PHARMACOLOGIE ET PHARMACOCINETIQUE DU MILNACIPRAN 

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Comparaison des travaux de Murata et de Nishizawa

La comparaison directe des travaux de Murata et de Nishizawa est rendue difficile car les deux équipes ont réalisé leurs analyses RMN dans des solvants deutérés différents. Murata a décrit tous ses composés dans le méthanol-d4 alors que Nishizawa a décrit les siens dans la pyridine–d5.
En revanche, les deux M-B décrits possèdent des propriétés physico-chimiques proches ce qui peut laisser penser qu’ils correspondent à un seul et même produit. Ils ont tous les deux été obtenus par recristallisation dans le méthanol et possèdent des points de fusion (198-200 °C / 196-198 °C) et pouvoir rotatoires (-17,5 / -14) proches.

Autres macrocarpals décrits dans la littérature

D’autres macrocarpals ont ensuite été décrits dans la littérature par différentes équipes japonaises. Ainsi, le macrocarpal-am-1 a été isolé de l’E. amplifolia alors que les macrocarpals H, I et J ont été isolés de E. globulus.12,13 Nos travaux ne se rapportant pas directement à ces molécules, nous ne détaillerons pas ces composés.

Objectifs des travaux de thèse

Ce projet a été conduit dans le cadre de la collaboration avec les Laboratoires Pierre Fabre et vise à développer une voie d’accès semi-synthétique au macrocarpal G. Ce dernier possède en effet des propriétés biologiques propres dont une activité anti-appétante marquée. Cette activité avait été mise en évidence en observant le comportement des koalas qui sont de gros consommateurs de feuilles d’eucalyptus. Il a été démontré qu’en fonction du plant consommé, les koalas mangeaient plus ou moins de feuilles. Plusieurs hypothèses, notamment sur la quantité d’eau, d’azote ou de monoterpènes présents dans les feuilles avaient été étudiées. Cependant, aucune de ces hypothèses ne permettaient d’expliquer les variations observées d’un arbre à un autre.14 Jusqu’en 1998, les chercheurs étaient convaincus qu’il y avait une relation entre la composition chimique des feuilles d’Eucalyptus et la quantité que pouvaient en manger les koalas, mais le (ou les) composé responsable n’était pas encore identifié. Pour tenter de répondre à cette énigme, Pass a comparé les quantités de feuilles de E.ovata et de E. viminalis mangées par deux espèces de marsupiaux australiens, le koala et l’opossum à queue en anneau (Common Ringtail Possum).15 Il a ensuite comparé les teneurs en M-G et les quantités de feuilles consommées.
Il a remarqué qu’à partir d’une concentration de 7,3×10-6 mol/g de feuilles en M-G, les koalas commençaient à en manger moins et une chute de la consommation d’environ 70 % était observée pour une dose de 4,5×10-5 mol/g. Ils ont donc identifié le M-G comme étant le composé principal qui engendre l’effet coupe faim sur les marsupiaux.
Le M-G présente également des activités intéressantes comme inhibiteur de la recapture des neurotransmetteurs dopamine, sérotonine et noradrénaline. Il présente une affinité plus importante pour les récepteurs de la dopamine que pour les autres neurotransmetteurs.16
Cependant, le M-G est difficilement isolable pur des feuilles d’eucalyptus et n’a jamais été cristallisé. Une solution pour accéder à M-G en quantité importante serait d’en réaliser son hémi-synthèse au départ d’un composé parent qui serait accessible en grandes quantités. Or, les macrocarpals A et B peuvent être plus aisément isolés des feuilles d’eucalyptus.11 Ces macrocarpals différent du macrocarpal cible (G) par la présence en position 7 d’un groupement hydroxyle. Si nous étions capables d’opérer une déshydratation sélective exo-cyclique de ce groupement, nous serions en mesure d’accéder au M-G. Nous avons émis l’hypothèse de travail que le M-G et le M-B partageaient des centres stéréogènes communs même si la littérature reste ambigüe à ce propos. En effet, seule une structure plane a été proposée pour M-G. Nous avons donc, dans un premier temps, travaillé au développement de conditions de déshydratation sélectives du M-B pour accéder au M-G (appelé M-Gi tant que sa structure n’est pas confirmée) (Schéma 2).

Étude de la déshydratation du macrocarpal B

Premiers essais de déshydratation du macrocarpal B

Nous avons testé plusieurs conditions classiques de déshydratation telles que des catalyses acides plus ou moins fortes ou des activations d’alcools suivies d’éliminations. Cette réaction peut potentiellement mener à trois régiosisomères : le M-Gi (double liaison exo-cyclique) et deux produits endo-cycliques (I.1 et I.2) (Schéma 3).
Quand les conditions acides ont été utilisées (entrées 1 à 6), l’unique produit obtenu à chaque fois a été un produit de déshydratation endo-cyclique facilement identifiable grâce à l’apparition d’un signal correspondant au méthyle vinylique en RMN 1H à 1,5 ppm. L’acide faible PPTS et la Montmorillonite K10 (une argile aux propriétés acides) ne sont pas des acides suffisamment forts pour réaliser cette réaction (entrées 1 et 2). L’APTS qui est un acide plus fort permet de déshydrater le M-B mais seulement en chauffant à 40 °C (entrée 3). Finalement, seuls les acides forts H3PO4 et H2SO4 ont été capables de réaliser une déshydratation propre et complète. Cependant, l’unique produit obtenu de ces réactions contient une double liaison endo-cyclique. L’ensemble de ces résultats montre que toute catalyse acide, qu’elle soit forte ou non mène à un seul des deux régiosisomère endo (I.1 ; le produit I.2 n’a jamais été observé). Cette structure a été confirmée par des analyses RMN complémentaires (COSY, HMBC et HSQC).
Deux principaux mécanismes peuvent être envisagés pour l’élimination d’un alcool tertiaire : E1 et E2. Le mécanisme E1 étant la plupart du temps catalysé par un acide passe par un intermédiaire carbocationique. Le produit ainsi formé suit la règle de Zaïtsev et l’alcène le plus substitué est alors obtenu (I.1). Cependant, notre objectif est de déshydrater le M-B en M-G dont la double liaison est exo-cyclique et la moins substituée.
Dans le cas des macrocarpals, il y a une contrainte assez forte au niveau du cycle à sept chainons qui prend probablement une forme de chaise dans sa conformation la plus stable (Figure 6, A). En effet, la conformation B (Figure 6) est défavorisée car il y a une gène stérique entre un des méthyles porté par le cyclopropane et les positions 6 et 15.
Dans cette conformation A, l’alcool se trouve en position équatoriale et donc aucune élimination E2 intra-cyclique ne peut se faire puisqu’il n’y a pas d’atome d’hydrogène en anti. La seule possibilité d’élimination est donc exo-cyclique en impliquant un des protons porté par le méthyle 15.
Figure 6 : Conformation possible du cycle à sept chainons du M-B.
Les conditions de réaction précédemment utilisées (acides, mécanisme E1) menaient au produit endo-cyclique I.1 uniquement. Nous avons alors testé d’autres conditions de déshydratation non acide (Tableau 3) afin de voir s’il était possible d’isoler le produit d’élimination exo-cyclique (M-Gi). Nous avons essayé d’activer cet alcool sous forme de sel de phosphonium avant élimination en traitant le M-B dans des conditions de Mitsunobu. Cependant, aucune déshydratation n’a été observée (entrée 1).
Nous avons ensuite essayé d’activer le groupement hydroxyle sous forme de mésylate tout en favorisant son élimination in situ en présence de pyridine. Malgré l’utilisation d’un excès de chlorure
de mésyle, seule la mésylation d’un des trois phénols a été observée (entrée 2).
Nous sommes alors revenus à des méthodes plus classiques de déshydratation telles que POCl3/pyridine ou SOCl2/pyridine. Dans le premier cas, nous avons observé la formation du produit désiré, ainsi que beaucoup de produits de dégradation (entrée 3). L’utilisation du chlorure de thionyle en présence de pyridine et à différentes températures (entrées 4 à 8) conduit à une réaction bien plus propre puisqu’une conversion totale est observée à partir de – 15 °C. Cependant, même si le rapport endo/exo augmente avec la température de réaction, nous n’avons pas été en mesure de dépasser 50% de sélectivité (ratio de 1/1). La séparation des deux isomères ne pouvant se faire que par HPLC préparative, une chute du rendement isolé est observée. Nous avions besoin d’une réaction qui soit plus sélective de la déshydratation exo-cyclique.
Finalement, nous avons testé l’anhydride cyclique de l’acide n-butylphosphonique (T3P®) qui est un réactif développé récemment (Figure 7). Ce réactif est principalement utilisé comme agent de couplage pour la formation d’amides ou d’esters. Simple d’utilisation, il n’induit qu’une très faible épimérisation quand il est utilisé pour réaliser des couplages peptidiques. Son sous-produit de réaction (l’acide n-butylphosphonique) est très soluble dans l’eau. Il est donc facilement éliminé du milieu réactionnel. 17 , 18 Nous l’avons utilisé ici comme agent de déshydratation. Les premiers essais de déshydratation du macrocarpal B par T3P ont été réalisés à 20 °C. Cependant, à cette température, aucune conversion n’est observée. Cependant quand T3P est utilisé dans le THF à reflux, le produit de deshydratation exo (M-Gi) est obtenu majoritairement après 10 h (entré 9). Nous avons remarqué que si la réaction était arrêtée après seulement 4 h, le produit exo pouvait être isolé avec une bonne sélectivité de 10 pour 1 mais avec des rendements de conversion faibles (entrée 10).
Figure 7 : Structure de l’anhydride cyclique de l’acide n-butylphosphonique (T3P).
Afin de s’assurer que le produit formé correspondait bien au macrocarpal G, nous l’avons comparé avec un échantillon authentique fourni par les Laboratoires Pierre Fabre. Ces réactions ayant été suivies par LC-MS, nous avons remarqué que le produit synthétisé et le M-G avait le même temps de rétention (un seul pic en co-injection) et une distribution de masse identique. Nous avions donc bien obtenu un produit de déshydratation. Cependant, lorsque nous avons analysé par RMN du proton le produit synthétisé et comparé son spectre à l’échantillon authentique, nous avons d’une part observé la présence caractéristique du méthylène exo-cyclique à 4,8 ppm (indicatif d’une déshydratation exo-cyclique) mais d’autre part une dissimilitude assez forte au niveau des autres signaux (Figure 8).
À ce moment du projet, nous étions convaincus que nous avions réussi à réaliser une déshydratation exo-cyclique du M-B. Cependant le produit obtenu était structurellement différent du M-G de référence.
Dans la littérature, seule une structure plane du M-G avait été proposée.9 Sa structure absolue n’ayant jamais été déterminée, nous avons émis l’hypothèse que le produit obtenu (M-Gi) par déshydratation devait être un isomère du M-G.

Les macrocarpals C et G seraient ils en fait une seule et même molécule ?

En 1997, Iwata et son équipe ont décrit la première synthèse totale et stéréocontrôlée du M-C.19, 20 La structure absolue du M-C avait déjà été validée par voie chimique.11
La synthèse totale a été réalisée en utilisant une étape clef de couplage entre un éther d’énol silylé et un complexe chiral benzène hexasubstitué / chrome rendant la synthèse énantiosélective (Schéma 4).
À la fin de leur synthèse, les auteurs comparent le produit qu’ils ont obtenu à un échantillon naturel de M-C. Ces deux produits présentent les mêmes données spectrales mais un pouvoir rotatoire différent [α]25D -22,1 pour l’échantillon synthétisé contre [α]25D -3,0 pour le produit isolé de E. globulus.11 Cette faible valeur du produit isolé a été attribuée à la présence probable d’impuretés qui ont faussé la mesure du pouvoir rotatoire.
Ils ont ensuite réalisé une analyse RMN (proton et carbone 13) de cet échantillon dans le méthanol-d4 afin de le comparer avec les données du M-G rapportées par l’équipe de Murata.9 En effet, jusque là toute comparaison entre le M-C et le M-G avait été impossible car les RMN avaient été rapportées dans deux solvants deutérés différents (respectivement pyridine et méthanol).
En comparant les données spectrales ils se sont aperçus que le M-G et leur échantillon synthétique étaient identiques.

Table des matières

I MACROCARPALS 
I.1 MACROCARPALS : DECOUVERTES ET ACTIVITES BIOLOGIQUES
I.1.1 DECOUVERTE DU MACROCARPAL A
I.1.2 DECOUVERTE DES MACROCARPALS B A G
I.1.3 AUTRES MACROCARPALS DECRITS DANS LA LITTERATURE
I.2 OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE
I.3 ÉTUDE DE LA DESHYDRATATION DU MACROCARPAL B
I.3.1 PREMIERS ESSAIS DE DESHYDRATATION DU MACROCARPAL B
I.3.2 LES MACROCARPALS C ET G SERAIENT ILS EN FAIT UNE SEULE ET MEME MOLECULE?
I.3.3 REVISION DES HYPOTHESES
I.4 SYNTHESE DU MACROCARPAL G ET DE SES ANALOGUES
I.4.1 OPTIMISATION DE LA DESHYDRATATION EXO-CYCLIQUE DU M-A EN M-G
I.4.2 SYNTHESE DE NOUVEAUX MACROCARPALS
I.5 CONCLUSION
II LEVOMILNACIPRAN 
II.1 LE MILNACIPRAN
II.1.1 SYNTHESE RACEMIQUE
II.1.2 PHARMACOLOGIE ET PHARMACOCINETIQUE DU MILNACIPRAN
II.1.3 CONCLUSION
II.2 LE LEVOMILNACIPRAN
II.2.1 INTERETS DU LEVOMILNACIPRAN PAR RAPPORT A SA FORME RACEMIQUE
II.2.2 SYNTHESES ENANTIOSELECTIVES DU LEVOMILNACIPRAN
II.2.3 SYNTHESES ENANTIOSELECTIVES DU (1S,2R)-MILNACIPRAN
II.3 OBJECTIF DES TRAVAUX DE THESE
II.4 SYNTHESE ENANTIOSELECTIVE DU LEVOMILNACIPRAN
II.4.1 ACCES A LA (-)-LACTONE II.1’
II.4.2 DE LA (˗)-LACTONE II.1’ AU LEVOMILNACIPRAN
II.5 CONCLUSION
III SYNTHESE ENANTIOSELECTIVE DE 1,4-BENZODIOXANES 
III.1 INTRODUCTION
III.1.1 LE MOTIF 1,4-BENZODIOXANE EN CHIMIE MEDICINALE
III.1.2 METHODES DE SYNTHESES
III.2 OBJECTIF DES TRAVAUX DE THESE
III.3 SYNTHESE ENANTIOSELECTIVE DE F17807
III.3.1 SYNTHESE DE L’AMINE III.5
III.3.2 APPROCHE SYNTHETIQUE SELON LA VOIE A
III.3.3 APPROCHE SYNTHETIQUE SELON LA VOIE A’
III.3.4 SYNTHESE DU 1,4-BENZODIOXANE, VOIE B
III.4 CONCLUSION
IV SYNTHESE D’ANALOGUES DE PODOPHYLLOTOXINES 
IV.1 HISTOIRE DES PODOPHYLLOTOXINES
IV.1.1 NOMENCLATURE ET NUMEROTATION
IV.1.2 DE LA PODOPHYLLOTOXINE A L’ETOPOSIDE
IV.1.3 LES TOPOISOMERASES
IV.2 F14512, DECOUVERTE ET MODE D’ACTION
IV.2.1 POLYAMINES, SYSTEME DE TRANSPORT DES POLYAMINES ET CANCER
IV.2.2 F14512 : UN NOUVEL AGENT ANTICANCEREUX SELECTIF
IV.2.3 MODE D’ACTION
IV.3 OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE
IV.4 SYNTHESE DE L’ANALOGUE IV.2
IV.5 SYNTHESE DE L’ANALOGUE IV.3
IV.5.1 INTRODUCTION DE L’AZOTE EN Α SUR LE CARBONE C4
IV.5.2 FIN DE LA SYNTHESE DE L’ANALOGUE IV.3
IV.6 SYNTHESE DE L’ANALOGUE IV.4
IV.6.1 APPROCHE UNE : AU DEPART D’UN INTERMEDIAIRE DE LA SYNTHESE DE IV.3
IV.6.2 APPROCHE DEUX : AU DEPART D’UN INTERMEDIAIRE DE LA SYNTHESE DE IV.2
IV.7 CONCLUSION
V FORMULATIONS NANOMÉTRIQUES DE PODOPHYLLOTOXINES 
V.1 CIBLAGE PASSIF OU ACTIF
V.1.1 CIBLAGE PASSIF
V.1.2 CIBLAGE ACTIF
V.1.3 NANOMEDICAMENTS DE TROISIEME GENERATION
V.2 NANOMEDICAMENTS
V.2.1 INTERETS DES NANOVECTEURS
V.2.2 LES DIFFERENTES FORMES DE NANOVECTEURS
V.3 MICELLES
V.3.1 CONCENTRATION MICELLAIRE CRITIQUE
V.3.2 NANOMEDICAMENTS MICELLAIRES
V.4 OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE
V.5 SYNTHESE ET CARACTERISATION DE L’AMPHIPHILE C18-PODO-SPER
V.5.1 SYNTHESE ENVISAGEE : VIA UNE REACTION DE MITSUNOBU
V.5.2 CARACTERISATION
V.6 SYNTHESE ET CARACTERISATION D’AMPHIPHILES PLUS COMPLEXES
V.6.1 SYNTHESE ET CARACTERISATION DE L’AMPHIPHILE DA-PODO-SPER
V.6.2 SYNTHESE ET CARACTERISATION DE L’AMPHIPHILE PHOTOSENSIBLE C18-NBZ PODO-SPER
V.6.3 SYNTHESE ET CARACTERISATION DE L’AMPHIPHILE C18-PODO-PEG400
V.6.4 CONCLUSION : SYNTHESE ET CARACTERISATION DES AMPHIPHILES
V.7 PREMIERS RESULTATS BIOLOGIQUES
V.7.1 CIBLAGE CELLULAIRE
V.7.2 CIBLAGE TISSULAIRE
V.8 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
CONCLUSION GÉNÉRALE
PARTIE EXPÉRIMENTALE 
I GENERAL 
II ORGANIC SYNTHESIS 
II.A CHAPTER I : MACROCARPALS
II.B CHAPTER II : LEVOMILNACIPRAN
II.C CHAPTER III : ENANTIOSELECTIVE SYNTHESIS OF 1,4-BENZODIOXANES
II.D CHAPTER IV : SYNTHESIS OF PODOPHYLLOTOXINES ANALOGUES
II.E CHAPTER V : NANOMETRIC FORMULATIONS OF PODOPHYLLOTOXINES
III CHARACTERIZATION OF AMPHIPHILES 
III.A CRITICAL MICELLAR CONCENTRATION MEASUREMENT
III.B DYNAMIC LIGHT SCATERING
IV BIOLOGICAL TESTS 
IV.A STP VECTORIZED MICELLES
IV.B EPR VECTORIZED MICELLES
ANNEXES

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