Peroxydase d’origine végétale

Les peptides γ-glutamylcystéine

        Un bulbe contient en moyenne plus de 0,9% de γ-glutamylcystéine. Ces peptides constituent une famille de plusieurs dérivés tels que le γ-glutamyl-S- allylcystéine (GSAC), le γ-glutamyl-S-methylcystéine (GSMC) et le γ-glutamyl-S- propylcystéine (GSPC). Ces peptides sont des intermédiaires de biosynthèse pour les cystéines sulfoxides correspondants. Le γ-glutamyl-S-allyl-mercapto-L-cystéine et le S-(2-carboxypropyl) glutathion sont également présents dans le bulbe d’ail.

EFFETS ANTIOXYDANTS

       As est riche en matières actives anti oxydantes incluant les composés sulfurés, les flavonoïdes et les phénols capables de piéger les radicaux libres. Il contient également du sélénium indispensable à la glutathion peroxydase (Pédraza et al., 2005). L’allicine est capable d’inhiber la formation du H2O2 par le système xanthine /xanthine oxydase, probablement par un mécanisme d’échange des groupements thiol (Chung, 2006). As particulièrement cru, stimule la libération des enzymes anti oxydantes telles que la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT) et la glutathion peroxydase (GPX) (Numagami et Ohnishi, 2001 ; Hamlaoui et al., 2009). Cette propriété est incontestable dans la réduction des peroxydes lipidiques au niveau du cœur, du foie et des reins (Banerjee et al., 2001 et 2002), la diminution du risque des cancers induits chimiquement ou par irradiation (Borek, 1997), ainsi que dans la prévention des lésions induites par les ROS au niveau de l’ADN, des lipides et des protéines (Gutteridge, 1993). L’administration concomitante par voie cutanée pendant 4 jours du diallyl disulfure à raison de 50 mg /kg/ j avec la gentamycine à raison de 70 mg /kg/j, prévient la diminution des enzymes anti oxydantes (Pédraza et al., 2000).

LES SUPEROXYDE DISMUTASES (SOD)

        Ces enzymes transforment le radical superoxyde (O2-) en H2O2 beaucoup moins réactif (Fig. 2). Cette réaction considérée la plus rapide à ce jour, constitue le facteur déclenchant les mécanismes de la défense naturelle (Vouldoukis, 2004). La SOD a besoin d’oligoéléments comme le zinc, le cuivre ou le manganèse pour fonctionner correctement. D’après (Mruk et al., 2002), les trois isoformes les mieux décrites chez l’homme sont :
– Cu/Zn-SOD (SOD1), est localisée dans le cytoplasme et le nucléole mais absente dans les mitochondries. Elle est constituée de deux sous-unités contenant chacune un atome de cuivre et un atome de zinc. Le Cu2+ est indispensable à l’activité catalytique de l’enzyme tandis que le Zn2+ stabilise la structure de la protéine. Elle représente 70% des SOD totales.
– Mn-SOD (SOD2) est présente dans la plupart des tissus où elle est localisée dans les mitochondries. Elle est constituée de quatre sous-unités contenant chacune un atome de manganèse nécessaire à l’activité catalytique de l’enzyme. Elle représente environ 15% de l’activité SOD totale.
– SOD3, tétramère est la seule forme extracellulaire impliquée dans la détoxification de O2-.
Elle est rencontrée dans le plasma et le milieu interstitiel. Elle présente une répartition tissulaire très particulière, puisqu’elle est localisée en grande concentration dans les testicules et le poumon. La production de H2O2 sous l’action de la SOD est le facteur déclenchant des mécanismes naturels de défense. La SOD se comporte contre les ROS de deux façons différentes. En premier lieu, l’organisme réagira lors d’un stress oxydant modéré en sur exprimant la SOD. Si le stress perdure et produit de façon massive des ROS, la concentration en SOD chutera. Paradoxalement, une hyper-concentration en SOD s’avère dangereuse puisqu’elle sera à l’origine d’une surproduction de H2O2 (Levine, 1996).

POLYMORPHISME

       Ce type d’enzymes existent sous plusieurs formes (iso peroxydases) chez une même plante et au niveau d’un même tissu. Elles diffèrent par quelques propriétés physicochimiques et catalytiques. Cette forte hétérogénéité moléculaire peut être détectée par électrophorèse en conditions natives (migration anodique et cathodique), ou plus aisément par focalisation isoélectrique (IEF) . Des études ont rapporté 42 iso peroxydases pour la HRP (Hoyle, 1977 ; Gaspar et al., 1982), 18 pour les petits pois (Lee et Klein 1988), plus de 11 pour la tomate (Quiroga et al., 2001), 4 pour le melon (Rodriguez-López et al., 2000) et 73 gènes chez Arabidopsis, dont plus de 55 sont effectivement exprimés chez les plantes (Tognolli et al., 2002). Chez les plantes supérieures, 8 à 15 familles ont été génétiquement déterminées dont  quelques unes, avaient 2 à 3 gènes hautement similaires. Selon le pHi, on distingue les isoformes acides (pHi ≤ 7) qui sont séparées en milieu basique (électrophorèse anodique) et les isoenzymes modérément basiques (7< pHi < 9) ou fortement basiques (pHi > 9) qui sont séparées en milieu acide (électrophorèse cathodique).

Site actif et acides aminés impliqués dans la catalyse

        L’étude cristallographique menée par Henriksen et ses coauteurs (1998), sur les interactions entre la Prx et le substrat, a montré la position de ce dernier dans une écrevisse (site actif). Il (substrat) est orienté vers une portion de l’hème, ses parties apolaires sont dirigées vers la face hydrophobe (Phe 179, Pro 141, Ala 140, Pro 139,  Phe 68, Gly 69) et ses tranches polaires sont orientées vers His 42 et Arg 38, à proximité du fer. Le remplacement de certains acides aminés par mutagenèse dirigée (préparation d’un gène synthétique modifié puis exprimé dans E. Coli), complété par des études cristallographiques et/ou cinétiques, fournit des renseignements sur le rôle des différents acides aminés. Le remplacement de His 42 diminue toujours l’affinité de l’enzyme pour H2O2 et ralentit la réaction ; celui de Arg 38 (polaire) par Leu (apolaire) diminue également l’affinité de l’enzyme pour H2O2 et surtout pour le deuxième substrat. Ces deux acides aminés semblent directement impliqués dans la formation des complexes avec les deux substrats, et dans la réaction proprement dite. Le cas de Asn 70 est plus intéressant, son remplacement par Val entraîne une baisse de la vitesse maximale de plus de 90%. Nagano et ses coauteurs (1996), expliquent cela par l’existence éventuelle d’une liaison hydrogène entre Asn 70 et His 42 qui ne peut s’établir entre Val 70 et His 42. Cette perte diminuerait la réactivité de His 42 et changerait sa position dans l’espace.

Table des matières

INTRODUCTION
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. L’AIL (Allium sativum)
1. Présentation
2. Classification et diversité
3. Historique : vertus thérapeutiques
4. Les constituants chimiques
4.1 Les produits naturels
4.2 Les produits de transformation
4.3 Les saponines
5. Effets médicinaux des principes actifs
5.1 Effets antioxydants
5.2 Effets anti-infectieux
5.3 Protection cardiovasculaire
5.4 Prévention du cancer
5.5 Autres effets désirables
5.6 Effets indésirables chez l’homme
II. LES ANTIOXYDANTS NATURELS
1. Les antioxydants enzymatiques
1.1 Les glutathion peroxydases
1.2 Les superoxydes dismutases
1.3 La catalase
1.4 Les thiorédoxines
1.5 Les peroxyrédoxines
1.6 La hème oxydase
2. Les antioxydants non enzymatiques
2.1 Les composés phénoliques
2.1.1 Généralités
2.1.1 Classification
III. LES METALLOPROTEINES
1. Généralités
2. Les protéines à fer
a) Protéines héminiques
b) Protéines non héminiques
c) Protéines de transport ou de stockage du fer
3. Structure des hémoprotéines
3.1 Les coenzymes hématiniques
IV. LES PEROXYDASES
1. Nomenclature (EC)
2. Historique
3. Définition
4. Sources et classification
5. Peroxydases des plantes
5.1 Polymorphisme
5.2 Spécificité de substrat
5.3 Aspects physiologiques
5.4 Localisation tissulaire et subcellulaire
5.5 Structure et site actif
5.5.1 Structure
5.5.2 Site actif et acides aminés impliqués dans la catalyse
5.6 Mécanismes d’action
5.6.1 En présence de substrat réducteur
5.6.2 En absence de substrat réducteur
6. La lignine
6.1 Généralités
6.2 Biosynthèse
6.3 Dégradation peroxydasique
7. Interactions des peroxydases avec O2
8. Brunissement enzymatique
9. Les haloperoxydases : aspects physiologiques
10. Domaines d’utilisation des peroxydases
V. BIOCAPTEURS A PEROXYDASES
1. Applications
1.1 Domaine biologique
1.2 Domaine agro alimentaire
1.3 Domaine environnementale
OBJECTIFS DU TRAVAIL
MATÉRIEL ET MÉTHODES
A. MATERIEL
1. Matériel biologique
2. Enzymes et substrats
3. Solutions stocks des substrats
4. Supports d’immobilisation et gels
5. Autre matériel
B. METHODES
I. PREMIERE ETUDE
1. Dosage de l’activité peroxydase
2. Dosage des protéines
a) Avec le gaïacol
b) Avec l’o-dianisidine
3. Purification enzymatique
3.1 Extraction des protéines
3.2 Concentration des protéines
a) Concentration par ultrafiltration
b) Concentration par sulfate d’ammonium
3.3 Chromatographie par filtration sur gel
3.4 Chromatographie par échange de cations
4. Techniques d’électrophorése
4.1 PAGE en conditions natives
4.1.1 PAGE cathodique
4.1.2 PAGE anodique
4.1.3 Révélation de l’activité peroxydase sur gel
4.2 PAGE en conditions dénaturantes
4.2.1 SDS-PAGE
4.2.2 Électrophorèse de focalisation
4.2.3 Révélation des protéines sur gel
5. Caractérisation biochimique de POX2
5.1 Optimisation des paramètres de dosage
5.2 Etude de la stabilité
a) Effet du pH
b) Effet de la température
c) Effet du stockage
d) Effet des solvants et éléments cationiques
5.3 Etude cinétique
6. Immobilisation par liaison covalente
6.1 Stabilité de l’enzyme immobilisée
a) Stabilité à la température
b) Stabilité au stockage
7. Application dans la détection de H2O2
II. DEUXIEME ETUDE
1. Purification enzymatique
1.1 Préparation de l’extrait brut
a) Extraction de la fraction soluble
b) Extraction de la fraction liée
1.2 Concentration des protéines
1.3 Dialyse
1.4 Clarification : extraction des lipides
1.5 Chromatographie par échange de cations
2. Techniques d’électrophorése
2.1 PAGE en conditions natives
2.1.1 PAGE cathodique
2.1.2 IEF cathodique
2.2 PAGE en conditions dénaturantes : SDS-PAGE
3. Détermination du pH d’activité
4. Dosage de l’activité peroxydase
a) Avec le 4MN
b) Avec le p-AC, la quercétine /quercitrine
5. Oxydation des composés phénoliques de l’ail
5.1 Etude spéctrale
5.2 Etude cinétique
RESULTATS ET DISCUSSIONS
PREMIERE ETUDE
CHAP I. PURIFICATION ET CARACTERISATION DE POX2
1. Profil des iso-peroxydases du bulbe d’ail
2. Purification de la peroxydase POX2
3. Caractèrisation biochimique
3.1 Poids moléculaire
3.2 pH isoélectrique
3.3 pH et température d’activité
3.4 Constantes cinétiques (Kmgaϊacol et KmH2O2)
CHAP II. STABILITE, IMMOBILISATION ET APPLICATION DE POX2
1. Etude de la stabilité
1.1 Effet de la température
1.2 Effet du pH
1.3 Effet des inhibiteurs
2. Immobilisation
2.1 Stabilité et cycles de réutilisation
3. Application de l’enzyme dans la détection de H2O2
DEUXIEME ETUDE
CHAP III. PURIFICATION ET CARACTERISATION DE Prx 91
1. profil iso-peroxidasique de l’extrait du bulbe
2. Purification d’une activité peroxidase
3. Techniques d’électrophorése
3.1 IEF
3.2 SDS-PAGE
3.3 PAGE native cathodique
CHAP IV. OXYDATION DES SUBSTRATS PHYSIOLOGIQUES
1. Oxydation des flavonols aglycones et leurs glycosides
2. Oxydation des structures p-hydroxycinnamiques
3. Oxydation des structures sinnapyliques
4. Caractérisation cinétique
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE

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