Peptides et polypeptides régulant la ponte

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Les organes génitaux femelles

Chez la femelle, l’appareil génital se compose d’un ovaire unique auquel s’ajoutent les glandes annexes : la glande de l’oviducte, et les glandes nidamentaires principales et accessoires (Figure 5).
L’ovaire, est suspendu à la paroi dorsale du coelome génital, dans la partie dorsale la plus postérieure de l’animal. C’est une structure constituée de tissu conjonctif très vascularisé (le stroma), d’une zone corticale de cellules germinales, et d’un épithélium très mince continu avec le coelome génital. Le coelome génital est formé d’un sac translucide qui contient les ovocytes matures et s’ouvre sur la partie proximale de l’oviducte.
L’oviducte se trouve sur le côté gauche. Il est composé de deux parties : la partie proximale qui est la continuité du coelome génital et la seconde partie, glandulaire, qui est nommée oviducte distal, et qui se termine par le pavillon. Le transport de l’ovocyte dans l’oviducte est assuré par des contractions rythmiques péristaltiques qui permettent une progression continue.
La glande de l’oviducte (GOVI) est une structure blanche traversée par l’oviducte distal. Elle est constituée de lamelles de tissu conjonctif recouvert d’épithélium glandulaire (Figure 5A) Elle sécrète les mucopolysaccharides et les protéines capsulaires constitutifs de la capsule interne de l’oeuf, ainsi que des phéromones sexuelles peptidiques et polypeptidiques (Enault et al., 2012). Le pavillon, situé à l’extrémité distale de l’oviducte distal, est une structure en forme de « cuillère pointue » qui pourrait être impliquée dans la présentation de l’ovocyte à proximité de l’orifice du canal sécréteur des glandes nidamentaires principales. Des observations réalisées au laboratoire lors des tests myotropes montrent que la lésion du pavillon induit une perte de sensibilité de l’oviducte distal aux stimulations myotropes, ce qui pourrait signifier la présence de récepteurs impliqués dans la régulation du processus de ponte.
Les seiches possèdent deux paires de glandes nidamentaires situées en position ventrale médiane. Les glandes nidamentaires principales (GNP) sont de taille importante chez les femelles matures si on les compare à la GOVI. D’un blanc laiteux en prévitellogénèse, elles prennent une teinte blanc nacré à maturité et sont nervurées de noir en post ponte. Leur organisation histologique est semblable à celle de la glande de l’oviducte (Figure 5B). Elles secrètent également des mucopolysaccharides et des glycoprotéines qui entrent dans la composition de la capsule externe de l’oeuf (Cornet et al., 2015b). Les glandes nidamentaires accessoires (GNA) sont de couleur orange vif à maturité et forment une structure trilobée. Ces glandes sont rattachées à la partie distale des GNP. Leur organisation tissulaire montre un ensemble de tubules glandulaires (Figure 5C). Bien que peu de données soient disponibles sur les GNA chez la seiche, plusieurs messagers impliqués dans la voie Toll/NF-κB, responsables de la reconnaissance entre les symbiotes et les pathogènes, ont été identifiés (Cornet et al., 2015a).

Les organes génitaux mâles

L’appareil génital mâle est constitué du testicule, du canal déférent et des glandes annexes. Le testicule se trouve dans la partie dorso-postérieure de l’animal dans l’axe médian. Il est relié par le canal déférent aux glandes annexes, situées sur le côté gauche. Ces glandes annexes, les glandes accessoires et les vésicules séminales, sont impliquées dans la formation des spermatophores qui sont stockés dans la glande de Needham en attendant l’accouplement. Les contractions du pénis libèrent les spermatophores dans la cavité palléale, ceux-ci sont ensuite saisis par le bras hectocotyle du mâle et transférés à la femelle dans la poche copulatrice.

L’appareil circulatoire

Chez la seiche, comme chez tous les Céphalopodes, l’appareil circulatoire est clos et les artères sont reliées aux veines par un réseau de capillaires sur le modèle de ce que l’on observe chez les vertébrés. L’appareil se compose d’un coeur situé en position centrale, et de deux coeurs branchiaux situés à la base des branchies. Chez la seiche, une seule aire neurohémale a été décrite (Alexandrowicz, 1965, 1964, 1960; Tompset, 1939). Cette aire est connectée au lobe palléovisceral de la masse sous oesophagienne.

L’organe olfactif

Chez les coléoïdés, les fossettes, les papilles ou l’organe olfactif, selon la dénomination adoptée, sont situés de chaque côté du céphalopodium, en arrière des yeux (Bidder et al., 1989). Peu d’informations sont disponibles chez la seiche concernant ces structures sous cutanées, cependant chez le calmar, l’épithélium serait semblable à celui du rhinophore du nautile (Emery, 1975). L’organe olfactif est considéré comme sensible aux stimuli chimiques et contrôlerait la qualité de l’eau entrant dans la cavité palléale. Selon une hypothèse de Woodhams et Messenger l’organe olfactif serait le siège de la détection des phéromones sexuelles (Woodhams and Messenger, 1974).

Cycle de vie de la seiche de Manche

Le cycle de vie de la seiche de Manche est ponctué de migrations saisonnières horizontales induites par la chute des températures côtières en période hivernale (Figure 6). Ce cycle a été parfaitement décrit par Boucaud-Camou et Boismery (Boucaud-Camou and Boismery, 1989). Les oeufs sont pondus au printemps au niveau des côtes de la Baie de Seine et de l’ouest Cotentin. L’éclosion a lieu au milieu de l’été après trois mois de développement embryonnaire dans les aires de ponte côtières. Les paralarves (morphologiquement identiques à l’adulte) fraichement écloses bénéficient ainsi d’une nourriture abondante et de températures favorables au développement post-embryonnaire.
Les jeunes seiches âgées d’environ 4 mois, migrent une première fois à la mi-novembre vers la Manche Ouest. Leur destination est la zone d’hivernage située au Sud du Cap Lizard, sur des fonds de 60 à 70 mètres de profondeur. Les animaux, juvéniles et pré-adultes, y bénéficient de températures plus favorables que celles observées sur les côtes à la même période avec une température moyenne voisine de 9°C. L’hivernage se poursuit jusqu’à la fin du mois de février avec un retour sur les côtes Normandes pour une estivation de mars à octobre avant de repartir en Manche ouest à la mi-novembre.
À la fin de la seconde estivation, soit environ 14 mois après l’éclosion, la majorité des seiches mâles sont sexuellement matures, tandis que les femelles commencent leur gamétogénèse.
Ce n’est qu’après la quatrième et dernière migration, qui se traduit par un retour sur les aires de ponte côtières, que les femelles sont prêtes à pondre. Les mécanismes impliqués dans les migrations sont encore méconnus bien que le rôle de phéromones sexuelles peptidiques et polypeptidiques libérées par les femelles soit fortement suspecté. Une régulation similaire a été décrite chez un autre mollusque marin, l’aplysie, chez laquelle un bouquet de phéromones polypeptidiques et protéiques a été identifié et caractérisé sur un plan structural et fonctionnel (Cummins et al., 2005; Cummins et al., 2004; Painter et al., 1998).
Au printemps de la deuxième année du cycle, les seiches s’accouplent, les femelles pondent et les géniteurs meurent massivement. Le phénomène est observable par des échouages importants d’os de seiche sur les plages de Baie de Seine et de l’Ouest Cotentin.

Peptides et polypeptides régulant la ponte

Introduction

Comme précisé précédemment, chez la seiche, la ponte est sous le contrôle d’au moins trois types de régulateurs peptidiques : des neuropeptides associés à la perception des paramètres environnementaux, des peptides régulateurs ovariens assurant la régulation paracrine du tractus génital, et des phéromones sexuelles impliquées d’une part dans la régulation de la ponte et probablement dans la concentration des géniteurs sur les aires de ponte côtières.

Les neuropeptides

Présentation générale

Les neuropeptides sont de courtes chaines d’acides aminés produites par le tissu nerveux et qui participent à la régulation de nombreux processus physiologiques tels que la reproduction, la digestion, la nutrition, la circulation, l’excrétion et les processus comportementaux (Nässel and Larhammar, 2013). Ils sont issus de la maturation d’un précurseur protéique, le prepropeptide, qui peut porter plusieurs neuropeptides différents, présents sous la forme de plusieurs copies ou en un seul exemplaire.
Le prepropeptide d’un neuropeptide possède une séquence signale à l’extrémité N-terminale. Cette séquence signale (ou peptide signal) qui permet l’adressage du complexe ARNm/ribosomes vers les membranes des citernes du réticulum endoplasmique granuleux (REG) est clivée par une peptidase membranaire dès son entrée dans la lumière du REG.
Les séquences des neuropeptides sont généralement encadrées par des sites de clivage mono, di ou tribasiques sauf si la séquence est accolée au peptide signal tel que l’on peut l’observer pour les ocytocines/vasopressines, le GnRH, les neuropeptides Y, etc. ou si au contraire elle est positionnée en C-terminal comme les Bursicons, les CCAPs, les NKY ou l’urotensine II.
Les neuropeptides sont libérés par des endopeptidases, les prohormones convertases, présentes dans la lumière de l’appareil de Golgi. De nombreux neuropeptides subissent des modifications post-traductionnelles pour acquérir une structure biologiquement active, que ce soient la formation de ponts disulfures, la mise en place d’une amidation C-terminale, ou la cyclisation d’une glutamine N-terminale en acide pyroglutamique (De Haes et al., 2015).
Les neuropeptides sont exprimés et sécrétés afin de répondre à un stimulus qui peut être une modification environnementale ou une stimulation mécanique, par exemple. Ils se lient à un récepteur membranaire couplé à une protéine G, déclenchant ainsi une cascade de réactions intracellulaires aboutissant à la modulation de l’activité des cellules cible.

Les neuropeptides chez les Mollusques

La régulation neuroendocrine de la ponte a bien été décrite chez les Mollusques Gastéropodes hermaphrodites, notamment chez la lymnée Lymnea stagnalis et chez l’aplysie Aplysia californica, respectivement pulmoné et opistobranche. Ces Gastéropodes montrent par ailleurs des comportements stéréotypés et bien décrits lors de l’accouplement et de la ponte (Morishita et al., 2010) tels que l’inhibition de la locomotion et des ondulations de la tête (Arch and Smock, 1977; Ferguson et al., 1989).
Chez l’aplysie, le contrôle de la ponte est régulé par une neurohormone : l’ELH (Egg Laying Hormone) (Chiu et al., 1979). L’ELH est un neuropeptide amidé possédant 36 résidus (Figure 9). Elle déclenche la ponte si elle est injectée à des animaux matures (Bernheim and Mayeri, 1995), in vitro elle déclenche, de façon dose-dépendante, l’émission d’oeufs par l’ovotestis isolé à partir de 8.10-10 M (Barry S. Rothman et al., 1983). Enfin, elle excite le neurone R15 situé dans le ganglion abdominal (Branton et al., 1978), il en résulte la libération du peptide R15α1, qui module le transport de l’ovocyte par le biais du péristaltisme du grand canal hermaphrodite (Alevizos et al., 1991).

Les régulateurs ovariens

Régulation paracrine chez les Mollusques

Chez l’huitre creuse Crassostrea gigas, le PIESVD est le premier peptide régulateur ovarien à avoir été identifié (Bernay et al., 2006b). Ce régulateur agit spécifiquement sur les femelles matures en modulant l’activité du muscle adducteur dont les contractions participent à l’émission des gamètes dans le milieu pendant la période de reproduction. Des travaux récents montrent que ce peptide est clivé à partir d’une protéine vitelline (Joël Henry, communication personnelle).

Régulation paracrine chez la seiche

La 5-Hydroxytryptamine (5-HT) est le premier régulateur ovarien identifié chez la seiche (Zatylny et al., 2000a). Isolée à partir d’ovocytes matures, elle contribue à leur stockage dans le coelome génital avant l’accouplement et cible l’oviducte proximal dont elle inhibe, de façon dose dépendante, les contractions (diminution de l’amplitude et de la fréquence). Ce régulateur est synthétisé par l’ovocyte dès le début de la vitellogénèse (stade IVa) jusqu’au stade mature (stade V), où la concentration est maximale.
Le tétrapeptide ILME (Zatylny et al., 2000b) a été identifié à partir d’un extrait peptidique d’oeufs, il est aussi présent au niveau des follicules vitellogéniques et des ovocytes lisses. Il est détecté dans l’eau d’incubation des oeufs et des ovocytes matures, ce qui fait qu’il est également considéré comme une phéromone aquatique. L’ILME déclenche la cyclisation des contractions de l’appareil génital femelle à partir de 10-14 M. Ce peptide augmente le tonus et la fréquence des contractions des GNP, responsables de la sécrétion de la capsule externe de l’oeuf. Il cible spécifiquement le tractus génital et les GNP, et n’a pas d’effet sur d’autres organes contractiles tels que l’oesophage, par exemple.
La SepOvotropine (Zatylny et al., 2000c) a été identifiée à partir de follicules vitellogéniques et est également présente dans les ovocytes matures et dans les oeufs. Ce peptide module les contractions du tractus génital des femelles matures à partir de 10-19 M.
À 10-10 M la SepOvotropine déclenche la cyclisation des contractions de l’oviducte distal. Bien que n’étant pas impliqué dans la motilité du tractus génital, le SepSAP (pour Sepia Sperm Attracting Peptide, (Zatylny et al., 2002)) n’en n’est pas moins impliqué dans la ponte. Cet hexapeptide amidé en C-terminal est exprimé par les follicules vitellogéniques et est libéré par les ovocytes encapsulés lors de la ponte. Actif dès 10-17 M, il facilite la rencontre des gamètes en exerçant un effet attractant sur les spermatozoïdes, permettant sans doute une sélection des gamètes les plus compétentes pour la fertilisation.
Le Sepia Capsule Releasing Peptide, ou SepCRP, est exprimé pendant la vitellogénèse dans les follicules ovariens (Bernay et al., 2004). Il cible spécifiquement l’oviducte et la GNP dont il inhibe les contractions. Tout comme la 5-HT, il serait impliqué dans le stockage des ovocytes avant l’accouplement. Sept autres peptides apparentés à ce premier SepCRP ont été identifiés par la suite (Bernay et al., 2005). Ces peptides conservent une activité similaire.
Les Ovarian Jelly Peptides ou OJPs présentent des similitudes avec les SepCRPs : même localisation, activité semblable sur les mêmes organes cibles, et séquence qui conserve un domaine (DEV(K) (Bernay et al., 2006a). Le nom de cette famille de peptides régulateurs ovariens provient de leur propriété gélifiante en solution aqueuse. Enfin, la Sepovotropine, les SepCRPs et les OJPs sont issus du clivage d’une protéine vitelline très abondante dans les follicules ovariens vitellogéniques et les ovocytes matures (Joël Henry, communication personnelle).

Les phéromones sexuelles

Présentation générale

Une phéromone se définit comme une substance de nature biochimique variable (peptide, protéine, lipide, ester, etc…), sécrétée dans l’environnement par un individu d’une espèce donnée, et qui est reçue par un individu de la même espèce chez qui elle déclenche une réaction spécifique, tel un comportement morphologique ou une réaction stéréotypée. Contrairement à d’autres formes de communication chimique, une phéromone implique une notion de volonté de la part de l’émetteur et du receveur.
Les phéromones ont pour particularité de déclencher une réaction à très faible concentration, et peuvent agir en mélange sous forme de bouquet dont la composition qualitative et quantitative module la spécificité du message.
La nature chimique des phéromones est variable selon l’organisme, le rôle et le mode de transport : les phéromones de faible poids moléculaire (esters, alcools, aromatiques…) sont plutôt volatiles et donc facilement transportables par voie aérienne. De par leur nature il s’agit surtout de phéromones de communication à longue distance comme par exemple le bombykol libéré par la femelle Bombyx mori (Butenandt et al., 1961). Les phéromones de masse moléculaire plus élevée (protéines, stéroïdes, hydrocarbures cuticulaires…) sont présentes chez les organismes vivant en groupe et dont les signaux sont échangés à faible distance ou par contact. Ces phéromones de contact sont effectives lors de la manipulation (d’oeufs par exemple). Les phéromones protéïques, polypeptidiques et peptidiques peuvent être modifiées pour limiter leur dégradation dans le milieu (amidation C-terminale, ponts disulfures intra-chaine des protéines et N-glycosylations).
Il existe deux classes de phéromones, définies selon les travaux de Wilson (Wilson, 1963). Les phéromones incitatrices qui déclenchent une modification instantanée et réversible du comportement du receveur (migration, attitude agressive, attitude copulatrice…). On retrouve dans cette classe les phéromones d’identité, sexuelles, d’alarme, de piste, d’agrégation, territoriales, et d’espacement. La seconde classe est celle des phéromones modificatrices qui déclenchent des changements morphologiques ou physiologiques sur les individus. Cette classe est largement représentée chez les insectes sociaux avec les phéromones de caste et de grégarisation.

Les phéromones sexuelles

Les phéromones sexuelles sont dites incitatrices : elles visent à modifier instantanément et temporairement le comportement de l’individu receveur. Ces phéromones peuvent avoir un effet attractant, telle que l’attractine chez l’aplysie (Painter et al., 2003) ou la darcine chez la souris (Roberts et al., 2010). Elles peuvent jouer un rôle dans la régulation de la ponte, comme le tétrapeptide ILME chez la seiche (Zatylny et al., 2000b), ou encore dans la sélection des géniteurs comme la Loligo-β-sémino-protéine (Loligo-β-MSP) chez le calmar Loligo pealeii (Cummins et al., 2011).

Phéromones sexuelles chez les Insectes

Le bombykol est la première phéromone sexuelle identifiée chez le Bombyx du murier (Butenandt et al., 1961). Il s’agit d’une phéromone volatile (alcool) secrétée par la femelle pour attirer le mâle. Le bombykol déclenche une action à très faible concentration : il a été démontré qu’une seule molécule de bombykol suffit à déclencher un potentiel d’action chez le mâle.
Chez la drosophile, trois phéromones sexuelles ont été identifiées (Gomez-diaz and Benton, 2013). La 11-cis-vaccentyl acetate (cVA) est une phéromone lipidique volatile produite par la drosophile mâle, connue pour inhiber les comportements de cour des autres mâles (Bartelt et al., 1985) et favoriser l’accouplement avec les femelles (Kurtovic et al., 2007). De plus, elle agit aussi comme phéromone d’agrégation. Cette phéromone est détectée par le récepteur Or67d exprimé dans les antennes des mâles et des femelles (Ha and Smith, 2006; Kurtovic et al., 2007). Les deux autres phéromones sont des hydrocarbures cuticulaires qui agissent par contact et qui sont produites de manière sexe-spécifique : la 7,11-heptacosadiene (7,11-HD) est produite par les femelles et agit comme un aphrodisiaque chez les mâles, tandis que la phéromone mâle 7-tricosene a un effet antagoniste (Benton, 2007; Kurtovic et al., 2007).

Phéromones sexuelles chez les Mammifères

Chez les Mammifères, plusieurs phéromones sexuelles ont été identifiées. Elles agissent notamment sur le comportement des géniteurs. Elles sont reconnues par l’organe voméro-nasal (ou organe de Jacobson) situé entre le palais et les fosses nasales et spécialisé dans la détection des phéromones, ou par l’épithélium olfactif principal situé dans la cavité nasale. Ces phéromones sont libérées et associées à l’urine ou aux sécrétions lacrymales.
Chez la souris, la phéromone ESP1 (pour Excorine-Gland-Secreting peptide 1) est un peptide de 7 kDa exclusivement produit par le mâle (Yoshinaga et al., 2013). Ce peptide est secrété par les glandes lacrymales extraorbitales et est reconnu par le récepteur Vmn2r116 (aussi connu sous le nom de V2Rp5) exprimé dans l’organe voméro-nasal des mâles et des femelles (Haga et al., 2010).
L’activité d’ESP1 sur le comportement de la souris est sexe dépendante : ainsi chez la femelle, ESP1 déclenche un comportement de lordose (reflexe copulatoire de courbure de la colonne vertébrale favorisant la pénétration). Chez la souris mâle, EPS1 agit en synergie avec l’urine de mâles non familiers et déclenche un comportement agressif (Hattori et al., 2016). La Darcine (ou Major Urinary Protein 20, Mup20) est une petite protéine de 18893 Da présente dans l’urine des souris mâle (Roberts et al., 2010). Elle déclenche l’attraction des femelles pour un mâle émetteur spécifique. Enfin, les composés volatiles tels que le DHB (3,4-dehydro-exo-brevicomin) et la SBT (2-sec-butyl-4,5-dihydrothiazole), sont également retrouvés dans l’urine des mâles et agissent seuls ou en combinaison. Ils sont impliqués dans l’attraction des femelles, dans l’agression entre mâles, et induisent l’oestrus (Dulac and Torello, 2003).

Phéromones sexuelles chez les Mollusques non Céphalopodes

Chez les Mollusques autres que les Céphalopodes, la communication visuelle est limitée par le faible développement des yeux et par la turbidité du milieu. La communication chimique joue donc un rôle important pour permettre le regroupement de géniteurs, la reconnaissance des partenaires sexuels ou encore la synchronisation de l’émission de gamètes. Par ailleurs, le caractère sessile de certains Mollusques tels que certains bivalves nécessite la synchronisation de l’émission des gamètes afin de permettre un taux de fécondation suffisant. La libération de messagers chimiques synchronisant l’émission des gamètes mâles et femelles est une nécessité.
Les études sur les phéromones initiées chez la seiche se sont appuyées sur les travaux réalisés chez l’aplysie, un Gastéropode marin. Aplysia californica et Sepia officinalis partagent des caractéristiques communes d’un point de vue comportemental et sont de fait très proches au niveau phylogénétique.
Ces deux mollusques ont un comportement comparable au moment de la période de reproduction, caractérisée par des concentrations très importantes de géniteurs sur les aires de pontes côtières. Par ailleurs, leurs migrations sont horizontales et verticales, et annuelles. Enfin, les regroupements de géniteurs facilitent les accouplements et se traduisent par de fortes densités d’oeufs dans des zones côtières très localisées.
Chez le genre Aplysia, un bouquet de phéromones composé de quatre peptides et polypeptides (Cummins et al., 2005; Cummins et al., 2004; Painter et al., 1998) a été identifié et caractérisé (Figure 16). Ce bouquet a un effet attractant sur les géniteurs et est libéré par les oeufs et les individus sexuellement matures. L’expression de ces phéromones est localisée au niveau de la glande de l’albumine, homologue fonctionnel de la glande de l’oviducte (sécrétion de la capsule interne) et des glandes nidamentaires principales (sécrétion de la capsule externe) de la seiche.

Table des matières

Introduction générale
I. Contexte, problématique et objectifs
II. Le modèle Sepia officinalis
A. Généralités
B. Anatomie
1. Anatomie générale
2. Le système nerveux central
3. L’appareil reproducteur
a. Les organes génitaux femelles
b. Les organes génitaux mâles
4. L’appareil circulatoire
5. L’organe olfactif
C. Cycle de vie de la seiche de Manche
D. Reproduction
1. L’ovogénèse
2. L’accouplement
3. La ponte
E. Comportement
III. Peptides et polypeptides régulant la ponte
A. Introduction
B. Les neuropeptides
1. Présentation générale
2. Les neuropeptides chez les Mollusques
C. Les régulateurs ovariens
1. Régulation paracrine chez les Mollusques
2. Régulation paracrine chez la seiche
D. Les phéromones sexuelles
1. Présentation générale
2. Les phéromones sexuelles
3. Phéromones sexuelles chez les Insectes
4. Phéromones sexuelles chez les Mammifères
5. Phéromones sexuelles chez les Mollusques non Céphalopodes
6. Phéromones sexuelles chez les Céphalopodes
IV. Approches expérimentales
Matériels et méthodes
I. Matériel Biologique
A. Animaux
B. Prélèvements de matériel biologique
II. Approche transcriptomique
A. Extraction d’ARN
B. Séquençage et création d’une banque de transcrits
C. Analyses in silico
III. Approche peptidomique
A. Extractions
1. Extraction de neuropeptides
2. Extraction de phéromones à partir de la GOVI et des capsules d’oeufs
3. Extraction de phéromones à partir d’eau d’incubation d’oeufs
B. Purification
1. Chromatographie Liquide Haute performance en phase inverse (rpHPLC)
a. Purification de phéromones du milieu d’incubation des oeufs
b. Purification de capsules internes et externes
c. Purification de phéromones de GOVI
2. Nano-LC-MALDI-TOF/TOF
C. Réduction, alkylation et digestion trypsique
D. Spectrométrie de masse
E. Séquençage d’Edman
IV. Production de la phéromone β en système recombinant
A. Transformation bactérienne
B. Contrôle de l’intégration du plasmide par PCR
C. Production en système recombinant
D. Extraction et purification de la phéromone β recombinante
E. Dosage Bradford et gel SDS-PAGE
1. Dosage Bradford
2. Gel SDS-PAGE
V. Cartographie tissulaire en immunocytochimie
A. Préparation des échantillons
B. Immunocytochimie
C. Contre-coloration au Trichrome de Prenant-Gabe
D. Observations microscopiques
VI. Synthèse peptidique
VII. Caractérisation fonctionnelle
A. Analyses ex vivo
B. Tests comportementaux
VIII. Analyses structurales en RMN et CD
Partie I : Caractérisation structurale et fonctionnelle de deux familles de neuropeptides impliquées dans le contrôle de la ponte
I. Introduction
II. Crustacean Cardioactive Peptides
III. Neuropeptides FLGamides
IV. Conclusion
Partie II : Caractérisation de phéromones sexuelles et production en système recombinant
A. Phéromones sexuelles, ponte et reproduction
B. Phéromones sexuelles chez le genre Aplysia
C. Phéromones sexuelles chez Sepia officinalis
D. Objectifs
II. Résultats et discussion
A. Caractérisation structurale des précurseurs SP
1. À partir de la glande de l’oviducte
2. À partir des capsules d’oeufs
3. À partir de l’eau d’incubation des oeufs
4. À partir de l’eau d’incubation des oeufs fractionnée en rpHPLC
B. Recherche de récepteurs candidats à la liaison des phéromones sexuelles
C. Production de la phéromone β et tests fonctionnels
III. Conclusions et perspectives
Conclusion générale et perspectives
Références bibliographiques

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