Peptides et protéines de venins à applications thérapeutiques

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Alternatives aux anticorps : les plates-formes génériques

Les limitations des anticorps et des fragments d’anticorps ont grandement stimulé la recherche d’approches alternatives. Une première catégorie de méthodes aujourd’hui bien explorées est fondée sur le transfert d’un site de liaison universel comme celui rencontré dans les anticorps sur une architecture protéique alternative, désignée par le terme de plate-forme.
Ce terme a acquis une signification unique dans le contexte de l’ingénierie des protéines. Il décrit un squelette polypeptidique possédant une grande tolérance aux modifications telles que les insertions, délétions ou substitutions multiples. La plate-forme acquiert certaines nouvelles propriétés tandis que son intégrité structurale globale et son comportement physicochimique originel restent conservés. Cette propriété adoptée de novo comprend généralement mais non exclusivement la spécificité de liaison pour une molécule cible prédéfinie. Les dix dernières années ont vu la découverte, le développement et l’utilisation de plusieurs de ces plates-formes.
Ces plates-formes protéiques alternatives, non apparentées aux anticorps, forment un groupe très hétérogène de molécules ayant des origines, des tailles, des propriétés et des structures très différentes.

VLRs

Les récepteurs variables de lymphocytes (VLRs) sont d’un intérêt particulier du fait de leur utilisation par les lamproies (vertébrés sans mâchoires) à la place des IgG dans la réponse immunitaire adaptative (Caravella et Lugovskoy, 2010). Les VLRs représentent le seul système immunitaire adaptatif connu qui ne soit pas basé sur les immunoglobulines, cependant, leurs propriétés de liaison aux antigènes restent très peu connues.

Darpins

Les DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins) sont une autre classe de protéines d’origine humaine ayant été utilisées comme molécules affines et thérapeutiques, appartenant à la classe des protéines à répétitions. Les DARPins sont de petites protéines dérivées d’ankyrines naturelles, une classe de protéines qui intervient dans les interactions protéineprotéine de haute  affinité. Les répétitions d’ankyrine sont constituées de plusieurs unités répétitives en tandem, de 33 acides aminés chacune.

L’ingénierie in silico de protéines fondée sur la structure

Les méthodes décrites précédemment possèdent de nombreux atouts et ont déjà démontré leur important potentiel dans la découverte de ligands protéiques. Cependant ces méthodes ne permettent pas d’offrir un contrôle précis sur la position où les ligands protéiques sélectionnés interagissent ni sur le mode de liaison du ligand à la cible. Ceci peut constituer un inconvénient dans le cadre du développement de molécules d’intérêt thérapeutique pour lesquelles la spécificité d’interaction est souvent requise. Au contraire, les méthodes fondées sur la reproduction d’interactions existantes dans un complexe de la cible considérée avec un ligand naturel de celle-ci pourraient permettre un contrôle sur la région où le ligand protéique artificiel interagit à la surface de la cible. Des méthodes d’ingénierie moléculaire exploitant cette idée se sont développées et ont conduit à un certain nombre de succès. Elles sont fondées sur l’exploitation des informations structurales tant pour l’identification des motifs fonctionnels que pour l’identification de structures protéiques servant de plates-formes pour reproduire des interactions importantes dans la liaison des ligands protéiques artificiels à la cible. Elles possèdent généralement un caractère mimétique puisqu’elles visent à reproduire des interactions établies par un ligand naturel de référence ou, dans certains cas, des interactions identifiées par des méthodes de simulations. Les méthodes in silico fondées sur l’exploitation des connaissances structurales des protéines ont d’abord été utilisées comme outils afin d’améliorer notre compréhension des propriétés intrinsèques des interactions protéinesPARTIE  protéines, et de leur spécificité d’interaction et la modulation des interactions naturelles entre partenaires protéiques. Par la suite, les applications de ces méthodes furent étendues à la conception de novo d’interactants protéiques souvent fondée sur le transfert de nouveaux sites de liaison sur des architectures protéiques existantes. C’est dans ce cadre que se déroulent les travaux présentés dans ce rapport.

Amélioration de la spécificité des ligands protéiques

Des travaux importants ont été réalisés via l’exploitation de structures 3D et de méthodes de modélisation moléculaire visant l’amélioration de la spécificité de ligands protéiques envers leurs protéines-cibles. Par exemple, Shifman et Mayo ont utilisé ces méthodes pour améliorer la spécificité d’un complexe de la calmoduline avec son peptide cible (Shifman et Mayo, 2002). Alors que la calmoduline native reconnait une variété de différents peptides cibles avec une affinité raisonnable, un variant de calmoduline conçu avec huit mutations montre une affinité pour un peptide cible 86 fois supérieure à l’affinité mesurée envers d’autres peptides partenaires. Les auteurs ont ainsi montré que la conception d’interfaces de protéines par méthodes informatiques a permis d’atteindre des affinités nanomolaires similaires à celles de la calmoduline native, tout en améliorant la spécificité de liaison par optimisation de l’interface de liaison pour un seul peptide cible.
La conception de la spécificité a connu une avancée supplémentaire grâce aux travaux de Reina et al. décrivant la conception de mutants du site de liaison du domaine PDZ (acronyme des premières lettres de 3 protéines à l’origine de la découverte de ce domaine : Post synaptic density protein (PSD95), Drosophila disc large tumor suppressor (Dlg1) et Zonula occludens-1 protein (zo-1)) conduisant à la liaison à de nouvelles séquences peptidiques cibles (Reina et al., 2002). Trois différents mutants de domaine PDZ contenant 6 ou 7 mutations ont été construits à l’aide de méthodes informatiques par modification des interfaces existantes afin de se lier à 3 peptides cibles : une séquence peptidique naturelle présente au niveau de l’extrémité Cterminale  ’une molécule similaire à la kinesin, une séquence peptidique chargée et une autre hydrophobe. Les 3 mutants se lient aux peptides cibles avec des affinités plus de deux fois plus importantes que celles du domaine PDZ non modifié.
Des études plus récentes sur la spécificité protéine-protéine ou protéine-peptide ont révélé PARTIE B l’intérêt de la conception négative, procédé selon lequel des propriétés indésirables sont prises en considération (Bolon et al., 2005). Cette méthode permet d’introduire les mutations qui stabilisent la structure ciblée tout en déstabilisant les structures alternatives. Cette méthode fut appliquée avec succès pour la conception de dimères en torsade d’hélices ou « coiled-coil ». Les travaux de Havranek et Harbury sont réalisés sur le facteur de transcription GCN4, une protéine contenant deux hélices  » allongées formant un homodimère par le biais d’interactions hydrophobes (Havranek et Harbury, 2003). Quatre états sont considérés pour cette structure « coiled coil » : 1) l’homodimère ; 2) l’hétérodimère ; 3) l’état non replié ; et 4) l’état agrégé.
Des mutations ont été effectuées au niveau de positions bien déterminées des hélices, permettant de favoriser la formation du dimère cible sur les autres états possibles. L’utilité de la conception négative a également été démontrée par les travaux de Joachimiak et al. sur la conception d’une nouvelle interface DNase colicin E7-protéine de l’immunité Im7 (Joachimiak et al., 2006).

Modulation des interactions protéines-protéines

Un exemple de modulation de l’interaction protéine-protéine ayant une application biologique intéressante est celui de la conception d’un variant du facteur de nécrose tumorale (TNF) qui est actuellement développé comme agent thérapeutique pour le traitement de l’arthrite rhumatoïde. La conception du variant de TNF est réalisée en introduisant des mutations à l’interface entre le TNF et son récepteur de façon à empêcher leur interaction (Steed et al., 2003). Les variants de TNF ainsi conçus forment des complexes hétérotrimériques avec le TNF natif qui sont incapables de se lier aux récepteurs de TNF.

Modification de sites de liaison protéiques

Un certain nombre de travaux de conception de nouvelles fonctions biologiques sont fondés sur l’utilisation de protéines de liaison périplasmiques (PBPs), connues pour être des plates-formes intéressantes du fait de leur capacité à se lier à une très grande variété de petites molécules, telles que les carbohydrates, les acides aminés, les neurotransmetteurs et les oligopeptides (Tam et Saier, 1993). De plus, la liaison au ligand est facilement détectée grâce au changement conformationnel se produisant lors de la liaison. Les régions de liaison de PBP sont été modifiées par méthodes de conception informatiques afin de lier des métaux, des  neurotransmetteurs, des sucres, des explosifs et des agents neurotoxiques. Par exemple, Marvinet Hellinga ont réalisé la conversion d’un récepteur au maltose (MBP) en un biosenseur capable de lier le zinc (Marvin et Hellinga, 2001). Le récepteur au maltose consiste en une chaîne polypeptidique unique qui se replie pour former deux domaines connectés par une région charnière. Les sites de liaison au maltose ont été identifiés au niveau de l’interface entre les deux domaines. Au niveau de ces sites, les résidus responsables de la liaison au maltose ont été modifiés par mutagénèse dirigée en résidus histidine, permettant ainsi au niveau de chaque site la liaison à un atome de zinc grâce à un réseau tétraédrique constitué de trois résidus histidine et d’une molécule d’eau. Dans ce nouveau biosenseur, la liaison au zinc est contrôlée par un mécanisme de couplage conformationnel associant la liaison au zinc dans la protéine à l’état replié à une émission d’un signal de fluorescence.

Transfert de motif fonctionnel sur une protéine hôte

La conception de mimes fonctionnels de petite taille des larges protéines a longtemps été un défi important. La méthode est basée sur le greffage de sites fonctionnels sur des platesformes naturelles. Une nouvelle fonction est ainsi conçue par le transfert d’un site actif sur une région structurale précise, permissive envers les mutations et structuralement compatible avec la nouvelle fonction. Cette approche nécessite donc l’étude et l’analyse des interactions dans les complexes naturels protéine-protéine ainsi que la connaissance des principes moléculaires qui les régissent, afin d’identifier les résidus qui interviennent dans la liaison et la stabilisation de ces complexes protéiques.

Identification des résidus du motif fonctionnel

Il a été postulé que dans les interfaces protéine-protéine, un nombre réduit de résidus contribuent de manière prépondérante à la variation d’énergie libre de liaison. Pour une interface typique de 1200 à 2000 Å2, moins de 5% des résidus de l’interface contribuent à la liaison avec plus de 2 kcal/mol (Ofran et Rost, 2007). L’examen de la structure 3-D détaillée de complexes protéine-protéine montre que certains résidus sont susceptibles de jouer un rôle prépondérant dans la liaison grâce aux interactions intermoléculaires mises en jeu avec le partenaire cible (liaisons hydrogène, ponts salins etc..). Cependant, l’analyse structurale seule ne permet pas de déterminer la contribution à la variation d’énergie libre de liaison de chacune des interactions intermoléculaires établies avec le partenaire cible. La mise en évidence des résidus jouant un rôle important dans la liaison peut être réalisée grâce à leur substitution expérimentale en résidus alanine (méthode désignée par le terme « alanine scanning ») et à la mesure de l’effet de ces substitutions sur l’énergie libre d’association des deux partenaires.
Plusieurs expériences ont démontré que la plupart des résidus de l’interface peuvent être mutés sans affecter l’affinité de la protéine pour ses partenaires. Les quelques résidus qui après mutation changent l’affinité sont considérés comme prédominant pour l’interaction et sont désignés par l’expression « hot spots ». Ainsi, malgré la taille importante des interfaces de liaison, quelques résidus seulement contribueraient de manière prépondérante à la variation d’énergie libre de liaison.

Les interactions protéines – protéines

La plupart des processus biologiques impliquent une reconnaissance entre des partenaires protéiques via la mise en contact de leurs surfaces. Ceci a lieu par la mise en jeu d’interactions intermoléculaires établies au niveau des interfaces ainsi formées. La connaissance des caractéristiques des interfaces protéine-protéine naturelles et de la nature des interactions résultant de l’association de ces partenaires peut contribuer au succès des approches de conception de ligands protéiques in silico. En effet, des critères de sélection et de validation des ligands protéiques artificiels issus de ces méthodes pourraient être définis afin d’augmenter leur taux de succès. Les interfaces protéine-protéine peuvent être analysées selon plusieurs critères : les propriétés structurales, les propriétés chimiques, les propriétés électrostatiques ainsi que les aspects thermodynamiques liés aux phénomènes de solvatation et aux différentes interactions mises en jeu au niveau des interfaces. Dans ce chapitre nous allons passer brièvement en revue les travaux reportés dans la littérature décrivant l’analyse de complexes protéine-protéine naturels et les paramètres permettant de les caractériser.

Classification des complexes protéine-protéine naturels

La capacité de certaines protéines à former des complexes spécifiques stables est fondamentale dans les processus biologiques. Il existe deux types de complexes selon leur durée de vie :
– les complexes non covalents ou transitoires : les complexes antigène-anticorps (Fab D44.1- lysozyme), enzyme-inhibiteur (Elastase-elafin), récepteur-ligand (Herceptin-EGFR) ou les complexes impliqués dans la transduction de signal (Rho-Rho GAP) appartiennent au groupe des complexes non covalents. De manière générale, les différents composants formant ce type de complexe ne sont pas co-localisés et nécessitent donc d’être stables à l’état libre, de se replier séparément et d’assurer leurs fonctions de manière indépendante avant de s’associer.
– les complexes permanents : dans un complexe permanent, les composants du complexe in vivo  ne peuvent pas exister sous forme stable lorsqu’ils sont dissociés. Par exemple, les interactions entre les sous-unités d’une protéine oligomérique sont permanentes et ne sont répresseur Arc du phage P22.
Il faut cependant garder à l’esprit que l’appartenance d’une protéine à l’une ou l’autre de ces catégories n’est pas toujours stricte et peut dépendre des conditions physiologiques et de l’environnement (Nooren et Thornton, 2003).

Complémentarité géométrique entre les surfaces

Plusieurs méthodes ont été proposées pour estimer la complémentarité géométrique entre les surfaces en interaction dans un complexe protéine–protéine. L’indice de vide interfacial ou « gap index » a été proposé pour estimer la complémentarité géométrique de deux partenaires protéiques impliqués dans un complexe (Jones et Thornton, 1996). Cet indice est défini par la relation suivante : Gap index (Å) = volume vide entre molécules (Å3) / interface ASA (Å2). Cet indice est calculé en utilisant la procédure développée par Laskowski (Laskowski, 1991).
Plus le « gap index » est petit, plus l’empilement au niveau des interfaces protéine-protéine est compact. Ceci peut conduire à l’optimisation des interactions de Van der Waals et à la limitation de l’accessibilité au solvant. Selon l’étude menée par Jones et Thornton sur une série de complexes protéine-protéine naturels (Jones et Thornton, 1996), les surfaces d’interaction dans les hétéro-complexes sélectionnés pour cette étude se caractérisent par une valeur moyenne du « gap index » de 2,48 Å mais les fluctuations observées sont importantes (s = 1,02 Å). Ces auteurs ont également montré que la complémentarité était la plus élevée pour les complexes enzyme-inhibiteur (valeur moyenne du « gap index » = 2,20 Å) tandis que les complexes antigène-anticorps sont les moins complémentaires (valeur moyenne du « gap index » = 3,02 Å). Ce dernier résultat peut être expliqué par la présence d’un pourcentage plus élevé en résidus aromatiques au niveau des sites de liaison à l’antigène sur les anticorps (Padlan, 1990) par rapport aux autres interfaces. Ces résidus aromatiques ayant des degrés de liberté conformationnelle moindres par rapport à de plus petits résidus hydrophobes ou polaires, leur prévalence peut conduire à une compacité plus faible au niveau des interfaces. Ces constatations sont également en accord avec les travaux de Lawrence et Colman (Lawrence et Colman, 1993) utilisant le coefficient de corrélation de forme Sc afin d’évaluer la complémentarité géométrique des interfaces protéine-protéine.
La méthode du polyèdre de Voronoï constitue une troisième méthode permettant d’évaluer la compacité des interfaces (Richards, 1974). Cette méthode consiste à tracer un polyèdre de Voronoï autour de chaque atome enfoui dans l’interface, à calculer le volume de ce polyèdre pour chaque atome puis à additionner ces volumes. Le volume résultant V est comparé à une valeur de référence V0 correspondant aux volumes moyens occupés par les atomes de résidus enfouis à l’intérieur de la protéine. Un ratio V/V0 > 1 indique que la compacité au niveau des interfaces est plus faible que celle à l’intérieur des protéines. Lo Conte et ses collaborateurs ont utilisé ce ratio afin de déterminer la compacité des interfaces dans les pour tous les complexes (Lo Conte et al., 1999). Ce résultat montre que les atomes enfouis au niveau des interfaces protéine-protéine sont aussi fortement compactés que ceux au cœur des protéines. Cependant, par cette méthode, aucune différence dans le degré de compacité n’a été observée entre les complexes enzyme-inhibiteur et les complexes anticorps-antigène. Il est à noter également que cette méthode possède un biais car elle ne prend en considération que les atomes totalement enfouis ce qui correspond au 1/3 des atomes de l’interface.

Table des matières

INTRODUCTION
BIBLIOGRAPHIE
PARTIE A : Les venins d’animaux, un réservoir riche en protéines thérapeutiques
I. Composition des venins d’animaux
II. Peptides et protéines de venins à applications thérapeutiques
II.1 Les inhibiteurs des canaux calcium
II.2 Les toxines spécifiques des canaux sodiques
II.3 Les bloqueurs des canaux potassium
II.4 Les toxines inhibant les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine
II.5 Les toxines utilisées dans le traitement des maladies cardiovasculaires
II.6 Toxines utilisées dans le traitement du diabète
III. Les inhibiteurs de protéases dans les venins
III.1 Les inhibiteurs de protéases à sérine
III.2 Les inhibiteurs de protéases à cystéine
III.3 Les inhibiteurs de métalloprotéases
IV. Etude d’un cas particulier : le venin du serpent Dendroaspis polylepis
V. Conclusion
PARTIE B : Conception in silico de ligands protéiques
CHAPITRE I : Ingénierie des protéines pour le développement de ligands
I.1 Les protéines thérapeutiques
I.1.1 Les protéines : de leur connaissance fondamentale aux applications thérapeutiques
I.1.2 Limitations des protéines comme outils thérapeutiques
I.2 Les Anticorps
I.2.1 Applications
I.2.2 Atouts des anticorps
I.2.3 Limitations des anticorps
I.3 Alternatives aux anticorps : les plates-formes génériques
I.3.1 VLRs
I.3.2 Adnectins
I.3.3 Avimers
I.3.4 Affibody
I.3.5 Darpins
I.3.6 Anticalins
I.3.7 Heat Repeat
I.4 L’ingénierie in silico de protéines fondée sur la structure
I.4.1 Amélioration de la spécificité des ligands protéiques
I.4.2 Modulation des interactions protéines-protéines
I.4.3 Modification de sites de liaison protéiques
I.4.4 Transfert de motif fonctionnel sur une protéine hôte
I.4.4.1 Identification des résidus du motif fonctionnel
I.4.4.2 Sélection des plates-formes protéiques hôtes
I.4.4.3 Applications de l’approche de conception de mini-protéines par transfert de motif
I.4.4.3.1 Recherche de plates-formes fondée sur la similarité des structures secondaires
I.4.4.3.2 Recherche de plates-formes non fondée sur la similarité des structures secondaires
CHAPITRE II : Les interactions protéines – protéines
II.1 Classification des complexes protéine-protéine naturels
II.2 Propriétés structurales des interfaces
II.2.1 Taille de l’interface
II.2.2 Structure des sites de reconnaissance dans les interfaces
II.2.3 Complémentarité géométrique entre les surfaces
II.2.4 Changements conformationnels
II.3 Composition chimique des interfaces et nature des résidus
II.4 Propriétés électrostatiques des interfaces
II.4.1 Complémentarité de charge
II.4.2 Complémentarité électrostatique
II.5 Phénomène d’association
II.5.1 Aspects thermodynamiques
II.5.2 Interactions protéine-protéine
II.6 Etude des interfaces de familles de complexes formés par une cible commune et ses différents ligands
II.6.1 Comparaison des formes
II.6.2 Comparaison des potentiels électrostatiques
II.6.3 Taille et composition des interfaces
II.6.4 Complémentarité de charge
II.6.5 Liaisons hydrogène
II.7 Conclusion
CHAPITRE III : Conception de ligands protéiques in silico par transfert de sites actifs
III.1 Principe de la méthode de conception de ligand protéique
III.1.1 Motif fonctionnel
III.1.2 Système de référence
III.1.3 Protéine hôte
III.2 Méthodes de sélection des protéines hôtes
III.2.1 STAMPS
III.2.1.1 Principe de la recherche de motif
III.2.1.2 Filtre stérique
III.2.1.3 Autres critères
III.2.2 Comparaison avec les autres méthodes décrites dans la littérature
III.3 Conclusion
CHAPITRE IV : Application : Ciblage du domaine catalytique des MMPs
IV.1 Aspects structuraux des MMPs
IV.1.1 Organisation des différents domaines des MMPs
IV.1.2 Structure tridimensionnelle du domaine catalytique des MMPs
IV.2 Les MMPs : des cibles thérapeutiques potentielles
IV.2.1 Rôles physiologiques
IV.2.2 Implication des MMPs à différents stades d’un processus pathologique
IV.2.3 Rôle ambivalent des MMPs
IV.3 Les inhibiteurs naturels des MMPs : les TIMPs
IV.3.1 Aspects structuraux des TIMPs
IV.3.2 Affinité et sélectivité
IV.3.3 Mécanisme d’inhibition des MMPs
IV.4 Conclusion
MATERIELS ET METHODES
MATERIEL
METHODES
I. Recherche de protéines inhibitrices de MMPs dans le venin du serpent Dendroaspis polylepis
I.1 Fractionnement du venin par chromatographie d’échange d’ions
I.2 Purification par RP-HPLC des fractions issues de la chromatographie d’échange d’ions
I.3 Criblage des fractions sur les MMPs
II. Recherche in silico de plates-formes par le programme STAMPS
II.1 Données nécessaires à la recherche
II.2 Paramètres de recherche
III. Analyse électrostatique des plates-formes
III.1 Calcul du potentiel électrostatique des plates-formes mimes et du ligand de référence
III.2 Comparaison des potentiels électrostatiques entre les plates-formes mimes et le ligand de référence
III.3 Comparaison des formes des plates-formes mimes et du ligand de référence
IV. Procédure de relaxation par dynamique moléculaire et minimisation d’énergie
IV.1 Minimisation d’énergie sous contraintes
IV.2 Dynamique moléculaire dans le vide
IV.3 Dynamique moléculaire en solvant explicite
IV.4 Analyse des interfaces plates-formes mimes/MMP-14
V. Production des plates-formes par synthèse peptidique
V.1 Synthèse chimique sur support solide
V.2 Purification du brut de synthèse par RP-HPLC
V.3 Formation des ponts disulfures
VI. Production des plates-formes par voie recombinante chez E. coli
VI.1 Construction des vecteurs d’expression
VI.2 Production des mini-protéines d’intérêt
VI.3 Extraction et purification des protéines de fusion
VI.4 Clivage et purification des mini-protéines d’intérêt
VII. Caractérisation des mini-protéines produites par synthèse chimique et par voie recombinante1
VIII. Tests enzymatiques d’inhibition des MMPs
IX. Détermination de la structure du complexe mini-protéine/MMP par cristallographie aux rayons X
IX.1 Cristallogenèse
IX.2 Collecte des données et détermination de la structure tridimensionnelle
RESULTATS
PARTIE A : Recherche d’inhibiteurs de MMPs dans le venin du serpent Dendroaspis polylepis 
I.1 Fractionnement du venin de serpent Dendroaspis polylepis par système bi-dimensionnel
I.2 Criblage des venins de serpents sur les MMPs
PARTIE B : Conception in silico de ligands protéiques inhibiteurs de MMPs
CHAPITRE I : Système de référence : TIMP/MMP
I.1 Données structurales et fonctionnelles sur les complexes TIMP/MMP
I.2 Analyse de l’interface du complexe TIMP-2/MMP-14 (1bqq)
I.2.1 Propriétés globales de l’interface
I.2.1.1 Variation de surface accessible au solvant/Taille de l’interface
I.2.1.2 Compacité de l’interface
I.2.1.3 Composition de l’interface
I.2.2 Interactions intermoléculaires
I.2.2.1 Liaisons hydrogène
I.2.2.2 Autres types d’interactions
I.2.2.3 Localisation des interactions
I.2.3. Propriétés électrostatiques
I.3 Conclusion
CHAPITRE II : Recherche de plates-formes protéiques par STAMPS
II.1 Critères de recherche in silico du programme STAMPS
II.2 Identification et sélection des plates-formes
II.3 Analyse des plates-formes sélectionnées
II.3.1 Origines et fonctions des plates-formes
II.3.2 Structures secondaires
II.3.3 Les motifs de liaison
II.4 Analyse des potentiels électrostatiques
II.4.1 Analyse graphique
II.4.2 Analyse des indices de similarité de Hodgkin
II.5 Analyse des interfaces plateforme/cible
II.6 Conclusion
CHAPITRE III : Production des ligands conçus in silico et caractérisation comme inhibiteurs de MMPs
III.1 Production des mini-protéines conçues in silico par synthèse chimique
III.1.1 Synthèse sur support solide
III.1.2 Clivage du produit de synthèse final
III.1.3 Purification du produit brut de synthèse par RP-HPLC
III.1.4 Formation des ponts disulfures
III.2 Production des plates-formes protéiques par voie recombinante
III.2.1 Construction des plasmides d’expression
III.2.1.1 Essais et mise au point des différentes stratégies d’expression
III.2.1.2 Stratégie optimale adoptée pour l’expression des mini-protéines d’intérêt
III.2.2 Production et purification des protéines de fusion
III.2.3 Clivage des protéines de fusion et purification des mini-protéines d’intérêt
III.2.4 Caractérisation des mini-protéines produites par voie recombinante
III.2.5 Rendement de production des mini-protéines d’intérêt
III.3 Evaluation des mini-protéines comme inhibiteurs de MMPs
III.4 Optimisation de certaines mini-protéines identifiées in silico
III.4.1 Variants de la plate-forme 1edpA pour la position 2 du motif de liaison
III.4.2 Variants de la plate-forme 1an1I_m par mutagénèse dirigée
III.5 Caractérisation structurale de l’interaction mini-protéine/MMP
III.6 Etude de la stabilité des interactions par dynamique moléculaire
III.7 Conclusion
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES
ARTICLES PUBLIÉS

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