Soutenance mémoire
Mécanismes de l’inflammation
Le déroulement du processus inflammatoire est toujours le même. Il évolue en trois stades successifs :
– un stade caractérisé par les réactions vasculo-sanguines
– un stade caractérisé par les réactions cellulaires (phase productive)
– un stade de cicatrisation.
Phase vasculaire de l’inflammation
La congestion active est due à une vasodilatation survenant après une brève phase de vasoconstriction qui favorise l’hémostase. Elle est artériolaire puis capillaire, d’où une augmentation du débit sanguin mais un ralentissement circulatoire. Elle se traduit par une distension des capillaires qui apparaissent gorgés de sang, bordés par un endothélium turgescent.
Elle est déterminée par :
– un mécanisme nerveux (nerfs vasomoteurs)
– un mécanisme chimique impliquant l’histamine, la sérotonine, les kinines et les prostaglandines. L’action de l’histamine mastocytaire n’explique que les réactions vasculaires précoces, qui sont relayées notamment par les kinines.
L’oedème inflammatoire est un phénomène actif dû au passage, à partir des vaisseaux congestifs, vers le milieu interstitiel, d’un liquide proche du plasma. Ce passage est lié à l’augmentation de la pression hydrostatique et surtout à l’augmentation de la perméabilité de la paroi vasculaire des capillaires et des veinules.
Phase cellulaire de l’inflammation
Les phénomènes vasculo-exsudatifs initiaux permettent l’arrivée dans le foyer inflammatoire des leucocytes. Les premiers sur place sont les polynucléaires. Ils sont le stigmate morphologique d’une inflammation aiguë. En fonction de la cause de l’inflammation, ceux-ci pourront persister sur place et s’accumuler en étant à l’origine d’une suppuration. Le plus souvent, les polynucléaires sont progressivement remplacés sur le site inflammatoire par les cellules mononuclées (les macrophages par exemple).
Lorsque l’inflammation se chronicise, l’infiltrat inflammatoire est généralement constitué d’une majorité de cellules mononuclées. La composition cellulaire de l’infiltrat inflammatoire varie donc en fonction du temps, de la cause de l’inflammation. Au niveau du site de l’inflammation sont également sécrétés de nombreux facteurs de croissance qui permettent la multiplication de néo vaisseaux, des fibroblastes du tissu interstitiel et éventuellement la régénération du tissu lésé.
Cicatrisation
La cicatrisation normale
Le tissu formé après la phase vasculo-exsudative de l’inflammation est le bourgeon charnu ou blastème de régénération.
L’évolution du processus inflammatoire se fait souvent vers une cicatrisation complète, sans séquelle, c’est-à-dire avec restitution intégrale des tissus préexistants.
Cicatrisation pathologique: la fibrose
Parfois, en particulier lorsque les conditions nécessaires à une bonne cicatrisation ne sont pas remplies, l’évolution est moins favorable. Le bourgeon charnu se développe exagérément. Beaucoup d’organes détruits n’ont pas la capacité de régénérer du fait de l’existence de cellules spécialisées (fibres myocardiques, glomérules rénaux, neurones…). Le parenchyme détruit initialement est remplacé par une fibrose.
Action des prostaglandines sur le muscle utérin
L’influence des prostaglandines sur le muscle utérin in vitro varie selon l’état physiologique du tissu au moment du prélèvement (période du cycle menstruel, grossesse). La PGF2α provoque toujours une contraction du muscle utérin qui devient maximale en période prémenstruelle pour l’utérus non gravide et vers la fin de la grossesse pour l’utérus gravide.
In vivo l’administration de PG naturelles, provoque une élévation du tonus de la musculature utérine, suivie de contractions rythmiques s’apparentant au travail physiologique qui survient en fin de grossesse (Giroud et coll. 1988).
Les anti-inflammatoires
Les médicaments anti-inflammatoires permettent de suspendre ou de ralentir le processus d’inflammation, d’en effacer ou d’en atténuer les manifestations cliniques, parfois même d’en guérir les lésions mais non d’en traiter la cause (Bastide et coll., 1993).
Ils se classent en deux grandes classes : les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et les anti-inflammatoires stéroïdiens.
Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)
Ils sont mieux définis comme étant la classe médicamenteuse qui possède les mêmes propriétés pharmacologiques que l’acide acétylsalicylique (aspirine) : analgésique, antipyrétique, anti-inflammatoire. Ils ont une action symptomatique rapide. Ils n’ont pas d’action sur les processus pathologiques chroniques. L’arrêt de l’AINS est suivi de la reprise de la symptomatologie inflammatoire.
La diminution de la production tissulaire des prostaglandines et thromboxanes du fait de l’inhibition de la cycloxygénase est le mécanisme d’action commun à tous les AINS (Chauvelot-Moachon et coll. 1988).
En dehors de l’action sur la cyloxygénase, d’autres mécanismes d’action à l’échelon cellulaire et moléculaire sont proposés pour expliquer notamment les effets antiinflammatoires des AINS :
? Découplage de la phosphorylation oxydative : entraînant une diminution de l’énergie nécessaire au processus inflammatoire.
? Action sur les polynucléaires neutrophiles : ce qui a pour conséquence une diminution dans la quantité des différents médiateurs de l’inflammation libérés par les cellules.
? Captation de radicaux libres réactifs : conduisant à l’inhibition de l’activation des cycloxygénases et à l’élimination de certaines des manifestations de la réaction inflammatoire.
Les AINS ont en commun un certain nombre d’effets secondaires qui obligent à prendre des précautions lors de leur emploi :
? Troubles digestifs sans gravité immédiate : douleurs épigastriques, nausées, vomissements
? Oedèmes de Quincke, rétention hydro sodée
? Accidents cutanés : syndrome de Lyell
? Accidents gastriques : perforation, hémorragies digestives
? Accidents sanguins
? Toxicité hépatique : risque de survenue d’hépatite toxique
? Toxicité rénale : syndrome néphrétique, réduction de la filtration glomérulaire
? Poussées hypertensives : décompensation cardiaque
? troubles neuropsychiques et neurosensoriels (Chauvelot-Moachon et coll. 1988) ; (Moulin, 1998). Ils sont repartis en huit principales classes chimiques (Chauvelot-Moachon et coll. 1988).
Les anti-inflammatoires stéroïdiens
Les anti-inflammatoires stéroïdiens couramment dénommés « corticoïdes » sont des substances ayant en commun une analogie structurale avec une hormone corticosurrénalienne, le cortisol.
Le cortisol est sécrété par les zones fasciculées surtout et réticulées de la corticosurrénale. Il possède des effets physiologiques variés et joue un rôle dans la réponse au stress. Il permet la mobilisation rapide des réserves énergétiques de l’organisme, glucides, lipides, protides et agit sur tous les grands métabolismes de l’organisme (www-sante.ujf-grenoble.fr).
Les glucocorticoïdes inhibent la phospholipase A2 et bloque ainsi la libération de l’acide arachidonique à partir des fractions phospholipidiques des membranes cellulaires. La synthèse des prostaglandines et des leucotriènes est inhibée (Moulin, 1998).
Les effets secondaires liés à l’utilisation des corticoïdes sont entre autres :
Désordres hydroélectriques, troubles de régulation avec hyperglycémie, fragilité cutanée, aménorrhée chez la femme et retard de croissance chez l’enfant, ulcères gastroduédonaux, immunodépression.
Quelques Anti-inflammatoires Stéroïdiens : Clobétasol propiate 0,05%, Bêtaméthasone, Fluocinolone, Dexaméthasone, Cortisone, Prednisolone.
Méthodes d’étude de l’activité anti-inflammatoire (Cohen, 1986)
Erythème aux rayons ultraviolets chez le cobaye
On apprécie l’intensité de la coloration de la peau épilée du dos du cobaye soumise aux rayons UV en absence et en présence d’anti-inflammatoires.
Perméabilité capillaire chez le lapin
On met en évidence une exsudation plasmatique par l’injection intraveineuse de bleu de Trypan ou de bleue Evans qui se lient aux protéines plasmatiques. L’étendue de la diffusion du bleu dans la substance fondamentale est réduite en présence d’anti-inflammatoires.
OEdème de la patte du rat
L’exsudation est évaluée par le gonflement de la patte postérieure du rat après injection intra articulaire d’un agent phlogogène comme la carraghénine.
On mesure le diamètre de l’articulation tibiotarsienne à l’aide d’un pied à coulisse, on estime le volume dans un pléthysmomètre imaginé par Chevillard et Giono, ou l’on pèse la patte sélectionnée à l’articulation. La deuxième phase de l’inflammation est explorée par cet essai.
Granulome à la carraghénine chez le rat
Elle consiste à insérer dans le tissu cellulaire sous-cutané contre la cage thoracique une petite boule de coton imprégnée de carraghénine et à peser le tissu de prolifération au bout de sept jours. Les corticoïdes sont très actifs sur ce test.
Arthrite à l’adjuvant de Freud
Une réaction oedémateuse se développe immédiatement (inflammation primaire) après injection intra articulaire dans la patte postérieure du rat d’adjuvant de Freud (suspension de bacilles tuberculeux tués ou émulsion de cire D de bacille tuberculeux). En deux ou trois semaines apparaissent à distance, sur la patte postérieure contra latérale, sur les pattes antérieures, à la queue, aux oreilles, une réaction inflammatoire avec gonflement, rougeur, échauffement et douleur (inflammation secondaire). Les anti-inflammatoires administrés pendant l’essai empêchant la réaction primaire et la réaction secondaire.
Activité antibactérienne
Les antibiotiques
Définition : ils sont définis par Turpin et Velu comme : « Tout composé chimique, élaboré par un organisme vivant ou produit par synthèse, à coefficient chimiothérapeutique élevé dont l’activité thérapeutique se manifeste à très faible dose, d’une manière spécifique, par l’inhibition de certains processus vitaux, à l’égard des virus, des micro-organismes ou même de certaines cellules des êtres pluricellulaires » (Nevot et coll., 1979).
Classification
Pour classer un antibiotique actuellement il est fait appel à quatre notions essentielles qui concernent non pas tant son origine que sa nature chimique, son mécanisme d’action, son spectre et ses modalités d’action.
Nature chimique
Les antibiotiques de nature osidique : holosidiques (aminosides), hétérosidiques (macrolides, rifamycine, novobiocine, lincomycine, clindamycine).
Les antibiotiques de nature protidique : chloramphénicol, les bêtalactamines, polymyxine.
Les antibiotiques de nature lipidique (l’acide fusidique).
Les antibiotiques à cycles condensés (tétracyclines).
Mécanisme d’action
Action sur la paroi : bacitracine, vancomycine, ristocétine et bêtalactamines.
Action sur la membrane cytoplasmique : polymyxines, gramicidine.
Action sur la réplication de l’ADN : acide nalidixique.
Action sur la transcription de l’ADN : novobiocine, rifamycine.
Action sur la traduction de l’ARN messager : action sur la sous-unité ribosomale 30 S (streptomicine, aminosides), action au niveau de la sousunité ribosomale 50 S (tétracyclines, chloramphénicol, macrolides).
Action sur le métabolisme intermédiaire (bêtalactamines, sulfamides, triméthoprime, isoniazide).
Spectre d’action : L’idéal serait d’obtenir un antibiotique capable de détruire toutes les espèces microbiennes pathogènes. Mais l’action varie suivant une répartition limitant ainsi le spectre d’activité qui peut être plus ou moins large. Suivant la possibilité d’action d’une substance antibactérienne sur un échantillonnage de germes, elle est à large spectre ou à spectre étroit voire à action ponctuelle très spécifique. Cette notion de spectre rend compte de la sensibilité ou de la résistance naturelle des différentes espèces microbiennes.
Modalité d’action : interviennent alors les notions de bactériostase et de bactéricide. Comme exemples de bactériostatiques nous avons les macrolides, tétracyclines, chloramphénicol, sulfamides, oxyquinoléines et comme bactéricides les bêtalactamines, aminosides, acide nalidixique, nitrofurannes (Nevot et coll., 1979).
Méthodes d’étude de l’activité antibactérienne
Méthode par dilution
En milieu solide, différentes concentrations d’antibiotiques sont incorporées dans une série de boîtes qui contiennent un milieu nutritif solide. La suspension de germes à étudier est ensemencée à la surface, soit en strie avec une anse calibrée, soit en point avec des tiges calibrées. Incuber 12 à 18 heures à 37° C. Observer ensuite l’inhibition de la croissance bactérienne.
Elle peut se réaliser également en milieu liquide en ensemençant les germes dans des tubes de bouillon nutritif qui contiennent des concentrations croissantes d’antibiotique.
A partir de cette méthode il est possible de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI), la concentration minimale bactéricide (CMB).
La CMI correspond selon Chabbert (1972), à « la première concentration qui inhibe la croissance visible ».
La CMB est la plus faible concentration d’antibiotique qui laisse 0,01% de survivants au maximum. Celle-ci est habituellement appréciée après un temps de contact avec l’antibiotique de 6 à 18 heures.
Méthode par diffusion
La diffusion d’un antibiotique dans un milieu gélosé à partir d’une source ponctuelle de charge définie (cupule, cylindre, disque) est un phénomène variable dans le temps. Elle se manifeste par un gradient de concentration décroissant de la source vers la périphérie. Ce gradient dépend aussi de la charge en antibiotique de la source.
Si l’on ensemence à la surface d’un milieu stérile un nombre donné de bactéries puis que l’on dépose la source d’antibiotique, après un certain temps de culture, l’aire circulaire qui entoure le disque et qui ne montre aucune culture visible permet de mesurer le diamètre d’inhibition qui indique le degré de sensibilité de la bactérie.
L’antibiogramme
Elle n’est qu’une application de la détermination de la CMI par une méthode de diffusion. Elle permet la détermination de la sensibilité d’une bactérie (Paul et coll., 1979).
METHODOLOGIE
Choix des plantes
La revue bibliographique et les résultats de l’enquête ethnobotanique réalisée à Kolokani du19 au 22 février 2005 par une équipe du Département de Médecine Traditionnelle ont constitué la base du choix de nos plantes.
Etudes phytochimiques
Matériel végétal
Il est constitué par les écorces de tronc de Ostryoderris stuhlmannii et les racines de Trichilia emetica, Nauclea latifolia, Pseudocedrela kotschyi, Cassia sieberiana qui sont les quatre plantes entrant dans la recette. La collecte des écorces de tronc de Ostryoderris stuhlmannii a été faite à Blendio dans la préfecture de Sikasso le 31 Décembre 2004. Ces écorces avant séchage à la température ambiante ont subi un broyage à frais dans un mortier traditionnel.
Les racines de Trichilia emetica ont été achetées avec Madame Fanta à Sénou et celles des trois autres plantes avec Monsieur Sidi Diarra à l’herboristerie du marché de Médine.
Les écorces ont été pulvérisées au broyeur de type Resch SM 2000 OSI/1430 μpm.
Les racines ont subi un concassage avant d’être réduites en poudre avec le broyeur de type F1 n°3139 FORPLEX.
Les specimen de ces échantillons sont déposés au Département de Médecine Traditionnelle sous les numéros 0971, 1117, 1084, 0063, 0561 respectivement pour Cassia sieberiana, Nauclea latifolia, Ostryoderris stuhlmannii, Pseudocedrela kotschyi et Trichilia emetica.
Les alcaloïdes
Solution à analyser
Elle est constituée par un macéré de 24 heures de 10g de poudre et 50ml d’acide sulfurique dilué à 10%, filtré sur papier et complété à 50ml avec de l’eau distillée.
Caractérisation
Nous avons introduit 1ml de filtrat dans deux tubes à essai chacun. Dans le tube n°1 nous avons ajouté 5 gouttes de réactif de Mayer (solution aqueuse de mercuri-ioduro de potassium) et 5 gouttes de réactif de Dragendorff (solution aqueuse d’iodobismuthite de potassium) dans le tube n°2. L’observation d’un trouble (formation de précipités) indique la présence d’alcaloïdes.
Extraction
Pour cela nous avons introduit 25ml du filtrat dans une ampoule à décanter puis nous avons ajouté à cela 25ml de NH4OH et 25ml de CHCl3. Ce mélange a été agité sans former d’émulsion puis après décantation la phase organique a été soutirée. Nous avons répété cette opération 3 fois, réuni les phases organiques. Cette solution a été séchée sur sulfate de sodium anhydre, filtrée et recueillie dans un ballon préalablement taré (T). Ensuite elle a été concentrée à sec au rotavapor et le ballon a été pesé avec le résidu, ce qui donne m.
Extraction par les solvants à polarité croissante
Elle a été réalisée sur les écorces de tronc de Ostryoderris stuhlmannii et les racines de Pseudocedrela kotschyi.
Pour les écorces de tronc de Ostryoderris stuhlmannii nous avons utilisé 10g de poudre. Le premier solvant utilisé a été le dichlorométhane (200ml). Pour cela nous avons introduit la prise d’essai dans une cartouche que nous avons placée dans le soxhlet. A cela nous avons ajouté les 200ml du solvant. Le soxhlet a été monté sur un ballon puis le réfrigérant sur le soxhlet. L’extraction au soxhlet est basée sur le siphonnage dont le principe est la suivante : le ballon chauffé les vapeurs du solvant montent dans le réfrigérant puis les gouttelettes tombent dans le soxhlet, quand le niveau du solvant arrive au niveau du siphon le solvant retombe dans le ballon.
Après plusieurs siphonnages qui ont abouti à la décoloration du solvant nous l’avons remplacé par un autre. C’est ainsi que notre deuxième solvant utilisé a été le méthanol suivi de l’éthanol après lequel nous avons recueilli le marc. Le marc après séchage a subi une digestion pendant une heure puis une décoction pendant deux heures avec 200ml d’eau distillée pour chaque opération. Pour les racines de Pseudocedrela kotschyi les solvants utilisés pour le soxhlet ont été l’éther de pétrole (100ml), le dichlorométhane (100ml) et le méthanol (150ml). La prise d’essai a été de 20g.
Tous les extraits ont été concentrés au rotavapor sauf le macéré de la recette. Les extraits polaires ont été lyophilisés et ceux apolaires ont été évaporés à sec sous la hotte. Ensuite ils ont tous été gardés dans des flacons propres et hermétiquement fermés.
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Table des matières
DEDICACES ET REMERCIEMENTS
INTRODUCTION
TRAVAUX ANTERIEURS
1 Généralités sur la dysménorrhée
2 Rappels sur les plantes
2-1 Cassia sieberiana DC
2-2 Nauclea latifolia Sm
2-3 Ostryoderris stuhlmannii (Taub) Mendonça et Sousa
2-4 Pseudocedrela kotscyi (Schzeimf.) Harms
2-5 Trichilia emetica (spp suberosa) J.J. de Wilde.
3 Rappels sur les activités biologiques
3-1 Activité antioxydante
3-2 Activité antalgique
3-3 Activité anti-inflammatoire
3-3 Activité antibactérienne
TRAVAUX PERSONNELS
Méthodologie
1 Choix des plantes
2 Etudes phytochimiques
2-1 Matériel végétal
2-2 Caractères des drogues
2-3 Réactions de caractérisation
2-4 Dosages
2-5 Extractions
2-6 Chromatographie sur couche mince
2-7 Chromatographie en phase gazeuse
2-8 Ionogramme
3 Détermination des activités biologiques
3-1 In vitro
3-1-1 Détermination de l’activité antioxydante
3- 1-2 Détermination de l’activité antibactérienne
3-2 In vivo
3-2-1 Détermination de la toxicité
3-2-2 Détermination de l’activité anti-inflammatoire
3-2-3 Détermination de l’activité antalgique
Résultats
1 Phytochimie
2 Détermination des activités biologiques
COMMENTAIRES ET DISCUSSION
CONCLUSION
RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIGRAPHIQUES
ANNEXES
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