PHENOTYPES DE CROISSANCE ET ESSENTIALITE DE GENES

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Les acteurs du métabolisme

Avant de présenter plus en détail l’organisation du métabolisme au sein des organismes, nous allons préalablement définir dans cette section les « acteurs » impliqués. Nous rappellerons en outre au lecteur quelques notions physiques en rapport avec les réactions biochimiques. En effet, le comportement du métabolisme découle in fine de ces notions physiques ; les modèles mathématiques du métabolisme s’appuient de ce fait de manière fondamentale sur la physique à l’œuvre, aux échelles à la fois de la molécule (description des réactions) et de la cellule (cinétique et thermodynamique).

Métabolites

On utilise généralement le terme de métabolite pour désigner les molécules impliquées dans le métabolisme cellulaire. Ces molécules sont, dans leur grande majorité, des molécules organiques, composées de carbone et d’hydrogène mais également d’oxygène et dans une moindre mesure d’azote, de phosphore et de soufre.

À titre illustratif, la composition moyenne de la bactérie Lactobacillus lactis en ces éléments (relativement au carbone) a été évaluée à C1H1,9O0,6N0,2P0,02S0,01 (Oliveira et al. 2005). Cette composition n’est pas fixe et évolue notamment en fonction de l’environnement de croissance de l’organisme, mais elle est indicative de l’ordre de grandeur de la répartition de ces éléments6. La forte proportion du carbone dans la composition des métabolites n’est pas anodine. En effet, les propriétés électroniques de l’atome de carbone font qu’il établit facilement jusqu’à quatre liaisons covalentes relativement solides ; cette caractéristique lui permet de générer une combinatoire extrêmement grande de molécules organiques en assemblant plusieurs atomes de carbone entre eux.

Réactions

Les métabolites se transforment chimiquement au cours des réactions métaboliques : des métabolites substrats réagissent entre eux pour donner des métabolites produits. On représente généralement la réaction par son équation bilan, laquelle met en évidence la stœchiométrie de la réaction, c’est-à-dire les proportions dans lesquelles les métabolites sont consommés et produits (voir Figure 3). L’équation bilan répertorie exhaustivement les substrats et produits impliqués par la réaction. De ce fait, et étant donné que les transformations à l’œuvre sont purement chimiques – celles-ci mettent uniquement en jeu des échanges d’atomes ou de groupes d’atomes entre métabolites par modification de leurs liaisons chimiques – la quantité de chaque élément et la charge globale est conservée : l’équation bilan est dite équilibrée.

Figure 3. Equation bilan de la réaction catalysée par l’enzyme isocitrate dehydrogénase.

On distingue souvent deux types de métabolites dans une réaction biochimique : les substrats et produits principaux d’une part et les cofacteurs (ou coenzymes) d’autre part. Le premier type désigne les métabolites directement transformés par la réaction chimique : il s’agit par exemple de l’isocitrate, du 2-oxoglutarate et du CO2 dans le cas de la réaction présentée sur la Figure 3. Les cofacteurs désignent quant à eux les métabolites aidant la transformation chimique principale, que ce soit en apportant de l’énergie, en agissant comme accepteur ou donneur d’électron (tels que NADP+ et NADPH dans la réaction de la Figure 3) ou en favorisant le transfert de groupements chimiques. Les transformations chimiques des cofacteurs sont réversibles et, comme nous le verrons plus loin, une partie des activités métaboliques de la cellule consiste justement à régénérer les cofacteurs en les retransformant dans leur état initial.

Enzymes

Aux cotés des métabolites, les enzymes constituent le deuxième acteur clé du métabolisme. Ces dernières jouent en effet le rôle de catalyseurs sans lesquels la plupart des réactions métaboliques ne pourraient se dérouler à des vitesses compatibles avec la vie de la cellule. Le principe de la catalyse enzymatique repose sur une interaction entre l’enzyme et les substrats qui favorise la stabilisation de l’état de transition de la réaction (Koshland 1958). Cette stabilisation abaisse l’énergie à fournir pour atteindre l’état de transition (énergie d’activation) et, de ce fait, un nombre plus élevé de substrats d’énergie moindre pourront interagir, accélérant ainsi la réaction (voir Figure 4).

Figure 4. Illustration de la diminution d’énergie d’activation d’une réaction par catalyse enzymatique. E, enzyme ; S, substrat ; S‡, état de transition ; P, produit ; !G, énergie d’activation avec (!GC) ou sans (!GU) catalyse.

Des mécanismes enzymatiques relativement différents permettent d’abaisser l’énergie d’activation, allant d’une stabilisation par effet électrostatique au rapprochement forcé des substrats. Nous n’entrerons cependant pas dans leurs détails qui seraient hors du propos de cette thèse.

Il est cependant important de noter que, dans la grande majorité des cas, les enzymes catalysent des réactions spécifiques alors que les métabolites peuvent généralement réagir entre eux de diverses manières. En abaissant l’énergie d’activation pour un chemin réactionnel donné – en stabilisant par exemple un état de transition particulier – les enzymes favorisent alors spécifiquement une réaction particulière par rapport aux autres. Le caractère spécifique de la catalyse enzymatique est au moins aussi important dans le métabolisme que l’accélération de la vitesse des réactions. Il lui permet en effet d’assurer la transformation des métabolites en des produits particuliers, évitant la production d’autres produits qui en réduiraient le rendement et pourraient s’avérer néfastes. En résumé, le double aspect spécificité et accélération de la catalyse enzymatique donne à l’organisme le contrôle des transformations métaboliques se déroulant dans la cellule.

À la grande variété de réactions métaboliques correspond une grande variété d’enzymes. Afin d’organiser la description des enzymes identifiées, l’International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)8 élabore une classification des enzymes basée sur le type de réaction catalysée : la classification EC (pour Enzyme Commission). Bien que mise à jour lentement par rapport aux découvertes de nouvelles activités enzymatiques, la classification EC est largement utilisée pour décrire l’activité des enzymes et souvent, par extension, pour assigner une fonction enzymatique à un gène.

Nombre EC Type d’enzyme Type de réactions catalysées

1.-.-.- Oxidoreductases Réactions d’oxidoréduction

2.-.-.- Transferases Réactions de transfert de groupes fonctionnels

3.-.-.- Hydrolases Réactions d’hydrolyse d’un substrat en deux produits

4.-.-.- Lyases Réactions de coupure de liaisons covalentes par un procédé autre que l’oxydation ou l’hydrolyse

5.-.-.- Isomerases Réactions de réarrangement intramoléculaire, isomérisation

6.-.-.- Ligases Réactions de jonction covalente de deux molécules utilisant l’hydrolyse d’ATP

Tableau 1. Premier niveau de la classification EC. Un nombre EC se compose de quatre nombres représentant quatre niveaux de classification qui caractérisent de plus en plus finement la réaction catalysée. Le premier niveau présenté ici distingue six grandes classes de réactions. Le dernier niveau spécifie généralement les substrats précis de la réaction.

Cinétique des réactions métaboliques

Une bonne grandeur pour décrire le fonctionnement du métabolisme est la vitesse des réactions métaboliques, également appelée flux. En effet, la survie des cellules dépend fortement de leur capacité à transformer en permanence les métabolites pour produire l’énergie et construire ses constituants. Plus que les concentrations de tels ou tels métabolites, les flux des réactions renseignent directement sur les conversions métaboliques ayant lieu dans la cellule ; ils représentent en quelque sorte l’état fonctionnel du métabolisme. Nous reviendrons plus en profondeur sur la notion de flux et sa signification pour représenter l’état du métabolisme dans la section introduisant la modélisation.

La vitesse d’une réaction s’exprime généralement avec l’unité mol.L-1.s-1 qui décrit la quantité de substrats transformés par unité de volume de solution et par unité de temps9. Cette unité est bien adaptée à la description des flux lorsque les réactions se déroulent in vitro, mais l’est moins lorsqu’elle se déroulent dans des cellules ; on lui substitue alors l’unité mmol.h-1.(g DW)-1 où DW représente la masse sèche des cellules. Cette unité rapporte ainsi indirectement la quantité de substrat transformé par unité de temps à la quantité de cellule.

La vitesse d’une réaction enzymatique dépend de nombreux facteurs : concentration des substrats et produits, concentration de l’enzyme, efficacité catalytique de l’enzyme, température, pH, pression, entre autres facteurs… Sans vouloir exposer ici un état de l’art sur la cinétique enzymatique qui n’est pas le sujet de cette thèse, nous souhaitons rappeler au lecteur à titre illustratif un modèle simple de cinétique enzymatique qui permette d’appréhender l’influence de certains de ces facteurs. Michaelis et Menten déterminèrent, de manière d’abord empirique, une relation entre vitesse de réaction et concentration en substrat dépendant de deux paramètres liés à l’enzyme (Michaelis & Menten 1913; Cornish-Bowden 2004) : où v est la vitesse de réaction, cS la concentration en substrat et vmax et Km les deux paramètres en question. Le premier paramètre, vmax, représente la vitesse maximale que la réaction peut atteindre en présence d’une quantité fixe d’enzyme et pour un quantité saturante du substrat. Ce paramètre dépend linéairement de la quantité d’enzyme et traduit son efficacité à réaliser la transformation chimique. Définie en termes de nombre de molécules de substrat converties par une enzyme en une seconde, cette efficacité peut s’échelonner sur plusieurs ordres de grandeur, de 0.5 s-1 pour le lysozyme à 600 000 s-1 pour la carbonate déshydratase (Stephanopoulos et al. 1998; Barthelmes et al. 2007). Le second paramètre, Km, également appelé constante de Michaelis, est égal à la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de la réaction vaut ! vmax (voir Figure 5). Ce paramètre est indépendant de la quantité d’enzyme et traduit l’affinité de l’enzyme au substrat (un Km plus faible traduit une affinité plus élevée).

Aux concentrations élevées de substrat (cS >> Km), la vitesse de la réaction tend vers vmax. L’enzyme est saturée et la vitesse de la réaction dépend linéairement de sa quantité. Aux concentrations faibles de substrat (cS << Km), la vitesse de la réaction tend vers (vmax/Km).cS auquel cas elle dépend linéairement de la concentration en substrat et en enzyme. La concentration Km délimite en quelque sorte les deux régimes de fonctionnement.

La cinétique de Michaelis-Menten traduit un mécanisme réactionnel relativement simple et en réalité beaucoup d’enzymes suivent des cinétiques bien plus complexes (Cornish-Bowden 2004). Elle est en revanche illustrative des influences respectives des enzymes et métabolites sur les flux de réaction et elle permet d’introduire les phénomènes de contrôle des réactions.

Contrôle des réactions métaboliques

Que la cinétique d’une réaction enzymatique soit Michaelienne ou non, l’enzyme en elle-même influence largement le flux de la réaction. Celui-ci dépend en effet à la fois de la quantité d’enzymes présentes et de leur efficacité à catalyser la réaction. Cette dépendance est exploitée de manière fondamentale par les organismes pour contrôler leur métabolisme, que ce soit simplement pour activer ou inactiver des réactions ou, de manière plus élaborée, pour ajuster finement la vitesse des réactions en fonction de leurs besoins. Les processus biologiques de contrôle sont généralement désignés sous le terme de régulation métabolique. On distingue typiquement deux grandes catégories de contrôles : (1) l’ajustement de la quantité d’enzymes et (2) la modulation directe de leur activité.

La régulation de la quantité d’enzymes s’opère communément en modulant les vitesses de production et de dégradation des enzymes (Stephanopoulos et al. 1998, pp.173-180). Des mécanismes complexes de régulation permettent en effet d’activer ou d’inhiber la transcription et la traduction de protéines en réponse à un signal particulier (par exemple la présence ou l’absence d’un métabolite particulier). Les microorganismes utilisent largement ce type de mécanisme, notamment pour adapter leur métabolisme aux environnements chimiques qu’ils rencontrent en ne produisant que les enzymes appropriées à l’environnement. De même, en adressant les enzymes

à des localisations spécifiques dans l’organisme, celui-ci peut contrôler à quel endroit les réactions se dérouleront, permettant par exemple d’éviter des interactions chimiques indésirables entre métabolites.

De nombreux mécanismes permettent également de réguler l’efficacité catalytique des enzymes. D’une part, les enzymes peuvent être totalement inactivées ou activées par des modifications covalentes irréversibles de leur structure ; ces modifications consistent fréquemment à les phosphoryler, ou à leur ajouter ou enlever divers groupes fonctionnels par l’intermédiaire de protéines ou de métabolites particuliers. D’autre part, et il s’agit de la classe de mécanisme la plus courante, des métabolites inhibiteurs ou activateurs peuvent interagir avec l’enzyme – souvent de manière réversible – pour modifier graduellement son activité. Divers mécanismes ont été identifiés, chacun conduisant à des comportements cinétiques souvent distinguables (Cornish-Bowden 2004). Ainsi, le métabolite régulateur peut tout aussi bien être un analogue du substrat et agir en tant que concurrent pour l’accès au site actif de l’enzyme, ou être différent et agir via un autre site sur la conformation de l’enzyme et altérer son efficacité catalytique ou son affinité au substrat (cas des enzymes allostériques).

Ces mécanismes de régulation agissent souvent de manière fine sur les flux des réactions en réponse à des signaux variés. Ceux-ci sont indispensables à l’organisme car ils lui permettent de réellement contrôler son « usine biochimique », pour notamment assurer la stabilité de sa composition chimique, économiser la production d’enzymes inutiles (en programmant par exemple leurs productions uniquement au moments opportuns (Zaslaver et al. 2004)) et répondre aux changements ou stimulus de leurs environnements (voire même les anticiper (Tagkopoulos et al. 2008; Mitchell et al. 2009) !).

Aspects thermodynamiques

Du point de vue thermodynamique, les organismes vivants sont des systèmes particuliers. Ils appartiennent à la classe des systèmes dissipatifs dont la caractéristique principale est de maintenir voire d’accroître leurs états d’ordre interne en prenant de l’énergie au milieu extérieur et lui retransmettant de l’entropie. Pour ce faire, ces systèmes doivent se maintenir en permanence hors de l’état d’équilibre grâce à leurs échanges avec leur environnement ; ils sont fondamentalement ouverts10 et tout arrêt de ces échanges conduit à leur disparition. Dans le cas des cellules vivantes, le maintien de cet état hors d’équilibre leur permet de croître et d’assurer la permanence de l’organisation de leur structure. Le métabolisme assure donc l’échange continuel de matière et d’énergie avec l’environnement : il exploite en général11 l’énergie de métabolites d’énergie élevée et d’entropie faible importés de l’environnement en les transformant en métabolites d’énergie plus faible mais d’entropie plus élevée (von Stockar & Liu 1999; Stephanopoulos et al. 1998). De manière à assurer un flux de transformation permanent, qui est donc thermodynamiquement fondamental pour la vie de l’organisme, les réactions du métabolisme sont également elles-mêmes hors d’équilibre.

L’enthalpie libre de réaction, notée !rG, permet de décrire le sens d’évolution spontané des réactions. À température et pression constante, la réaction opère en effet dans le sens de diminution de l’enthalpie libre, tel que !rG < 0. Dès lors que !rG atteint zéro, le flux net de la réaction devient nul. Le métabolisme doit ainsi s’assurer que les enthalpies libres des réactions sont bien négatives pour transformer les métabolites avec un flux net positif.

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Table des matières

INTRODUCTION
1 LE METABOLISME : LA CHIMIE DU VIVANT
1.1 QUELQUES FAITS REMARQUABLES
1.2 LES ACTEURS DU METABOLISME
1.2.1 Métabolites
1.2.2 Réactions
1.2.3 Enzymes
1.2.4 Cinétique des réactions métaboliques
1.2.5 Contrôle des réactions métaboliques
1.2.6 Aspects thermodynamiques
1.3 STRUCTURE ET ORGANISATION DU METABOLISME
1.3.1 Le réseau métabolique
1.3.2 Organisation globale du métabolisme
1.4 METHODES D’EXPLORATION DU METABOLISME
1.4.1 Élucidation expérimentale des voies métaboliques
1.4.2 Méthodes bioinformatiques de reconstruction des réseaux métaboliques
1.4.3 Vers une étude globale du métabolisme
2 PHENOTYPES DE CROISSANCE ET ESSENTIALITE DE GENES
2.1 PHENOTYPES DE CROISSANCE
2.2 EXPLORATION GENETIQUE DES PHENOTYPES DE CROISSANCE
2.2.1 Techniques expérimentales
2.2.2 Exploitation des données d’essentialité
3 MODELISATION DU METABOLISME
3.1 APPROCHES DE MODELISATION DU METABOLISME
3.2 LES MODELES A BASE DE CONTRAINTES : RECONSTRUCTION ET APPLICATIONS
3.2.1 Article de revue
3.2.2 Compléments méthodologiques
3.3 MODELISATION DU METABOLISME ET PHENOTYPES DE CROISSANCE: ETAT DE L’ART
3.3.1 Modèles à base de graphe
3.3.2 Modèles à base de contraintes
4 NOTRE ORGANISME MODELE : ACINETOBACTER BAYLYI ADP1
4.1 CARACTERISTIQUES REMARQUABLES
4.2 ANNOTATION DU GENOME
4.3 COLLECTION DE MUTANTS DE DELETION
5 SYNTHESE ET OBJECTIFS DE LA THESE
6 PROCESSUS DE RECONSTRUCTION
6.1 IDENTIFICATION DES ACTIVITES METABOLIQUES
6.2 ADAPTATION AUX « CONTRAINTES » DE MODELISATION
6.2.1 Fonctionnement des voies métaboliques
6.2.2 Équilibre des équations bilans
6.2.3 Conservation de l’énergie
6.2.4 Localisation cellulaire
6.2.5 Spécificité des métabolites
6.2.6 Réversibilité des réactions
6.2.7 Associations gènes-réactions
6.2.8 Composition de la biomasse
7 LE MODELE D’ACINETOBACTER BAYLYI
7.1 COMPOSITION METABOLIQUE GLOBALE
7.2 PREDICTIONS QUANTITATIVES DE CROISSANCE
7.2.1 Comparaison des prédictions de taux de croissance à des mesures expérimentales
7.2.2 Sensibilité des prédictions de taux de croissance aux paramètres énergétiques
7.3 DISPONIBILITE DU MODELE EXPLOITATION DES PHENOTYPES DE CROISSANCE DE MUTANTS PAR LE MODELE
8 ARTICLE : « ITERATIVE RECONSTRUCTION OF A GLOBAL METABOLIC MODEL OF ACINETOBACTER BAYLYI ADP1 USING HIGH-THROUGHPUT GROWTH PHENOTYPE AND GENE ESSENTIALITY DATA »
9 SYNTHESE
9.1 LE MODELE CONFRONTE EFFICACEMENT DONNEES PHENOTYPIQUES ET CONNAISSANCE DU METABOLISME
9.2 CADRE FORMEL D’INTERPRETATION DES INCOHERENCES
9.3 EXPLOITATION DES INCOHERENCES NON CORRIGEES
9.4 LIMITES
9.4.1 Interprétation des phénotypes de croissance faible
9.4.2 Incohérences d’origine métabolique non prises en compte
10 EXTENSION DE L’INTERFACE WEB DE PREDICTION A D’AUTRES ORGANISMES : CYCSIM AUTOMATISATION DE L’INTERPRETATION DES INCOHERENCES D’ORIGINE GENETIQUE
11 LA METHODE AUTOGPR
11.1 PRINCIPE
11.2 ALGORITHMES
11.2.1 Génération exhaustive des corrections GPR
11.2.2 Test d’existence de correction GPR
12 RESULTATS
12.1 COMPLEXITE DES GPR DANS LES MODELES METABOLIQUES
12.2 STATISTIQUES GLOBALES SUR LES PROPOSITIONS D’AUTOGPR
12.2.1 Confrontation des modèles aux données d’essentialité
12.2.2 Tests simples d’existence de correction GPR
12.2.3 Proposition exhaustive de corrections GPR
12.3 COMPARAISON DES CORRECTIONS D’AUTOGPR AUX INTERPRETATIONS EXPERTES
12.3.1 Comparaison aux corrections des modèles d’A. baylyi
12.3.2 Comparaison aux interprétations expertes des modèles de B. subtilis et S. cerevisiae186
13 LIMITES ET PERSPECTIVES
13.1 REDUCTION DE LA COMBINATOIRE DES PROPOSITIONS DE CORRECTION
13.2 AMELIORATION DE LA SPECIFICITE POUR LES CORRECTIONS DE GENES NON ESSENTIELS
13.3 AU DELA DES TROIS HYPOTHESES FONDAMENTALES D’AUTOGPR
13.3.1 Associations gène-réaction prédéfinies
13.3.2 Composantes RESEAU et BIOMASSE fixes
13.3.3 GPR constantes sur tous les milieux
13.4 PERSPECTIVES D’UTILISATION DES DELETIONS MULTIPLES
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
14 CONTRIBUTIONS PRINCIPALES
15 REVUE DE TRAVAUX SUR LE MEME SUJET EFFECTUES SUR LA PERIODE DE LA THESE (2005–2009)
16 PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE