Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire

Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire

Matériels et méthodes

L’élution a été réalisée à température ambiante par un gradient linéaire de 0 à 75% d’éluant B (acetonitrile/ eau/ TFA, 80: 20: 0,09 (v: v: v) dans H2O). 20 μl d’échantillon (1 mg/ml) ont été injectés. La densité optique a été enregistrée à 220 nm et 280 nm.

Etude des pouvoirs immunogène et allergène de la bLf

Animaux et réactifs

Animaux

Les animaux utilisés dans nos protocoles sont des souris de souche Balb/c obtenus auprès de l’Institut Pasteur d’Alger. Ce sont des souris femelles congéniques, élevées et acclimatées avant toute manipulation dans l’animalerie du laboratoire de la physiologie de la nutrition et de la sécurité alimentaire dans des conditions d’hébergement conformes à la réglementation. Les expériences sont effectuées en respectant le bien-être de l’animal, évitant le stress et l’agitation susceptibles d’interférer avec les résultats. Les animaux vivent dans des cages munies de biberons et d’une mangeoire et sont pourvues en eau et nourries ad libitum à l’aide d’un régime commercial pour rongeurs (ONAB).

Les réactifs et produits chimiques

Les sels de base pour les tampons sont des produits Sigma et Merck (France). Les différents produits utilisés pour les dosages immunoenzymatiques proviennent de chez Sigma (France).

Les allergènes

La lactoferrine bovine (bLf) (purifiée)

Immunisation des animaux

Constitution des groupes expérimentaux

Nous utilisons 30 souris femelles Balb/c âgées entre 6 et 8 semaines, les souris sensibilisées par voie intrapéritonéale contre la bLf :  Lot 1: 14 souris immunisées contre la bLf à une concentration de 1 µg/100 µl (1%).  Lot 2: 14 souris immunisées contre la bLf à une concentration de 2 µg/100 µl (2%).  Lot 3: 34 souris immunisées contre la bLf à une concentration de 5 μg/100 μl (5%).  Lot 4: 14 souris immunisées contre la bLf à une concentration de 10 μg/100 μl (10%).  Lot 5: 14 souris naïves ne recevant aucune immunisation et constituant le groupe témoin.Matériels et méthodes.

Protocole d’immunisation

Nous utilisons la voie intrapéritoniale en présence d’Al(OH)3 comme voie de sensibilisation chez la souris en raison de sa facilité d’utilisation, mais aussi parceque cette voie permet l’introduction directe de l’antigène au niveau systémique. Cette méthode est réputée efficace car elle optimise la réponse immunitaire et provoque une production élevée des IgE spécifiques (Westphal et al., 2004).
Les souris des lots 1, 2, 3 et 4 sont immunisées par voie intrapéritonéale. Chaque lot de souris reçoit une dose 100 µl d’une solution de PBS pH (7,4) contenant 1, 2, 5 ou 10 µg de bLf mélangée à 2 mg d’Al(OH) 3. Les injections intrapéritonéales ont lieu à J0 puis, sous forme de rappel et dans des conditions identiques, au 14ème , 21ème, 28ème jour du protocole.

Prélèvements sanguins

Pour l’évaluation du degré d’immunisation contre l’antigène testé, le sang est prélevé par ponction dans le sinus rétroorbitaire à l’aide d’une pipette Pasteur, sur l’animal vigile (Adel-Patient, 2000). Le prélèvement est effectué au 35ème jour, jour du sacrifice. Le volume moyen de sang total ainsi recueilli est d’environ 400 µl. Le sérum est séparé par centrifugation à 3500 tr/mn pendant 15 minutes à + 4ºC puis aliquoté dans des microtubes Eppendorf que l’on conserve congelés à -20ºC. Ces sérums sont utilisés pour le dosage des immunoglobulines spécifiques : IgG totales (IgGt) et IgE.

Evaluation du pouvoir allergisant de la bLf

ELISA

Pour évaluer le degré de sensibilisation ainsi qu’une éventuelle réponse en anticorps réaginiques contre l’antigène sensibilisant, nous dosons les anticorps sériques suivants: IgGt, IgE anti bLf, selon un procédé non compétitif par la technique immunoenzymatique ELISA et dont le principe est le suivant.

Principe général de la méthode Elisa

Le principe de cette technique est basé sur un procédé dans lequel les anticorps à doser réagissent dans un premier temps avec l’antigène immobilisé par adsorption sur une phase solide. Dans un deuxième temps, la quantité d’anticorps fixés par l’antigène est mesurée à l’aide d’un deuxième anticorps (anti-immunoglobuline).
Dans le cadre de notre travail, nous utilisons des plaques de microtitration en polystyrène (NUNC Maxisorb, puits à fond plat), qui permettent d’adsorber la plupart des antigènes. Après dépôt de l’immunsérum contenant les anticorps spécifiques, la phase solide est lavée et on révèle la présence de ces anticorps par l’addition d’un conjugué qui correspond à des anti anticorps couplés ou non à une enzyme (peroxydase). La dernière étape correspond au dosage de l’enzyme marqueur. Cette phase est essentielle, car du plus petit nombre de molécules d’enzymes que l’on pourra détecter, dépendra le seuil de sensibilité. Le substrat de la peroxydase que nous utilisons est le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Au cours de la réaction enzymatique, un radical O se forme. Pour le détecter, on ajoute à la solution un chromogène, l’orthophènylène diamine (OPD).

Mode opératoire

Le dosage ELISA des IgGt, IgE spécifiques anti bLf est réalisé par la technique ELISA à l’aide de plaques de 96 puits à fond plat (NUNC Maxisorb), selon les étapes suivantes :  Tous les puits de la microplaque reçoivent 100 μl d’antigène (bLf) à la concentration de 5 μg/ ml, dilués dans du PBS pH 7,4. Les plaques sont alors incubées pendant au moins une nuit à + 4°C.
 L’excès d’antigène non fixé est éliminé par 3 lavages successifs de la plaque avec du PBS-Tween 20 0,05 % à l’aide d’un laveur automatique (Elx50).  Les sites non spécifiques sont saturés par le dépôt, dans tous les puits, de 300 μl de PVA à 1 % dans du PBS pH 7,4.  La plaque est ensuite incubée pendant 1h à 37°C puis rincée 3 fois de suite sous agitation par le tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05 %.  L’opération suivante consiste à diluer les échantillons de sérum à tester au 1/10ème dans un tampon de dilution (PBS 0,01 M/PVA 1% Tween 20 0,1% pH 7,4). Pour cela, une série de dilution est alors effectuée allant de 10-1 à 10-7 . Puis, un volume de 100 μl est déposé dans des puits appropriés.
 La plaque est alors incubée à 37°C pendant 2 heures, puis lavée 3 fois de suite sous agitation, au tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%.  Ensuite, chaque puits de la plaque reçoit, selon les anticorps recherchés, 100 μl d’anti anticorps de souris dilués au 1/20000ème dans du tampon de dilution. L’anti anticorpsMatériels et méthodes déposé est soit un anti IgG (Sigma- K 4783) ou anti IgE (R 35-118) biotinylés (Pharmingen).  La plaque est alors incubée pendant 1 heure 30 mn à 37°C, suivie d’un lavage 3 fois de suite au tampon de lavage PBS/ Tween 20 0,05%.
 Pour les plaques ayant reçu des anti IgE, 100 μl de streptavidine péroxydase (Sigma) diluée à 1/5000 dans le tampon de dilution pH 7 sont déposés dans tous les puits. La plaque est ensuite incubée pendant 30 mn à 37°C (Tableaux 8 et 9).  Après lavage avec le PBS/Tween 20 0,05%, 200 μl d’une solution contenant un chromogène (l’orthophénylène diamine (OPD) (Sigma P1526): 6 mg dilués dans 20 ml de tampon citrate de sodium 0,05 M à pH 5,1 ainsi que 30 μl de H2O2) sont déposés dans chaque puits de la plaque. Une réaction colorée se développe en 30 minutes à température ambiante et à l’abri de la lumière. L’ajout de H2SO4 2N permet de stopper la réaction
(Tableaux 8 et 9).  L’intensité de la réaction colorimétrique est mesurée à 492 nm à l’aide d’un lecteur (ELx 800).
 Des témoins positifs et négatifs ont été inclus dans chaque plaque afin de contrôler la spécificité et la sensibilité de chaque mesure.

Test de provocation in vitro en Chambre de Ussing

Des tests de provocations en chambre de Ussing ont été effectués sur tous les groupes de souris immunisées à la bLf à la concentration de 1, 2, 5, et 10 µg/ml ainsi que le groupe témoin.

Principe de la chambre de Ussing

La chambre de Ussing est une méthode fondamentale pour l’étude et la compréhension des mécanismes du transport intestinal. Ce dispositif expérimental a été conçu par Ussing et Zerahn en 1951 pour la mesure des flux ioniques au travers d’un épithélium puis il a été adapté à l’intestin par Schultz et Zalusky (1964). Depuis, cette méthode a été appliquée à de nombreux modèles animaux de laboratoire et est utilisée pour des fragments d’intestin humain prélevés au cours d’interventions chirurgicales ou lors de biopsies intestinales (Heyman et al., 1982; Grasset et al., 1984; Kheroua, 1987; Marcon-Genty et al., 1989; Saïdi et al., 1995).
Un fragment de muqueuse intestinale est monté à plat entre deux demi chambres de lucite dont l’ouverture, déterminant la surface exposée, est adaptée à la taille du fragment à étudier (0,1 à 0,2 cm2 Les deux faces du tissu, déterminant un compartiment muqueux (représentant la lumière intestinale) et un compartiment séreux (représentant la circulation sanguine) sont baignés par des solutions identiques (pression, température, osmolarité) maintenues à 38°C, brassées et oxygénées continuellement par un courant de carbogène (O2: 95%, CO2: 5%). Le principe même de la chambre de Ussing est qu’il ne doit exister aucun gradient électrochimique permettant à une solution donnée, de traverser le tissu. Cette condition est remplie lorsque les deux faces du tissu sont baignées par des solutions ayant la même composition chimique, la même température, le même pH et la même osmolarité.

Montage de fragments de jéjunum de souris en chambre de Ussing

Les souris sont maintenues à jeûn depuis la veille au soir. Elles sont anesthésiées à l’aide d’un coton imbibé d’éther, puis l’abdomen est ouvert et le segment jéjunal entier est prélevé délicatement de la cavité abdominale, vidé de son contenu par deux ou trois rinçages au Ringer froid (Tableau 10). Après l’avoir délicatement débarrassé des mésentères, le segment jéjunal est ensuite incisé selon le bord mésentérique puis découpé en fragments qui sont maintenus dans du Ringer froid et oxygénés par un courant de carbogène (CO2: 5%, O2: 95%). A chaque fois, un fragment est monté entre deux chambres de lucite dont l’ouverture détermine la surface de la muqueuse intestinale exposée (0,10 cm²). Le volume de Ringer déposé dans chaque compartiment de la chambre est de 5 ml, le système est maintenu à 37° C et oxygéné par un courant de carbogène. Après montage du tissu, environ 30 minutes sont nécessaires pour stabiliser les paramètres électrophysiologiques de base. Au terme de cette période, on dépose 60 µg/ml d’antigène que l’on veut tester (bLf) dans le compartiment séreux de la chambre. Les différents paramètres électrophysiologiques sont alors mesurés dans un premier temps, toutes les minutes durant les 5 premières minutes, puis 1 fois toutes les 5 mn, durant 10 mn d’expérience à l’aide d’un logiciel (Acquire and analyse 2.3). Les compartiments muqueux et séreux sont reliés à une paire d’électrodes au calomel, via des ponts d’agar (4 g/100 ml de KCL 3M) aux deux faces du tissu et permettent de mesurer la différence de potentiel (PD) spontanée du tissu (séreuse positive).

Table des matières

Introduction 
Rappels Bibliographiques
1. Allergie aux protéines du lait de vache (APLV) 
1.1. Population ciblé
1.2. Définition de l’allergène
1.3. Structure et caractéristiques des épitopes des protéines du lait
1.4. Définition de l’immunogénicité, l’antigénicité et l’allergénicité
1.5. La réaction croisée
2. Les allergènes du lait bovin  
2.1. La β-Lactoglobuline (β-Lg)
2.2. L’α-lactalbumine (α-La)
2.3. La Lactoferrine (Lf
3. Mécanismes physiopathologiques de l’APLV 
3.1. Allergie au lait de vache et perméabilité intestinale
4. Les signes cliniques  
4.1. Réactions gastro-intestinales
4.1.1. Les réactions à éosinophiles, IgE- et non IgE-médiées
4.2. Manifestations cutanées
4.3. Manifestations respiratoires
5. Influence des conditions physico-chimiques sur l’allergénicité des protéines alimentaires 
5.1. Protéolyse digestive
5.2. Influence de la température: Impact du traitement thermique sur la dénaturation des protéines
5.3. Impact des traitements thermiques sur la digestion des protéines laitières                          Matériel et Méthode
1. Purification de la lactoferrine bovine  
2. Comparaison du degré de pureté de la bLf purifiée et de la bLf commercialisée par Sigma (L4765 
2.1. Electrophorèse sur gel de poly-acrylamide enprésence de sodium dodecyl-sulfate (SDSPage)
2.2. HPLC
3. Etude des pouvoirs immunogènes et allergènes de la bLf 
3.1. Animaux et réactifs
3.1.1. Animaux
3.1.2. Les réactifs et produits chimiques
3.1.3. Les allergènes
3.2. Immunisation des animaux
3.2.1. Constitution des groupes expérimentaux
3.2.2. Protocole d’immunisation
3.3. Prélèvements sanguins
4. Evaluation du pouvoir allergisant de la bLf 
4.1. ELISA
4.1.1. Principe général de la méthode Elisa
4.1.2. Mode opératoire
4.2. Test de provocation in vitro en Chambre de Ussing
4.2.1. Principe de la chambre de Ussing
4.2.2. Montage de fragments de jéjunum de souris en chambre de Ussing
4.3. Etude histologique
4.3.1. Traitements histologiques des fragments
4.3.1.1. Fixation
4.3.1.2. La déshydratation
4.3.1.4. L’inclusion
4.3.2. Traitement des lames
4.3.2.1. Etalement sur lames
4.3.2.2. Déparaffinage
4.3.2.3. Réhydratation
4.3.2.4. Coloration
4.4. Mesure de la hauteur des villosités
4.4.1. Principe
4.5. Signes cliniques : test de provocation
5. Evaluation de la réaction croisée entre la bLf/β-Lg/α-La
5.1. Réaction croisée β-Lg/anticorps anti bLf et α-La/anticorps anti bLf
5.1.1. Immunisation par voie intrapéritonéale
5.1.2. Protocole d’immunisation et Prélèvements sanguins
5.2. Étude de l’immunoréactivité entre la β -Lg, l’ α-La et bLf
5.3. Etude de la réaction croisée en chambre de Ussing
5.4. Signes cliniques: test de provocation in vivo par voie intrapéritonéaleErreur ! Signet non défini.
6. Hydrolyse peptique et pancréatique de la bLf associée ou pas à la β-Lg et α-La 
6.1. Caractéristiques des enzymes utilisées
6.2. Déroulement du protocole
6.3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de Sodium Dodécyle Sulfate
7. Dénaturation thermique de la lactoferrine bovine 
7.1. Electrophorése de la lactoferrine sur gel depoly-acrylamide en présence de Sodium
Dodécyle sulfate (SDS-page)
la méthode immunoenzymatique Elisa
8. Hydrolyse enzymatique de la bLf après traitement thermique 
8.1. Dénaturation thermique de la lactoferrine bovine
8.2. Caractéristiques des enzymes utilisées
8.2.1. Déroulement du protocole
8.3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de Sodium Dodécyle Sulfate
(SDS-PAGE)
9. Méthodes statistiques 
Résultats
1. Analyse du degré de pureté de la Lactoferrine bovine (bLf)  
1.2. Contrôle chromatographique de la bLf par Rp-HPLC
2. Etude du pouvoir immunogène de la bLf 
2.1. Titres sériques en anticorps anti bLf chez les souris Balb/c immunisées par la bLf à différentes
2.1.1. Titres sériques en IgG
2.1.2. Titres sériques en IgE
2.2. Etude ex vivo en chambre de Ussing: test de provocation locale
2.2.1. Effet de la bLf sur l’Isc
2.2.2. Effet de la bLf sur la conductance
2.2.3. Effet de l’ovalbumine sur l’Isc
2.2.4. Effet du compound 48/80
2.2.5. Effet du furosémide
2.2.6. Effet du glucose
2.3. Effet de l’immunisation sur la structure intestinale
2.3.1. Effet général
2.3.2. Effet sur la structure villositaire de l’épithélium intestinal
3. Etude de la réaction croisée entre la bLf et la β-Lg et l’α-La  
3.1. Réaction croisée β-Lg/anticorps anti bLf et α-La/anticorps anti bLf
3.2. Réaction croisée bLf/anticorps anti-β-Lg et bLf/anti-α-La
3.3.Etude en chambre de Ussing de la réaction croisée bLf/β-Lg et bLf/α-La
3.3.1. Effet spécifiques des antigènes sensibilisants
3.4. Effet de la bLf sur l’Isc
3.5. Effet de la bLf sur la conductance dans la réaction croisée
3.7. Signes cliniques dans la réaction croisée
4. Hydrolyse peptique et pancréatique de bLf seule ou associée à la β-Lg et l’α-La  
4.1. Profils électrophorétiques des hydrolysats de bLf
4.2. Profils électrophorétiques des hydrolysats du mélange bLf/β-Lg/α-La
4.3. Immunoréactivité des hydrolysats de bLf
4.4. Réactivité des hydrolysats du mélange bLf/β-Lg/α-La bovine vis-à-vis des IgG anti bLf
5. Traitement thermique de la bLf seule ou associée à la -Lg et à l’-La 
5.1. Profils électrophorétiques de la bLf après traitement thermique
5.2. Profil électrophorétique du mélange bLf/β-Lg/α-La après traitement thermique
5.3. Réactivité immunologique de la bLf après traitement thermique
5.4. Réactivité immunologique du mélange bLf/ β-Lg/α-La
6. Hydrolyse enzymatique de la bLf après traitement thermique
6.1. Profil électrophorétique de la bLf (non chauffée)après hydrolyse par la pepsine
6.2. Electrophorèse de l’hydrolyse peptique/pancréatine de la bLf chauffée à 72°C
6.3. Electrophorèse de l’hydrolyse peptique/pancréatique de la bLf chauffée à 85°C, 95°C
Discussion
Conclusion 
Références Bibliographiques

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