantillons de produits pathologiques d’origine humaine, les aliments et les échantillons de l’environnement feront obligatoirement l’objet d’un enrichissement préalable. Ils seront ensuite repiqués sur des géloses sélectives.
De nombreuses études ont été consacrées à ces méthodes d’isolement sélectif. Désormais, pour les coprocultures et la culture des aliments, on recommande l’utilisation des géloses PALCAM ou OXFORD, après enrichissement en bouillon FRASER.

IDENTIFICATION DES LISTERIA

ASPECT DES COLONIES

Elles sont de type S, entourées d’une zone d’hémolyse bêta sur gélose au sang frais.
Sur gélose OXFORD, elles sont bleutées, entourées d’un halo jaune (acidification du xylose). Les colonies des autres espèces de Listeria sont blanches et entourées d’un halo jaune (L. seeligeri, L. welshimeri) ou dépourvues du halo jaune (L. grayi, L. innocua). Sur gélose PALCAM simple ou modifiée, les colonies suspectes sont de couleur verte ou marron foncée, et sont entourées d’un halo noir (hydrolyse de l’esculine). Celles totalement noires sont généralement des entérocoques.

EXAMEN MICROSCOPIQUE APRES CULTURE

Les Listeria peuvent apparaître sous forme de bacilles allongés. Elles se regroupent en palissade (comme les corynébactéries) et peuvent se décolorer comme les bacilles à Gram négatif.
La mobilité caractéristique est observée en bouillon nutritif incubé pendant 4 h à 20-25°C. Ce test simple doit être effectué devant toute suspicion de listériose. En gélose mobilité incubée à 25°C, on obtient une image typique de sapin renversé due au caractère micro-aérophile de la bactérie.

CARACTERES BIOCHIMIQUES (23)

• Caractères d’orientation vers le genre Listeria
l’hydrolyse rapide de l’esculine (2- 3H).
la mobilité caractéristique à 20-25°C
la réduction du lait tournesolé mais pas son acidification la production d’une catalase
la croissance sur milieu bilié ou hypersalé et à pH alcalin.
la réduction du tellurite de potassium à 0.5% et du bleu de méthylène
• Caractères propres à L. monocytogenes
CAMP-TEST positif avec S. aureus et négatif avec R. equi absence d’acidification du mannitol, du xylose et de l’arabinose acidification du glucose, de la salicine et du rhamnose

MILIEUX DE CULTURE ET REACTIFS

• Milieux de culture
Les milieux d’enrichissement : le bouillon FRASER entier a été utilisé. Il favorise la croissance des bactéries Gram positif grâce au chlorhydrate d’acriflavine, à l’acide nalidixique et au citrate de fer ammoniacal III.
Les milieux d’isolement : la gélose PALCAM a été ensemencée. C’est un milieu sélectif contenant du sulfate de polymyxine B, de la ceftazidime et du chlorhydrate d’acriflavine.
Les milieux d’identification : il s’agit de la gélose MH + Na Cl à 6%, de la gélose au sang frais et de galerie « API Listeria ».
Les milieux de conservation des souches : nous avons utilisé le bouillon de FRASER entier et parfois le bouillon cœur cervelle additionné de 15% de glycérol. Les formules et les adresses des fournisseurs de ces milieux sont rapportées en fin de document.
• Réactifs
l’eau oxygénée à 30 volumes : elle est utilisée pour la recherche de la catalase le kit Color Gram de Bio Mérieux : il sert pour la coloration de Gram les réactifs inclus dans les kits « Api Listeria ».

MATERIELS D’APPOINT

. Lames stériles de bistouri
. Balance électronique de précision
.Mortiers en porcelaine + pilons en porcelaine stériles
.Sable de mer lavé et stérilisé pendant 20 minutes à 130°C
. Sachets en plastiques stériles de capacité 500 ml
. Glacières + de la carboglace
. Matériels de base dans un laboratoire de bactériologie

METHODE DE TRAVAIL

PRE-TEST

Avant d’entreprendre ce travail prospectif, nous avons d’abord :
vérifié la qualité et la performance des milieux disponibles,
jugé notre aptitude à isoler L. monocytogenes, à repérer ses colonies sur les milieux avec lesquels nous devons travailler, de même qu’à connaître ses caractères biochimiques sur les galeries « API Listeria ». cerné les difficultés inhérentes à la collecte des échantillons.
• Test de qualité et de performance
A partir des milieux déshydratés, nous avons préparé et stérilisé les géloses au sang frais, PALCAM, MH et le bouillon FRASER.
la souche de référence de L. monocytogenes utilisée provient de l’Afrique du Sud, par le biais de l’ Organisation Mondiale de la Santé. Elle a été fournie par le National Heath Laboratory Service (NHLS), à partir de la Collection du National Stock Culture Collection (NSCC) appartenant au National Institutes for Communicable Diseases (NICD).
le bouillon FRASER a été ensemencé avec cette souche de référence puis incubé pendant 24 heures à 37°C, en aérobiose. Au bout de ce délai, 0,1ml de bouillon fut repiqué sur chacune des géloses suivantes : Palcam, gélose au sang frais, gélose MH.
après une incubation de 24H à 37°C les colonies étaient :
– fines, de type S, entourées d’une hémolyse bêta sur gélose au sang.
– fines, de type S, de couleur marron bleutée, entourées d’un halo noir sur gélose PALCAM.
– fines, de type S sur gélose MH.
la galerie « API Listeria » a confirmé les caractères biochimiques du germe.
• Sortie sur le terrain
Elle a consisté à visiter la SERAS, l’abattoir le « Bignona », les marchés et les cantines « Belle viande ». Au niveau de ces sites, nous avons apprécié l’attitude des « bouchers vendeurs » vis à vis de notre étude à savoir méfiance, pas de gratuité pour les échantillons. Enfin, cette sortie nous a permis de déposer une demande d’autorisation de prélèvement auprès du Docteur vétérinaire de la SERAS. Par ailleurs, nous avons évalué les charges financières et le temps nécessaire pour aller du CHNEAR aux sites et y revenir manipuler les échantillons collectés.
Des correspondances ont été adressées au Directeur du Centre Hospitalier Régional de Kolda ainsi qu’au Pharmacien responsable du Laboratoire, aux responsables des 2 fermes et de la fromagerie. Tous ont donné leur accord pour la réalisation de l’étude.
• Technologie au Laboratoire
Au Laboratoire du CHNEAR, les échantillons de viande ont été broyés dans des mortiers en porcelaine à l’aide du sable de mer préalablement stérilisé. Le but était de libérer les Listeria qui, rappelons le, sont des bactéries intracellulaires.
Au tout début, nous avions essayé le broyage en stomacher au Laboratoire Vétérinaire de la SERAS. Les résultats obtenus avec cet appareil n’étaient pas satisfaisants, car les fibres de viande restaient intactes. Nous nous sommes donc rabattus sur la méthode traditionnelle de broyage en mortier de porcelaine.
A la fin du pré-test, nous avons mesuré l’ampleur de la tâche à accomplir (nombre d’échantillons à collecter par sortie, nombre et rythme de sorties par semaine), les incidences financières et temporelles.

COLLECTE DES ECHANTILLONS D’ALIMENTS

• Collecte des échantillons de viande à Dakar
Elle a eu lieu deux fois par semaine (Lundi et Jeudi) pendant 13 mois.
à la SERAS, un technicien vétérinaire prélevait sur les carcasses de bœuf, mouton et porc fraîchement abattus et dépecés, des fragments de ganglions, de muscle, d’intestin et de foie. Le même couteau servait au prélèvement de tous les échantillons du jour. Sur chaque carcasse, ces différents organes étaient prélevés et ensuite mis ensemble pour constituer un échantillon unique. Ainsi chaque échantillon représente les types de viande (muscle, foie, intestin, ganglion) prélevés sur une carcasse, c’est-à-dire un seul animal.
dans les marchés et les cantines « Belle viande », le boucher préposé à la vente découpait environ 30 grammes de viande exposée dans le réfrigérateur ou sur la table ou simplement suspendue aux crochets à la devanture de l’étal. Là aussi, un seul couteau était utilisé. Ici nous prélevions un échantillon par vendeur.
• Collecte des échantillons de lait à Kolda
Dans le département de Kolda, nous nous sommes rendus dans les deux fermes du Lundi au Samedi inclus, pendant 20 jours consécutifs du mois de mai 2006. A partir des bidons de 30 litres de lait des éleveurs venant ravitailler les fermes, nous prélevions nous même environ 50 ml grâce à un pot d’1 litre dont disposait chaque ravitailleur.
dans le département de Sédhiou, les échantillons de fromage ont été collectés lors de 2 passages, à raison d’un passage hebdomadaire et cela pendant le mois de mai 2006. Le responsable de la fromagerie prélevait sur le restant de chaque lot de fromage, environ 30 g à l’aide de son couteau qui n’était pas stérilisé entre deux recueils.
Pour l’ensemble des échantillons, le conditionnement suivant a été appliqué :
– mise en sachet stérile individuel fermé et étiqueté aussitôt
– entreposage immédiat dans la glacière contenant la carboglace
– acheminement dans les meilleurs délais au Laboratoire du CHNEAR (45 à 60 minutes à bord des transports en commun) et à celui du CHRK (35 minutes à partir des fermes et 6 heures à partir de la fromagerie).

TECHNOLOGIE AU LABORATTOIRE

De retour au Laboratoire, nous mettions immédiatement en route la technique d’enrichissement. Lorsque cela n’était pas possible, les échantillons étaient conservés au réfrigérateur à +4°C pendant 24 heures au plus.

Table des matières

Introduction
PREMIERE PARTIE
1. Historique
2. Classification
3. Caractères bactériologiques
3.1.Caractères morphologiques
3.2. Caractères culturaux
3.3. Caractères biochimiques
3.4. Caractères antigéniques
3.5. Sensibilité aux antibiotiques
4. Epidémiologie
4.1. Habitat
4.2. Transmission
4.3. Caractéristiques épidémiologiques
5. Pouvoir pathogène naturel
5.1. Physiopathologie de la listériose
5.2. Listériose animale
5.3. Listériose humaine
6. Diagnostic bactériologique
6.1. Diagnostic direct
6.1.2. Examen microscopique
6.1.3. Isolement des Listeria
6.1.4. Identification des Listeria
6.1.4.1. Aspect des colonies
6.1.4. 2. Examen après culture
6.1.4. 3. Caractères biochimiques
6.1. 4.4. Antibiogramme
6.1.5. Techniques de diagnostic rapide
6.2 Diagnostic indirect
7. Eléments thérapeutiques
7.1. Traitement curatif
7.2. Mesures prophylactiques
DEUXIEME PARTIE
1. Cadre et période de l’étude
1.1. Cadre de l’étude
1.2. Période de l’étude
2. Matériels et Méthodes de l’étude
2.1. Matériels de l’étude
2.1.1. Echantillons d’aliments
2.1.2. Milieux et réactifs
2.1.3. Matériels d’appoint
2.2. Méthode de travail
2.2.1. Etude préliminaire
2.2.2. Collecte des échantillons
2.2.3. Technologie au Laboratoire
2.2.3.1 Etape d’enrichissement
2.2.3.2 Isolement des Listeria
2.2.3.3 Identification des isolats
3.1. Sites d’isolement des Listeria
3.2. Répartition des Listeria selon les échantillons
3.3. Autres bactéries isolées
4. Commentaires – Discussions
4.1. Cadre et période de l’étude
4.2. Choix des échantillons
4.3. Bactéries isolées
4.4. Listériose humaine au Sénégal
4.5. Autres bactéries isolées
5. Recommandations
6. Conclusions
Bibliographie

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