Physiologie de la cellule β et sécrétion d’insuline

Physiologie de la cellule β et sécrétion d’insuline

Dosage des composés phénoliques

Polyphénols totaux

La concentration en polyphénols totaux des extraits de graines de lin est déterminée selon la méthode de Folin-Ciocalteu (McDonald et al., 2001). Cette technique est basée principalement sur la réduction du réactif acide phosphotungstique phosphomolybdique (réactif de Folin) dans une solution alcaline. A 0,5mL d’échantillon est ajouté 0.1 mL du réactif de Folin (0.5N) et 2,5mL d’une solution de carbonate de sodium (7,5%). Après agitation, une coloration se développe à l’obscurité. La coloration bleue est mesurée au spectrophotomètre à 760 nm. Les résultats sont exprimés en microgramme d’équivalent en acide gallique par gramme d’extrait sec (g/g). 1.2.1.2. Flavonoïdes Le dosage des flavonoïdes est effectué selon la méthode colorimétrique de chlorite d’aluminium (Singleton  Rossi, 1965). 1mL de de l’échantillon à analyser est additionné à 0,5mL d’une solution de chlorure d’aluminium (AlCl3) (1,2%) et 0.5mL d’acétate de potassium. La coloration jaune de l’échantillon est mesurée à 415 nm. Les teneurs en flavonoïdes sont déterminées à partir de la gamme étalon de quercétine et exprimées en microgramme d’équivalent en quercétine par gramme d’extrait sec (g/g).

Evaluation de l’activité antioxydante des graines de lin

Test au DPPH

L’activité antioxydante des différents extraits des graines de lin est évaluée par le test DPPH, en utilisant l’acide ascorbique comme standard et exprimée en g/L d’acide ascorbique (Shen et al., 2010). Cette méthode spectrophotométrique utilise le radical DPPH (1,1-diphényl-2-picrylhydrazil) de couleur violette comme réactif, qui vire au jaune, en présence de capteurs de radicaux libres, et se réduit en 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine. 3mL de chaque extrait à différentes concentrations (50, 100, 200, 400 et 800g/mL) est homogénéisé avec 3,9 mL de DPPH à 0,1 mM. Après une période d’incubation de 30 minutes, les absorbances à 517 nm ont été enregistrées. L’activité antioxydante est exprimée en pourcentage d’inhibition I (%) du radical DPPH, en utilisant la formule suivante: I (%) = [Absorbance C – Absorbance échantillon/Absorbance C] x 100 AC : absorbance du contrôle négatif (méthanol) L’étude de la variation de l’activité antiradicalaire en fonction de la concentration des extraits permet de déterminer la concentration qui correspond à 50% d’inhibition (IC50). Une faible valeur de l’IC50 correspondant à une grande efficacité de l’extrait.

 Piégeage du radical superoxyde (O2•)

Le système (méthosulfate de phénazine/Nicotinamide Adénine Dinucléotide) (PMS/NADH) utilisé permet la formation, de l’anion superoxyde (O2·-). Ce dernier réduit le nitro-blue tétrazolium (NBT) en Formazan. L’activité est basée sur la méthode décrite par Srinivasan et al. (2007). Les anions sont générés dans un mélange d’une solution de 0,5mL β-NADH à 0, 936mM, 0,5mL d’une solution de NBT à 0,3mM et 1mL de chaque extrait à différentes concentrations (50, 100, 200, 400 et 800 g/mL). La réaction est initiée par l’addition de 0,5mL d’une solution de PMS à 16 μM au mélange réactionnel et après 5 min d’incubation à 25°C. L’absorbance est mesurée à 560 nm contre un blanc ne contenant pas de PMS. Les résultats permettent de calculer le pourcentage d’inhibition de la formation du formazan et d’exprimer cette activité en IC50 comme décrit précédemment pour le DPPH˙. L’activité des extraits testés est comparée à celle de l’acide ascorbique. L’activité antioxydante est exprimée en pourcentage d’inhibition I (%) du radical superoxyde (O2·-), en utilisant la formule suivante: I (%) = [Absorbance C – Absorbance échantillon/Absorbance C] x 100 AC : absorbance du contrôle négatif (méthanol)

 Pouvoir réducteur du fer

L’activité réductrice des extraits est évaluée par la réaction d’oxydo-réduction entre l’extrait et les ions métalliques de transition, notamment le fer (FRAP). Le ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 fournit des ions Ferriques (Fe3+) qui seront réduits en ions Ferreux (Fe2+) par les antioxydants présents dans les différents extraits végétaux. Le pouvoir réducteur est déterminé selon la méthode décrite par Kumar  Hemalatha (2011). Cette méthode consiste à mélanger 1 ml de chaque extrait à différentes concentrations (50, 100, 200, 400 et 800 g/mL) avec 5 mL de tampon phosphate 0,2 M à pH 6.6 et 5 mL d’une solution de K3Fe(CN)6 à 1% (m/v). Le mélange obtenu est incubé pendant 20 minutes à 50°C, puis 5 mL d’acide trichloracétique (CCl3COOH) à 10% sont ajoutés pour arrêter la réaction. Le mélange est centrifugé à 1000g pendant 10 mn à 5°C et 5mL du surnageant sont additionnés de 5 mL d’eau distillée et 0,5 ml de chlorure de fer (FeCl3) à 0.1%. La lecture de l’absorbance se fait à 700nm contre un blanc. L’activité des extraits testés est comparée à celle de l’acide ascorbique.

 Calcul des IC50

Pour chaque extrait nous avons déterminé la valeur IC50 qui est la concentration de l’échantillon testé nécessaire pour réduire 50 % de radical DPPH. Les IC50 sont calculées à partir de l’équation des graphes tracés ; pourcentages d’inhibition en fonction de différentes concentrations des fractions testées et les standards.

 Animaux et régimes

Trente rats mâles Wistar (Iffa Credo, l’Arbresle, Lyon, France) (n=30), pesant 267±5g sont utilisés dans cette étude. Les animaux sont maintenus dans une animalerie dans des conditions environnementales standard (23±1°C, 60% d’humidité et un cycle de lumière de 12h jour/nuit) et sont soumis à un régime standard (ONAB). Les conseils pour la protection et l’utilisation des animaux de laboratoire sont suivis (Council of European Communities, 1987).

 Induction du diabète

Le diabète est induit par injection intrapéritonéale d’une dose unique de streptozotocine (STZ) (Sigma, St Louis, USA) à raison de 60 mg/kg de poids corporel. La STZ est diluée dans du tampon citrate 0,05 M pH 4,5 juste avant son utilisation. L’hyperglycémie est confirmée 48 heures après injection de STZ, sur un prélèvement sanguin effectué au niveau de la veine de la queue en utilisant un glucomètre (Glucotrend, Meylan, Germany). Seuls les animaux dont la glycémie à jeun est supérieure à 2,50 g/L (13,87 mmol/L) sont considérés comme diabétiques.

Traitement avec la graine de Lin

Les rats diabétiques (n = 12) sont répartis en 2 groupes de 6 rats chacun : Un groupe non traité consommant un régime à 20% de caséine (D) et un groupe traité soumis au même régime supplémenté avec la poudre de Linum usitatissimum (D-Lu) à raison de 10g/kg de régime, pendant 56 jours. Durant tout le protocole expérimental, un groupe (n=6) consommant un régime à 20% de caséine a été utilisé comme témoin (T) (Tableau XIII). La nourriture et l’eau de boisson sont données à volonté. La consommation alimentaire est mesurée quotidiennement et le poids des rats une fois par semaine. Durant les trois derniers jours de l’expérimentation, six rats de chaque groupe, témoins, traités et non traités sont placés individuellement durant toute l’expérimentation dans des cages à métabolisme. Les animaux et la quantité de nourriture ingérée sont pesés chaque jour. Les urines sont recueillies sur un antiseptique (thymol-isopropanol à 10%) puis filtrées et conservées à 4°C.

Table des matières

INTRODUCTION
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Etude du diabète
1.1. Le pancréas
1.1.1. Le pancréas exocrine
1.1.2. Le pancréas endocrine
1.1.2.1. Histologie
1.2. Physiologie de la cellule β et sécrétion d’insuline
1.2.1. Insuline
1.2.2. Définition et biosynthèse
1.2.3. Actions physiologiques de l’insuline
2. Définition et diagnostic du diabète sucré
2.1. Epidémiologie
2.2. Classification
2.2.1. Diabète de type1
2.2.2. Diabète de type 2
2.2.3. Diabète gestationnel
2.2.4. Autres types de diabète : diabète secondaire (spécifique)
3. Diabète et dyslipidémie
3.1. Anomalies lipidiques du diabétique
3.1.1. Métabolisme des lipoprotéines de très faible densité (VLDL)
3.1.2. Métabolisme des lipoprotéines de faible densité (LDL)
3.1.3. Métabolisme des lipoprotéines de haute densité (HDL)
3.2. Oxydation et glycosylation des lipoprotéines
4. Diabète et stress oxydant
4.1. Hyperglycémie et stress oxydant
4.2. Hyperglycémie et peroxydation lipidique
4.3. Hyperglycémie et potentiel antioxydant
5. Diabète et inflammation
5.1. Implication des cytokines dans le diabète de type1
6. Diabète expérimentale induit par streptozotocine
6.1. Streptozotocine et stress oxydant
7. Diabète et plantes médicinales
7.1. Dans le monde
7.2. En Algérie
7.3. Modes d’actions des plantes antidiabétiques
7.4. Principes actifs à effets antidiabétiques
7.4.1. Les flavonoïdes
7.4.2. Les saponoside
7.4.3. Les alcaloïdes
7.4.4. Les glycosides
7.5. Toxicité des plantes antidiabétiques
7.6. Effet des plantes médicinales sur la dyslipidémie associé au diabète
7.7. Effet des plantes médicinales sur le stress oxydant associé au diabète
8. Choix du matériel végétale et du modèle expérimentale
8.1. Matériel végétal
8.1.1. Description
8.1.2. Morphologie et anatomie
8.1.3. Caractéristiques botaniques de Linum usitatissimum
8.1.4. Bienfaits et potentiels du lin sur la santé
8.2. Modèle expérimental
MATERIELS ET METHODES
1. Matériel végétale
1.1. Préparation de la poudre de lin
1.1.1. Préparation de la poudre pour le dosage
1.1.2. Criblage phytochimique des extraits de la graine de lin
1.2. Mesure du potentiel antioxydant
1.2.1. Dosage des composés phénoliques
1.2.1.1. Polyphénols totaux
1.2.1.2. Flavonoïdes
1.2.2. Evaluation de l’activité antioxydante des graines de lin
1.2.2.1. Test au DPPH
1.2.2.2. Piégeage du radical superoxyde (O2•)
1.2.2.3. Pouvoir réducteur du fer
1.2.2.4. Calcule des IC50
2. Animaux et régimes
2.1. Induction du diabète
2.2. Traitement avec la graine de lin
3. Prélèvement des échantillons sanguins et des organes
4. Analyses biochimiques
4.1. Détermination de la glycémie
4.2. Dosage de l’insuline plasmatique
4.3. Détermination de l’hémoglobine glycosylée
4.4. Détermination des teneurs plasmatiques et urinaires en urée, créatinine et acide urique
4.5. Activité des transaminases et de la phosphatase alcaline plasmatiques
4.6. Détermination des teneurs en protéines totales et en lipides du foie et du plasma
4.6.1. Dosage des protéines
4.6.2. Dosage des lipides du foie et du plasma
4.6.2.1. Extraction des lipides du foie
4.6.2.2. Teneurs en cholestérol total, libre et esters de cholestérol
4.6.2.3. Teneurs en triglycérides
4.6.2.4. Teneurs en phospholipides
4.7. Séparation et analyse des différentes fractions de lipoprotéines
4.7.1. Séparation des lipoprotéines plasmatiques
4.7.2. Purification des précipités
4.7.3. Analyse de différents constituants des lipoprotéines
4.7.4. Détermination des teneurs en apolipoprotéines (Apo A-I et Apo B) plasmatiques et rapports d’athérogénicité
4.7.5. Détermination de l’activité de la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT)
4.8. Evaluation du statut redox
4.8.1. Dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS)
4.8.1.1. TBARS du plasma et des érythrocytes
4.8.1.2. TBARS tissulaires
4.8.2. Détermination de l’activité des enzymes antioxydantes érythrocytaires et tissulaires
4.8.2.1. Préparation des érythrocytes
4.8.2.2. Préparation des homogénats tissulaires
4.8.2.3. Activité de la superoxyde dismutase (SOD, EC 1.15.1.1)
4.8.2.4. Activité de la glutathion peroxydase (GSH-Px, EC 1.11.1.9)
4.8.2.5. Activité de la glutathion réductase (GSSH-Red, EC 1.6.4.2)
4.8.2.6. Activité de la catalase (CAT, EC 1.11.1.6)
4.9. Evaluation du statut inflammatoire
4.9.1. Dosage du facteur du nécrose tumorale (TNF-α) et de l’interleukine-6 (IL-6)
5. Etude histologique des organes
6. Analyse statistique
RESULTATS
1. Analyse phytochimique
1.1. Etude phytochimique
1.2. Dosage des polyphénols et flavonoïdes totaux
1.3. Evaluation du potentiel antioxydant des extraits de la graine (Lu)
1.3.1. Activité anti-radicalaire par le test au DPPH•
1.3.2. Piégeage du radical superoxyde(O2•)
1.3.3. Capacité de réduction des ions ferriques en ions ferreux
1.3.4. Calcul des concentrations inhibitrices à 50%
2. Analyse biologique
2.1. Croissance pondérale des animaux et nourriture ingérée
2.2. Poids relatif des organes
2.3. Evolution de la glycémie, l’insulinémie et hémoglobine glycosylée
2.4. Concentrations plasmatiques et urinaires en urée, créatinine et en acide urique
2.5. Activités enzymatiques des transaminases et de la phosphatase alcaline plasmatiques
2.6. Teneurs en protéines et lipides du foie et du plasma
2.7. Teneurs et composition en apolipoprotéines et en lipides des différentes lipoprotéines plasmatiques
2.7.1. Répartition du cholestérol total plasmatique entre les différentes lipoprotéines
2.7.2. Répartition des triglycérides plasmatiques entre les différentes lipoprotéines
2.7.3. Teneurs et composition en lipides et apolipoprotéines des VLDL
2.7.4. Teneurs et composition en lipides et apolipoprotéines des LDL-HDL1
2.7.5. Teneurs et composition en lipides et apolipoprotéines des HDL2
2.7.6. Teneurs et composition en lipides et apolipoprotéines des HDL3
2.8. Concentrations en apolipoprotéines A-I et B du plasma
2.9. Rapports d’athérogénicité
2.10. Activité de la lécithine: cholestérol acyltransférase (LCAT)
2.11. Statut redox
2.11.1. Concentrations en substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) des érythrocytes et du plasma
2.11.2. Concentrations en TBARS tissulaires
2.11.3. Activité des enzymes antioxydantes érythrocytaires
2.11.4. Activité des enzymes antioxydantes tissulaires
2.12. Statut inflammatoire
2.12.1. Concentration plasmatiques du facteur de nécrose tumorale et en interleukine-6
2.13. Examen histologique des organes
DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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