Phénotypage des lignées de Niébé pour la résistance au Striga

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Rétrocroisement et amélioration des plantes

Elle consiste à réaliser des séries de croisements entre une variété receveuse ou élite et une variété donneuse du caractère. Les descendants ayant introduit le caractère sont ensuite croisés pendant plusieurs générations avec le parent receveur, ce qui permet d’augmenter la part de la lignée receveuse dans le fond génétique des descendants. Cette technique permet d’obtenir des descendants identiques à la variété receveuse, mais contenant en plus le caractère désiré (Harlan et Pope en 1922).

Importance du niébé

Cultivé depuis longtemps au Sénégal, le niébé joue un rôle primordial dans l’alimentation de base pauvre en minéraux organiques indispensables. La graine mûre est très riche en protéines, en amidon, et en vitamine B tel que l’acide folique qui est important dans la prévention de malformation chez le nouveau-né (Chevalier, 1944). La graine est également riche en micro-éléments essentiels, tels que le fer, le calcium et le zinc. C’est aussi une excellente source de fibres alimentaires. Des études sur la teneur en éléments nutritifs contenus le niébé ont été menées par Luiz et al., (2006). Les résultats sont illustrés dans le tableau 1.
La graine sèche est aussi moulue et consommée dans plusieurs plats traditionnels africains, comme la bouillie, le pain, l’aliment de sevrage pour enfants ou encore transformée en beignets (Akara au Sénégal et tchétchéna au Niger).

Facteurs limitant la production du niébé

Parmi les facteurs limitant la production du niébé on peut noter les facteurs abiotiques (salinité, sécheresse etc…) et biotiques appartenant à divers groupes (champignons, bactéries, virus, nématodes etc.) mais surtout la plante parasite Striga gesnorioides (Fig. 1).
Cette plante constitue un obstacle important dans la production du niébé dans toutes les zones agro-écologiques du Sénégal où la plante est cultivée (Lane et al., 1997).
Le S. gesnorioides (Willd.)Vatke est un parasite obligatoire des dicotylédones à feuilles larges de plusieurs familles, dont les Leguminoseae, les Convolvulaceae, les Euphorbiaceae et les Solanaceae (Hibberd et al., 1996).
Cette mauvaise herbe parasite aussi plusieurs adventices, parmi lesquelles l’indigotier (Indigo fera hirsuta L.) aux États-Unis (Wunderlin et coll, 1979).
Cette plante semble démontrer une spécificité très élevée vis-à-vis de ses hôtes respectifs (Berner et al, 1995). Les caractères morphologiques du S. gesnorioides varient aussi d’un hôte à l’autre (Aggarwal, 1985). Son cycle biologique est très bien adapté aux conditions climatiques difficiles. Les graines de S. gesnerioides nécessitent une période de 6 à 7 mois de post-maturation en conditions sèches et chaudes (Thalouam et Fer, 1993), à une température comprise entre 25 et 35°C (Worsham, 1987; Kuiper et al, 1996). Ces graines ont aussi besoin d’une période d’imbibition de 10 à 21 jours avant de pouvoir germer, généralement en début de saison des pluies (Okonkwo, 1991).
Après contact avec une racine de l’hôte, la radicule de Striga cesse de croître, et les papilles s’allongent en direction de la surface de la racine. Environ 48 heures après le contact, les radicules pénètrent dans les couches cellulaires superficielles de la racine. Par la suite, la radicule croît au travers du cortex grâce à des cellules intrusives, et prend une forme conique et s’appelle alors haustorium primaire (Nwoke, 1978).
Des pectinases ou d’autres enzymes permettant de dégrader les parois cellulaires, comme les hémi cellulases et les cellulases, pourraient être impliquées dans le processus de pénétration, même si on n’a pas pu le démontrer de façon claire (Bailey, 1998).

Les biotypes de Striga gesnorioides

Des travaux réalisés sur divers cultivars de niébé mettent en évidence l’existence de différents biotypes (Fig.2), ou races physiologiques du S. gesnorioides (Touré et al., 1998).
La spécificité du S. gesnorioides envers ses différents hôtes a permis de différencier les races existantes. À l’heure actuelle, 6 races distinctes du parasite, possédant chacune une virulence spécifique envers différents cultivars de niébé (Lane et al., 1997) ont été proposées. Ainsi, la race 1 est surtout présente au Burkina Faso, mais aussi au Mali, au Togo et au Nigeria, alors que la race 2 est exclusive du Mali, et que la race 3 n’est retrouvée qu’au Niger et au Nigeria (Lane et al., 1997).
La race 4 ne se retrouve qu’au sud du Bénin (Lane et al., 1994). La cinquième race, identifiée en 1995, est retrouvée un peu partout en Afrique de l’Ouest, soit au Bénin, au Burkina Faso, au Cameroun et au Nigeria (Moore et al., 1995; Lane et al., 1997). La race 6 n’est recensée pour le moment qu’au Sénégal (Botanga et Timko, 2006).

Les moyens de luttes contre le striga

Plusieurs méthodes existent pour lutter contre cette plante parasite. Il y a notamment l’arrachage à la main des plants de Striga émergés, les rotations avec des faux hôtes qui font germer les graines sans permettre l’attachement (trap crops) (Vissoh et al., 2008), la lutte biologique avec l’utilisation du Fusarium (Sauerborn et al., 2007; Zahran et al., 2008), et la lutte chimique par l’utilisation d’éthylène ou divers herbicides.
L’utilisation de variétés résistantes, en combinaison avec des pratiques culturales appropriées, est cependant la méthode la plus adéquate, la plus accessible et la plus simple pour lutter contre le Striga. (De Groote et al., 2008).

Marqueurs moléculaires et amélioration des plantes

La notion de marqueur génétique ou moléculaire, a été introduite en 1980. Il s’agit d’une séquence d’ADN repérable spécifiquement sur le chromosome. En cartographie génétique, le marqueur est utilisé pour baliser le génome (INRA, 2012).

Les différents types de marqueurs

Il existe plusieurs types de marqueurs moléculaires. Les marqueurs biochimiques les plus utilisés sont les isozymes. Ils correspondent aux différentes formes d’une même enzyme et permettent de déterminer la présence de l’allèle correspondant à chacune de ces formes. Ce sont donc des révélateurs du polymorphisme entre individus pour les séquences codantes du génome.
Les marqueurs de l’ADN sont à l’heure actuelle les plus utilisés. Ils correspondent à des séquences codantes ou non, présentant un polymorphisme selon les individus. Les plus utilisés sont le marqueurs RFLP, RAPD, AFLP, microsatellites et SNP (INRA, 2012).

Les marqueurs SSR

Principalement développées par Zietkiewicz et al (1994), les SSR sont des régions spécifiques du génome constituées de courtes séquences d’ADN répétées en tandem sur le chromosome. Ils sont très polymorphes, dispersés à travers le génome, et sont détectés par PCR en utilisant des amorces flanquant les répétitions. La révélation se fait sur des gels d’agarose.
Les SSR sont très utilisés dans les études de diversité d’espèces agronomiques d’une part et d’autre part pour la cartographie génétique et la détection de QTL (Quantitative Trait locus) impliqués dans la résistance aux maladies ou dans la variation de caractères agronomiques intéressants (Gupta et al, 2008).
Les marqueurs SSR ont été utilisés chez le niébé pour l’analyse de la diversité génétique de l’espèce et pour la construction de carte de liaison génétique. En ce qui concerne la construction de cartes génétiques, une carte saturée a été développée par Andargie et al (2011) à partir de lignées recombinantes obtenues suite au croisement entre les variétés 219-01 et 524B. Dans ce travail 912 marqueurs SSR ont été testés. Sur ces derniers uniquement 639 ont donné un produit d’amplification et 202 polymorphes ont été utilisés pour la construction de la carte. Plusieurs QTL majeurs impliqués dans le développement de la graine ont été positionnés sur cette carte. Des travaux de cartographie récents réalisés par Asare et al (2013) ont permis d’identifier deux marqueurs SSR1 et C42-2B très proches du gène de résistance au striga. Ces deux marqueurs possèdent des pouvoirs de détection des lignées résistantes très remarquables de 93% pour SSR1 et de 87.5% pour C42-2B.

Les marqueurs SNP (Single Nucléotide Polymorphisme)

Les récents progrès en matière d’analyse de séquences d’ADN et la mise au point de séquençage à haut débit ont rendu possible l’identification et l’analyse de la variation nucléotidique à grande échelle. Le SNP est défini comme étant un polymorphisme mono nucléotidique se trouvant dans les régions codantes (SNPc) et dans les régions régulatrices des gènes. Les SNP constituent la forme la plus abondante de variation génétique dans le génome.
Les travaux de Muchero et al en 2009 (Tableau 2) ont permis de construire une carte consensus du niébé contenant 11 groupes de liaisons. Pour cette carte, 1536 marqueurs SNP, 6 populations de lignées recombinantes d’un nombre total de 741 lignées ont été utilisés (Tableau 3). Parmi ces SNP environ 90 % étaient faciles d’utilisation, soit un total de 1375 marqueurs fiables. Sur ces derniers sélectionnés 928 ont été intégrés dans la carte consensus qui couvre une distance totale de 680 CM et une distance moyenne entre les marqueurs de 0,73 CM.

Extraction d’ADN sur papier FTA (Flinders Technology Associates)

Elle a été réalisée sur des feuilles fraîches préalablement récoltées, enroulées dans du papier aluminium et mis dans de la glace. Les feuilles ont été ensuite déposées sur le papier FTA subdivisé en quatre parties distinctes. Chacune des parties a été soigneusement numérotées.
À l’aide d’un petit marteau, les feuilles ont été étalées sur le papier jusqu’à ce que celui-ci change de couleur et vire au vert clair, puis le papier a été séché dans une étuve. Après le séchage, un disque a été prélevé sur chaque partie à l’aide d’un stylet puis déposé dans un tube. Deux cents microlitres de solution de purification ont ensuite été ajouté dans les tubes contenant les disques pendant 5 min. Après, cette solution de purification a été éliminée et les disques ont été conservés dans les tubes. Ces étapes ont été répétées 2 fois de suite. Pour le TE 1X on a utilisé la même procédure que pour la solution de purification. Les disques ont ensuite été séchés pendant 1h 30 min à l’étuve à 37°C. Cette étape a permis d’obtenir des disques purifiés contenant de l’ADN prêt à être utilisé.

Extraction d’ADN par du tampon MATAB

Pour cette extraction 100 à 150 mg de feuilles fraîches ont été prélevées. Elles ont été ensuite placées dans un mortier contenant 750 µl de tampon Matab, puis broyées manuellement à l’aide d’un petit pilon. Les broyats ont été ensuite transférés dans un tube eppendorf de 2 ml, puis homogénéisé pendant quelques secondes et incubés dans un bain-marie pendant 20 min. Les échantillons ont été homogénéisés toutes les 5 min et remis dans le bain. Les tubes ont été ensuite refroidis à température ambiante pendant 5 min avant d’ajouter de 750 µl de Chloroforme Isoamyl Alcool (CIAA), homogénéisés et centrifugés à 13000 rpm pendant 20 min à 4°C. Apres cette étape, 600µl du surnageant ont été prélevés et transférés dans un autre tube de 1,5 ml puis 600 µl d’isopropanol à froid ont été ajoutés. Les tubes ont ensuite été agités légèrement jusqu’à la formation d’une pelote d’ADN puis conservés pendant 2 h au congélateur à -20°C. Les tubes ont été centrifugés à 13000 rpm pendant 20 min à 4 °C. Après centrifugation, le surnageant a été éliminé et le culot d’ADN lavé en ajoutant 500 µl d’éthanol (70%). Les tubes ont été de nouveau centrifugés à 13000 rpm pendant 20 min à 4°C.
Le surnageant a été éliminé et le culot séché pendant 1h dans une étuve à 37 C puis l’ADN a été dissout dans 50 à 150 µl d’eau distillée à température ambiante pendant une nuit.

Extraction d’ADN par du DNAZOL

C’est une technique d’extraction simple qui est réalisée en quelques heures. Pour sa réalisation des jeunes feuilles ont été prélevées et déposées dans de la glace.
100 à 150 mg de feuilles ont été pesés et déposés dans un mini-mortier, auxquels ont été ajoutés 750 µl de DNAZOL. Le broyat obtenu a été placé dans des tubes de 2ml puis 750 µl de CIAA ont été ajoutés et l’ensemble homogénéisé délicatement. Les tubes ont été centrifugés à 1200 rpm pendant 20 min puis 600 µl du surnageant ont été prélevés et transférés dans un nouveau tube. Dans ce tube, un volume équivalent d’isopropanol a été ajouté et centrifugé à 5000 rpm pendant 5 min. Le culot d’ADN a été lavé avec 600 µl d’éthanol (70%) puis centrifugé à 5000 rpm pendant 5 min. Il a été ensuite séché à l’étuve pendant 30 min à 37 °C. L’ADN a enfin été dissous dans 50 µl de TE 1X à température ambiante pendant 1h.

Quantification d’ADN

La quantification de l’ADN a été réalisée sur un gel d’agarose à 1%. Les concentrations ont été estimées en référence à l’intensité des bandes du marqueur de taille Smart Ladder correspondant à des concentrations connues.

Electrophorèse sur gel d’agarose

La migration a été réalisé sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon TBE 0,5X contenant 5 µl de BET (0.5 µg/ml) pendant 30 min à 100 mA. La visualisation a été réalisée sous lumière UV (302/312 nm) et la capture d’image à l’aide d’un appareil photo numérique (Canon).

Criblage des marqueurs SSR et SNP

102 marqueurs: 89 SSR et 13 amorces reconverties en PCR spécifiques provenant d’AFLP (C42-2B) et de séquences de SNP ont été testés sur les 12 accessions de niébé.
Le marqueur C42-2B a été choisi car plusieurs auteurs l’ont trouvé lié à la résistance au Striga (Li and Timko, 2009, Asare et al, 2013). Une queue M13 de 19 paires de base (Voire annexe) a été rajoutée aux amorces sens de chaque marqueur pour permettre leur marquage avec un fluochrome au cours de la PCR. Les PCR ont ensuite été réalisées à des températures d’hybridation (Voir annexe) spécifiques pour chaque marqueur afin d’obtenir des produits d’amplification qui ont été séparés par électrophorèse à l’aide d’un séquenceur.

L’amplification de l’ADN

La PCR a été réalisée dans un volume total de 10 µl, contenant 5 µl d’ADN génomique à une concentration de 5ng/ µl et 5 µl d’un mélange de dNTP (200µM), de tampon 10X (1.08µl), de MgCl (0.50 mM), d’amorces sens et antisens (0.10 µM), d’une amorce M13 marquée à l’IRD 700 ou 800, de Taq et d’eau. L’amorce marquée à l’IRD 700 ou 800 sert à marquer les amplifiats en cours de la PCR. Les concentrations de chacun des constituants du mélange sont consignées dans le tableau 4.

Table des matières

INTRODUCTION
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Caractéristiques botaniques du niébé
2. Généralité sur le niébé
3. Rétrocroisement et amélioration des plantes
4. Importance du niébé
5. Facteurs limitant la production du niébé
6. Les biotypes de Striga gesnorioides
7. Les moyens de luttes contre le striga
8. Marqueurs moléculaires et amélioration des plantes
8.1 Les différents types de marqueurs
8-2 Les marqueurs SSR
8-3 Les marqueurs SNP (Single Nucléotide Polymorphisme)
9. Bulk Segregant Analysis (BSA)
MATÉRIEL ET MÉTHODES
1. Matériel végétal
2. Origine de la population BC1F6
3. Phénotypage des lignées de Niébé pour la résistance au Striga
4. Génotypage
4.1. Extraction de l’ADN
4.2 Extraction d’ADN sur papier FTA (Flinders Technology Associates)
4.3 Extraction d’ADN par du tampon MATAB
4.4 Extraction d’ADN par du DNAZOL
5. Quantification d’ADN
6. Electrophorèse sur gel d’agarose
7. Criblage des marqueurs SSR et SNP
7.1 L’amplification de l’ADN
7.2 Migration des amplifiats sur le séquenceur (Licor® modèle 4300)
8. Méthodologie du bulk ségrégant Analysis
8.1 Extraction d’ADN et quantification des Bulks
8.1.1 Extraction d’ADN
8.1.2 Quantification des Bulks
9. Analyse de l’association marqueurs et gène de résistance au Striga
RÉSULTATS
2. Résultats des quantifications
3. Criblage sur le licor4300 des marqueurs SSR et SNP
4. Criblage sur les lignées BC1F6 choisies
5. Bulk Segregant Analysis
6. Association marqueurs et gène de résistance au Striga
DISCUSSION
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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