Pectines méthylestérases et leurs inhibiteurs/ pectines acétylestérases

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Le gamétophyte mâle

La formation du grain de pollen

Les grains de pollen vont se former dans les anthères. Durant la microsporogenèse (Fig. 6), certaines cellules, les archéspores, vont se multiplier pour donner une masse de cellules mères, les microsporocytes. Les microsporocytes subissent une méiose qui conduit à la formation de quatre cellules haploïdes, les tétraspores (Twell et al., 1998; Honys and Twell, 2004). Ces cellules sont entourées de callose et synthétisent une paroi dite primexine. Sous l’effet d’enzymes telles que la β-(1-3)-glucanase, les PMEs (pectines méthylestérases) et les endo- polygalacturonases, issues du tapis staminal, les tétraspores sont séparées en microspores libres. Des travaux effectués sur les mutants quartet, qrt1 et qrt3, codant respectivement pour une PME et une polygalacturonase, ont permis de montrer l’importance de ces enzymes lors de la séparation des tétraspores (Hird et al., 1993; Owen and Makaroff, 1995; Rhee, 2003, Francis et al., 2006).
Lors de l’étape de microgamétogenèse, on observe l’expansion et la maturation de chaque microspore séparément via la déposition d’une couche d’exine à l’extérieur des microspores, puis une autre couche, l’intine, est à son tour déposée entre l’exine et la membrane plasmique durant la période d’expansion (Quilichini et al., 2014).
Au cours de cette maturation, le noyau va subir par la suite une mitose inégale et une déshydratation pour devenir un gamétophyte mâle ou un grain de pollen mature. Un grain de pollen peut être bicellulaire (noyau végétatif et noyau génératif) quand la seconde mitose se produit dans le tissu femelle ou tricellulaire : au moment de l’anthèse, les grains de pollen des Brassicaceae (A. thaliana), des Poaceae et des Asteraceae sont composés de trois noyaux (un noyau végétatif et deux noyaux gamétiques). La seconde mitose se fait donc dans les anthères, ce qui est favorable à une fécondation rapide. Ce caractère est considéré comme une avancée d’un point de vue phylogénique (Brewbaker, 1967; Williams et al., 2014). Après la déhiscence des anthères, les grains de pollen ne contiennent que 10 à 20% de leurs poids total en eau (Stanley and Linskens, 1974).
Lorsque ces grains de pollen sont matures, ils sont protégés par une paroi qui présente de nombreuses variations structurales, de composition ou d’épaisseur. ‐lle est constituée d’un mélange de polymères qui confèrent au pollen une grande résistance mécanique et chimique à la dégradation. Cette paroi se compose de deux parties : l’intine et l’exine (‑ig. 7A et B). L’exine est elle-même formée de deux couches : la sexine (externe) et la nexine (interne). La sexine est une couche réticulée grâce aux bacula qui sont ornées avec des tectums et aux pilums qui ne sont pas ornés (Fig. 7C). La sexine est majoritairement composée de sporopollenine. L’exine joue également un rôle important dans l’adhésion aux insectes pollinisateurs et à la surface du stigmate (Edlund, 2004). L’intine est partiellement exposée à l’environnement via les apertures, et est composée de cellulose, callose, pectines et xyloglycanes (Esau, 1977; Hesse et al., 2009; Dardelle et al., 2010; Borg and Twell, 2010; Lampugnani et al., 2013; Lou et al., 2014).
Les différences présentées par l’exine permettent de distinguer différentes formes de grains de pollen dépendant de l’espèce (‑ig. 8). ‐n effet, l’exine peut contenir une ou plusieures apertures selon l’espèce. L’aperture est une région spécialisée plus fine qui en général diffère par son ornementation et/ou sa structure. Les apertures servent de site de germination, mais elles peuvent également servir de porte d’entrée pour l’eau ou d’autres substances, et jouent aussi un rôle important dans l’harmomégathie, qui est la résistance aux variations de volume au cours des évènements de déshydratation/réhydratation (Wodehouse, 1935; Mignot et al., 1994; Hesse et al., 2009; Prieu, 2015).

La pollinisation

Après la maturation des grains de pollen, le pollen peut se disséminer (Keijzer, 1987; Wilson et al., 2011). La dissémination du pollen peut se faire par plusieurs mécanismes :
– l’anémogamie : le pollen est transporté par le vent, ce type de transport est majoritairement présent chez les Gymnospermes,
– l’entomogamie : le pollen est transporté par des insectes,
– l’ornithogamie : le pollen est transporté par les oiseaux,
– l’autogamie : la fécondation se fait spontanément sans l’intervention d’un facteur externe.
Les phénomènes d’incompatibilité
Afin de permettre la fécondation croisée et le brassage génétique, les plantes ont mis en place au cours de l’évolution différents mécanismes empêchant l’auto-fécondation. Ces mécanismes se révèlent important, notamment à cause de la proximité spatiale des organes mâle et femelle favorisant l’auto-fécondation. Plusieurs mécanismes peuvent être cités : anatomique, temporel et génétique.
Les mécanismes anatomiques d’incompatibilité sont mis en place grâce à un polymorphisme floral complexe, telle que l’hétérostylie où les fleurs ont des styles longs et des étamines courtes. De ce fait, la probabilité d’auto-fécondation est réduite, comme c’est le cas chez la primevère commune (Primula vulgaris) (Webb and Lloyd, 1986; Barrett, 2002).
Dans le cas des mécanismes temporels, les organes de reproduction mâle et femelle ne sont pas matures en même temps. Ce phénomène est appelé dichogamie, comme chez le maïs (Zea mays), où les organes mâles sont matures avant les organes femelles (Bertin and Newman, 1993).
Un contrôle génétique élaboré permet également aux plantes de reconnaître, d’accepter ou de rejeter, le pollen selon son origine. Il existe deux principaux types d’incompatibilité :
– l’interspécifique : qui est le rejet du pollen par une plante d’une autre espèce,
– l’intraspécifique : qui est le rejet du pollen par une plante d’une même espèce. Cela permet un meilleur brassage génétique, et on désigne ce type de rejet par SI : self incompatibility (rejet du
soi).
La compatibilité résulte de la perte de fonctionnalité des gènes d’incompatibilité (Self Incompatibility : SI) au cours du temps, comme c’est le cas pour A. thaliana. C’est l’un des plus grands tournants de l’évolution dans l’histoire des plantes à fleurs (Darwin, 1876; Tsuchimatsu et al., 2010). Les incompatibilités sporophytique et gamétophytique reposent sur deux mécanismes différents.
Les bases moléculaires du rejet sporophytique (SSI) ont été largement étudiées chez les Brassicaceae (de Nettancourt, 2001), qui sont contrôlées par SRK (S-locus Receptor Kinase)et SCR/SP11 (S-locus Cystein Rich/S-locus Protein11), qui sont respectivement des déterminants femelles et mâles du locus S (Nasrallah and Nasrallah, 1993; Schopfer et al., 1999; Takayama et al., 2000). La SRK (S-locus Receptor Kinase) est un récepteur à activité sérine/thréonine kinase localisé au niveau des papilles stigmatiques. SCR/SP11 (S-locus Cystein-Rich/S-locus Protein11) est une petite protéine riche en cystéines présente sur le manteau pollinique, agissant comme un ligand sur le domaine LRR (Leucine-Rich Repeat) extracellulaire du récepteur SRK. Ainsi, une cascade de signalisation va induire l’inhibition de la réhydratation du grain de pollen (Ikeda et al., 1997).
Le système de rejet gamétophytique (GSI) est de type S-RNase (S-locus RiboNucléase). Il est commun aux familles des Solanaceae, Rosaceae et Plantaginaceae. Il a été montré chez le coquelicot (Papaver rhoeas) que le pollen non compatible subissait une mort cellulaire programmée (PCD : Programmed cell death) par ce type de système SI (Thomas and Franklin-Tong, 2004)

La réhydratation du grain de pollen

Une fois que le grain de pollen entre en contact avec le stigmate, la reprise de l’activité du grain de pollen dépend de sa réhydratation, qui elle-même dépendant du flux d’eau provenant du stigmate. Dans le cas d’A. thaliana, le stigmate est sec donc une adhésion en premier lieu est nécessaire avant la réhydratation (voir la partie adhésion).
Ce flux d’eau vers l’intérieur de la cellule végétative est facilité par des aquaporines dont la découverte date de 25 ans (Agre et al., 1993). Ces transporteurs appartiennent à la famille des canaux membranaires. Le génome d’A. thaliana contient 38 séquences codant pour des aquaporines (Quigley et al., 2002). Elles sont présentes à la fois dans le plasmalemme et dans le tonoplaste (Losch, 1999). Les aquaporines chez les plantes sont classées en quatre sous-familles importantes: PIPs (plasma membrane-intrinsic proteins), TIPs (tonoplast-intrinsic proteins), NIPs (nodulin 26-like-intrinsic proteins) et SIPs (small basic membrane-intrinsic proteins) (Quigley et al., 2002).
Certaines isoformes des TIPs et des PIPs transportent aussi du glycérol, de l’urée, de l’acide silicique, de l’acide borique ; mais aussi du H2O2 ou des gaz tels que l’ammoniac ou le CO2 (Forrest and Bhave, 2008; Soto et al., 2008; Maurel et al., 2008; Jang et al., 2012; Pérez Di Giorgio et al., 2016b). Soto et al. (2008) ont émis l’hypothèse que les aquaporines pourraient jouer un rôle important durant la réhydratation des grains de pollen sur le stigmate.
Deux gènes TIPs nommés AtTip1.3 et AtTip5.1, sont fortement et spécifiquement exprimés dans le pollen mature d’A. thaliana (ils font partie des 10% des gènes les plus exprimés). Ces données confirment celles obtenues par Bock et al. (2006) qui ont analysé l’expression des gènes du gamétophyte mâle à différents stades de développement. AtTIP1.3 et AtTIP5.1 sont également colocalisées dans le tonoplaste de la cellule végétative (Wudick et al., 2014).
Sommer et al. (2008) ont effectué une expression transitoire de quatre gènes PIPs d’A. thaliana dans le pollen du lys. Contrairement à PIP1, PIP2 induit une augmentation de l’apport d’eau à l’intérieur du pollen. PIP2 jouerait également un rôle dans la déshydratation des anthères avant la déhiscence chez le tabac (Bots et al., 2005; Firon et al., 2012). Les PIPs pourraient également être présentes dans les parties femelles (Marin-Olivier et al., 2000; Dixit et al., 2001).
Plus récemment, deux autres aquaporines de la sous-famille des NIPs: NIP4.1 et NIP4.2 ont été caractérisées. Pérez Di Giorgio et al. (2016a) ont montré que NIP4.1 est exprimé dans le grain de pollen mature, alors que NIP4.2 est spécifiquement exprimé dans le tube pollinique.

Le tube pollinique

Lorsque le grain de pollen reprend son activité métabolique, un tube pollinique va émerger au niveau d’une des apertures. Sa fonction est d’acheminer, en pénétrant et en traversant les papilles stigmatiques et le tissu de transmission, les gamètes mâles aux ovules pour aboutir à la double fécondation.
Le tube pollinique est une cellule à croissance polarisée uniquement au niveau de la zone apicale et par expansion de la cellule végétative. Il fait partie des cellules eucaryotes dont la croissance est parmi les plus rapides (de 58 à 400 nm/sec selon les espèces) (Cheung and Wu, 2008).
La longueur du tube pollinique peut atteindre jusqu’à une dizaine de centimètres pour les plantes à style long comme le lys. Ce type de croissance est employé dans tout le règne végétal, mais il est typique de quelques types cellulaires, tels que chez les mousses, comme Physcomitrella patens (Decker et al., 2006), ou chez les plantes supérieures : les poils absorbants (situés au niveau de la zone pilifère des racines) (Schiefelbein et al., 1992; Grierson et al., 2014) ou le tube pollinique (Rounds and Bezanilla, 2013).
Le tube pollinique possède une forme cylindrique avec plus ou moins le même diamètre observé tout au long du tube en culture in vitro, et est sub-divisé en plusieurs régions en partant de l’apex (Fig. 9A) : la zone apicale, la zone sub-apicale et la partie cylindrique.
La zone apicale apparait claire, car elle ne contient pas d’organites, mais observée au microscope électronique à transmission, elle est riche en vésicules de sécrétion golgiennes (Fig. 9B). Cette zone permet l’entrée de l’eau et du calcium dans la cellule, ce qui est vital pour la croissance du tube pollinique (Hepler and Winship, 2015).
En raison de sa dynamique complexe, le tube pollinique met en place des régulations très fines de son métabolisme. La croissance se fait par oscillations, qui sont des poussées cytoplasmiques précédées par une fluctuation du gradient de calcium dans la zone apicale. En effet, plusieurs phases régulières de croissance rapide, puis lente, ont été identifiées et associées à une réorganisation de la structure et du métabolisme à l’intérieur du tube pollinique (Jaffe et al., 1975; Holdaway-Clarke et al., 1997; Messerli et al., 2000). Le calcium intra-cellulaire libéré est un important messager secondaire dans la régulation de la croissance et de l’orientation du tube pollinique (Steinhorst and Kudla, 2013).
Le calcium est également impliqué dans des évènements antérieurs à l’élongation du tube pollinique, notamment lors de la germination et de l’initiation. Iwano et al. (2004) ont montré via l’utilisation de YC3.1 (Yellow cameleon 3.1, un senseur fluorescent du calcium), que lors de la pollinisation, les grains de pollen peuvent induire une augmentation locale du calcium dans les cellules des papilles stigmatiques et un gradient de calcium est formé dans le grain de pollen. Ce gradient formé au niveau du grain proviendrait des papilles stigmatiques (Miyawaki et al., 1997). L’application d’inhibiteurs de transporteurs ou de chélateurs de calcium inhibent la croissance du tube pollinique, indiquant l’importance de la régulation de la concentration cytosolique du calcium pour l’élongation du tube pollinique (Picton and Steer, 1983;
Obermeyer and Weisenseel, 1991; Pierson et al., 1994; Guan et al., 2013). In vivo, les tubes polliniques utilisent les réserves de calcium externe du pistil, et l’apport externe de calcium augmente l’élongation des tubes polliniques in vitro (Brewbaker and Kwack, 1963; Franklin- Tong, 1999).
L’influx du calcium à l’intérieur de la cellule serait facilité par la présence de canaux glutamate receptor-like (GLR) (Michard et al., 2011). Trente GLR ont été identifiés chez A. thaliana, dont six seulement sont exprimés dans le pollen (Pina et al., 2005; Roy et al., 2008). Ces canaux joueraient également un rôle pour moduler le gradient apical du calcium, ce qui affecterait la croissance du tube pollinique. Cette modulation se fait par le biais d’un acide aminé externe provenant du pistil la D-sérine (Michard et al., 2011). Suwińska et al. (2015, 2017) ont montré que chez Petunia hybrida le silencing post-transcriptionnel de l’expression du gène de la calreticulin, une protéine multifonctionnelle de stockage du calcium dans le réticulum endoplasmique, affectait la croissance du tube pollinique, l’organisation du cytosquelette et le gradient de calcium.
En plus du gradient de calcium intracellulaire, un gradient de pH a été mis en évidence dans le tube pollinique. A l’extrémité de l’apex, une zone acide est observée, alors que dans la zone claire il y a une bande alcaline (Feijó et al., 1999). Le gradient de pH est maintenu par la pompe H+ ATPase qui permet l’entrée des protons de l’extrémité de l’apex des tubes polliniques, et la sortie des protons un peu plus en arrière (Obermeyer et al., 1992). Le pH a déjà démontré son rôle dans la régulation du métabolisme, notamment l’activité enzymatique (Guern et al., 1991) , la modulation de la phosphorylation (Blowers and Trewavas, 1989), la structure et l’activité du cytosquelette (Yonezawa et al., 1985; Suprenant, 1991; Andersland and Parthasarathy, 1993; Edmonds et al., 1995), l’endocytose et l’exocytose (Gluck et al., 1982; Cosson et al., 1989) et la synthèse des protéines et la division cellulaire (Dube et al., 1991; Grandin et al., 1991).
Outre le calcium et le pH, l’importance des formes actives de l’oxygène (FAO) dans la croissance polarisée des tubes polliniques a été montrée. Les FAO ou ROS (reactive oxygen species), en dépit de leurs toxicités, jouent un rôle de second messager et sont localisées à l’apex des tubes polliniques (Potocký et al., 2007). Les FAO jouent un rôle lors de la germination, elles sont détectées très tôt pendant l’hydratation du pollen et durant sa germination chez le kiwi (Speranza et al., 2011). Les FAO jouent également un rôle lors de la croissance polarisée (Potocký et al., 2007) et de l’élongation (Lassig et al., 2014). En effet, la production de FAO est entre autre associée aux RBOH (respiratory burst oxydase homologs) localisées au niveau de la membrane plasmique, et appartenant à la famille des NADP(H) oxydases (NOX) spécifiques au tube pollinique. L’importance des NOX dans la production de l’anion superoxyde (O2.-) a été mise en évidence par l’utilisation d’un inhibiteur de NOX: le DPI (diphenylene iodonium chloride). Les tubes polliniques de tabac traités avec le DPI ne produisent pas d’O2.- et leurs croissances sont réduites, la structure de la zone apicale est déstabilisée et les tubes éventuellement éclatent. L’apport exogène de H2O2 permet de restaurer la croissance (Potocký et al., 2007). Plus précisément, RbohH et RbohJ semblent être essentielles pour la croissance du tube pollinique et lors de la fécondation. Ces deux protéines présentent un motif en N-terminal cytosolique dit calcium-binding EF-hand suggérant un lien fonctionnel entre le calcium et les FAO. Ce lien a été initialement prouvé par l’application de calcium sur les tubes polliniques de tabac qui déclencherait une augmentation de la production de FAO (Potocký et al., 2007; Boisson-Dernier et al., 2013; Lassig et al., 2014; Wudick and Feijó, 2014; Kaya et al., 2015).
Durant sa croissance, la cellule végétative, contenant la MGU (Unité Germinative Mâle), se déplace au fur et à mesure que le tube pollinique croît. Ce déplacement se fait grâce à des dépôts réguliers de bouchons de callose permettant à la cellule végétative de conserver un volume plus ou moins constant (Lord, 2000; Cai et al., 2011). La MGU est une unité stable entre le noyau végétatif et les deux gamètes spermatiques (Dumas et al., 1984 ; Mogensen, 1992).
Le tube pollinique possède un mouvement cytoplasmique en « fontaine inversée », maintenu principalement par le cytosquelette (Cheung and Wu, 2008) (Fig. 10). Les principaux composants du cytosquelette sont les microtubules et les filaments d’actine. Les microtubules permettent principalement le transport de la MGU en tant qu’unité, alors que les filaments d’actine sont impliqués dans le transport des organites et des vésicules, et dans la croissance du tube pollinique. Des mécanismes d’exocytose sont impliqués dans le transport massif de vésicules chargées de composés membranaires et pariétaux (Geitmann, 1999; Zonia and Munnik, 2008) et ces apports réguliers permettent de maintenir la croissance polarisée.
Le cytosquelette chez les eucaryotes joue un rôle central dans la régulation de la morphologie cellulaire et de la croissance (Valster et al., 1997). L’étude de l’actine dans le tube pollinique a été faite en premier par le biais de l’utilisation d’anticorps anti-actine ou par des colorations cytochimiques à la phalloïdine (Rutten and Derksen, 1990). L’observation de l’actine au niveau de l’apex était fastidieuse à cause de la fixation (Miller et al., 1996; Derksen et al., 1995). L’observation de la dynamique de l’actine est devenue possible grâce à l’utilisation de tubes polliniques transformés par Lifeact-‐G‑P, ce qui a permis de confirmer l’implication de la distribution spatiale de l’actine dans la croissance polarisée du tube pollinique (Fu et al., 2001; Qu et al., 2013).
Trois formes de structures d’actine sont observées dans les tubes polliniques : de longs filaments d’actine sont observés tout au long du tube, des filaments plus courts et moins organisés sont ensuite observés dans la zone sub-apicale, puis des filaments d’actine très courts et très dynamiques sont disposés au niveau de la zone apicale pour former une structure nommée actin fringe (Gibbon et al., 1999; Fu et al., 2001; Hepler et al., 2001; Vidali and Hepler, 2001; Wang et al., 2008; Staiger et al., 2009). Rounds et al. (2014) ont suggéré que l’actin fringe contribuerait à la sécrétion ciblée des vésicules dans la paroi à des sites de fusion à l’apex du tube pollinique, et contribuerait ainsi à la croissance polarisée du tube pollinique. La dynamique de l’actine dans le pollen est régulée par plusieurs ABPs (actin-binding protein) dont l’AD‑ (actin-depolymerising factor), la profilin, et la superfamille des protéines villin/gelsolin/fragmin. Ces ABPs vont se fixer aux monomères et/ou aux filaments d’actine pour promouvoir la polymérisation en filaments, ou la dépolymérisation sous forme d’actine monomérique. Elles sont également régulées par le calcium et le pH (Ren and Xiang, 2007; Wang et al., 2008; Qu et al., 2013).
Au centre de tous les mécanismes de régulations de la croissance polarisée du tube pollinique, la protéine ROP1, de la sous-famille de Rho GTPase, est localisée dans la membrane plasmique à l’apex du tube pollinique. ‐lles sont impliquées dans plusieurs processus lors de la croissance des plantes, le développement et les réponses à l’environnement (Yang, 2008). Un groupe de protéines les RICs (Rop-interactive CRIB motif-containing proteins) interagissent spécifiquement avec ROP1 dans le tube pollinique, en se liant aux ROPs par un motif CRIB (Cdc42/Rac-interactive binding). Chez A. thaliana, 11 gènes codent des protéines RICs. Les
RICs sont classées en 5 groupes présentant très peu d’homologie de séquence en dehors du domaine CRIB conservé. Chaque protéine RIC interagit avec ROP différemment, et a des fonctions différentes dans le tube pollinique (Wu et al., 2001; Gu et al., 2005). Ainsi, dans le tube pollinique, ROP1 induit la dépolymérisation de l’actine et l’accumulation du calcium par deux facteurs an aval : RIC4 et RIC3 dans l’ordre. Ces deux facteurs peuvent s’équilibrer afin de permettre une exocytose et une croissance rapide du tube pollinique (Gu et al., 2005; Lee et al., 2008).

Etude in vitro des tubes polliniques

L’étude du développement du gamétophyte mâle, la réhydratation du grain de pollen et la germination, la croissance et le développement du tube pollinique sont de haute importance pour l’étude fondamentale de la reproduction sexuée chez les végétaux supérieurs (Boavida and McCormick, 2007). Le tube pollinique est également considéré comme l’un des meilleurs modèles pour l’étude des mécanismes cellulaires impliqués dans la croissance polarisée, et plus particulièrement pour l’étude des mécanismes impliqués dans la biosynthèse et le remodelage de la paroi.
La mise au point de milieux de culture adéquats a permis de réaliser de nombreuses études in vitro qui ont permis des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la croissance polarisée des tubes polliniques. Les premiers milieux de germination contenaient du saccharose (Van Tieghem, 1872). Au fil du temps, les milieux ont été optimisés via l’identification de sels importants pour la croissance des tubes polliniques tels que le calcium et le bore (Brewbaker and Kwack, 1963). Alors que la culture de pollen bicellulaire, tel que le lys ou le tabac, est assez simple avec des taux de germination observés assez importants, chez A. thaliana (pollen tricellulaire), la culture était beaucoup plus fastidieuse. Mais grâce à la mise au point d’un milieu adéquat et des conditions de culture optimales (Boavida and McCormick, 2007), les taux de germination obtenus atteignent 80%.
Néanmoins, malgré l’optimisation des milieux de germination et des conditions de culture, la croissance des tubes polliniques in vitro reste très inférieure à celle observée in vivo, ce qui suggère un rôle capital du tissu femelle dans la croissance des tubes polliniques.

Les interactions avec le tissu de transmission femelle

La croissance du tube pollinique dans le pistil est entretenue par des échanges de signaux entre le tissu femelle et le tube pollinique afin de permettre une double fécondation correcte. Chez le lys, possédant un style creux, lors de la croissance du tube pollinique sur le stigmate, le guidage des tubes polliniques à ce stade est influencé par une chemocyanine, une petite protéine appartenant à la famille des plantacyanines. Des essais in vitro ont montré que la chemocyanine a une activité chemotropique sur les tubes polliniques (Kim et al., 2004). Une surexpression de la plantacyanine chez Arabidopsis induit l’enroulement des tubes polliniques sur les papilles stigmatiques, qui restent sur le stigmate sans que les tubes polliniques ne pénètrent le tissu de transmission. Cette surexpression induit une augmentation de la concentration de la plantacyanine sur le stigmate, ce qui perturbe le guidage des tubes polliniques (Dong et al., 2005).
Dans le cas du stigmate sec et d’un style plein (comme chez A. thaliana), le tube pollinique a besoin de s’introduire entre les cellules du tissu femelle pour y croitre de façon intrusive. Ce n’est pas le cas pour les stigmates creux, où le tube pollinique va croitre et se diriger vers le centre du stigmate. Les tubes polliniques vont ensuite entrer dans le style et croitre en adhérant aux cellules épidermiques qui tapissent l’intérieur du style et qui constituent le tissu de transmission. Le tissu de transmission possède plusieurs rôles importants : le guidage, la nutrition, la défense, l’adhésion, mais aussi un rôle actif pour l’élongation des tubes polliniques (Sanders and Lord, 1989; Lord and Russell, 2002; Mollet et al., 2007).
Les tubes polliniques progressent dans les espaces intercellulaires du stigmate et du tissu de transmission. Quelques mécanismes ont été mis en évidence pour faciliter ce passage, parmi lesquels la force de turgescence. En effet, le mutant tod1 (TurgOr regulation Defect 1) est partiellement stérile car beaucoup de tubes polliniques n’arrivent pas à pénétrer dans le pistil (Chen et al., 2015).
De même, les tubes polliniques vont percevoir des signaux de guidage, parmi lesquels les arabinogalactanes protéines (AGPs), dont le degré de glycosylation augmente avec la progression du tube pollinique dans le style vers les ovules, comme chez le tabac (Cheung et al., 1995). Il a aussi été montré que le GABA (acide gamma aminobutyrique) était impliqué dans le guidage des tubes polliniques. En effet, GABA stimule la croissance des tubes polliniques, mais l’inhibe à de fortes concentrations. Une augmentation de la concentration du GABA est observée, et correspond à la direction de la croissance des tubes polliniques avec une plus forte concentration dans la région du micropyle. La concentration en GABA est contrôlée par POP2 (POLLEN PISTIL INTERACTION2) chez A. thaliana. POP2 est une transaminase impliquée dans la dégradation du GABA. Lors du knock-out du gène POP2, un arrêt de la croissance des tubes polliniques est observé dans le tissus de transmission dû à une forte accumulation de GABA (Palanivelu et al., 2003; Renault et al., 2011).
Lorsque le tube pollinique quitte le tissu de transmission pour atteindre l’ovule, il adhère au funicule, structure permettant d’attacher l’ovule et le tégument du sac embryonnaire, pour se diriger vers le micropyle. Les signaux de guidage au niveau du funicule peuvent provenir du funicule lui-même, comme il a été montré sur un ovule seul en culture semi in vivo. Les ovules dépourvus de funicule attirent les tubes polliniques, mais à de plus faibles fréquences (Palanivelu and Preuss, 2000). Le premier article, par Guan et al. (2014), a parlé de guidage funiculaire via des mutants mpk3/mpk6 (Mitogen-activated protein kinases) qui ne peuvent pas percevoir les signaux funiculaires, mais peuvent percevoir les signaux micropylaires.
Une fois que le tube pollinique quitte le funicule, il est attiré par le micropyle via une autre batterie de signaux. Cette étape est la plus étudiée via l’identification de nouveaux chémoattractants du micropyle chez le maïs, Torenia et Arabidopsis. Arabidopsis utilise un chémoattractant, nommé LURE, qui est un peptide riche en cystéine (CRP) (Okuda et al., 2009) de la sous famille des DEFL (DEFENSIN-LIKE) (Silverstein et al., 2007). Les tubes polliniques qui n’ont pas été rendus compétents par leurs passages par le stigmate et le pistil, ne peuvent pas percevoir l’attractant ovulaire LUR‐ (Higashiyama et al., 1998; Okuda and Higashiyama, 2010; Palanivelu and Tsukamoto, 2012; Leydon et al., 2014). PRK6 (POLLEN-SPECIFIC RECEPTOR-LIKE KINASE6) est un récepteur membranaire de LUR‐ localisé à l’apex du tube pollinique. Il est essentiel pour la perception de LURE et interagirait avec ROPGEFs (Rho of plant guanine nucleotide-exchange factors) qui est important pour la croissance du tube pollinique via le contrôle de l’activité du signal de ROP1 (Okuda et al., 2009; Takeuchi and Higashiyama, 2016). Chez Torenia, AMOR, un polysaccharide de type arabinogalactane, avec des acides glucuroniques méthylés, est présent dans le style aurait un rôle pour rendre les tubes polliniques compétents à percevoir les signaux émis par l’ovule (Mizukami et al., 2016). La structure minimale pour avoir une activité serait un disaccharide composé d’un acide glucuronique 4-O-méthylé et d’un galactose lié en β-(1→6) (4 Me-GlcA-β-(1→6)-Gal).
La fécondation
L’une des deux gamètes mâles va féconder l’oosphère formant le zygote, et l’autre le noyau central permettant la formation de l’albumen (Palanivelu and Preuss, 2006; Stewman et al., 2010). Ce phénomène est plus précisément nommé « double fécondation ». La double fécondation chez les Angiospermes a été découverte par Guignard (1899) et Nawaschin (1898) chez les Liliacées.
Le tube pollinique pénètre dans l’ovule par le micropyle, entre dans le sac embryonnaire en se développant dans une des deux synergides. La croissance du tube s’arrête et le tube pollinique explose, libérant ainsi rapidement son contenu (Fig. 11), incluant les deux cellules spermatiques, dans le cytoplasme de la synergide qui dégénère (Yadegari, 2004).
L’explosion du tube pollinique lors de son contact avec l’une des synergides est contrôlée par le gène FERONIA (FER) codant pour un récepteur de la famille des RLK(RECEPTOR-LIKE KINASE) localisé au niveau de l’appareil filiforme des synergides (Escobar-Restrepo et al., 2007). FER contrôlerait également NORTIA (NTA), un autre récepteur (Kessler et al., 2010). Les mutants fer et nta donnent des tubes polliniques qui pénètrent dans les synergides, mais qui n’explosent pas. FER contrôlerait la surproduction de FAO à l’entrée du gamétophyte femelle et induirait la rupture du tube pollinique pour la libération des cellules spermatiques (Duan et al., 2014).
LORELEI (LRE), qui coderait une protéine possédant une ancre GPI (glycosylphosphatidylinositol) et un motif M8CM (modified eight-cysteine motif), serait aussi impliquée dans la réception du tube pollinique par le gamétophyte femelle. Elle fonctionnerait avec NTA et FER pour la réception des tubes polliniques (Liu, 2016; Tsukamoto et al., 2010).
FER a deux homologues dans le tube pollinique, également de la famille de RLK : ANXUR1 et ANXUR2. L’étude in vitro des tubes polliniques du double mutant anxur1anxur2, montre qu’ils explosent à l’apex juste après la germination. ANXUR jouerait donc un rôle dans le maintien de l’intégrité du tube pollinique (Boisson-Dernier et al., 2009).
Plus récemment, plusieurs autres protéines ont été découvertes, TUAN (TUN) et EVAN (EVN). Ces deux protéines seraient impliquées dans la N-glycosylation des protéines dans le réticulum endoplasmique et joueraient un rôle dans la perception du tube pollinique par l’intermédiaire de ‑‐R. Comme fer, la mutation dans ces gènes conduit à la croissance du tube pollinique à l’intérieur des synergides, sans rupture. Ces deux gènes jouent donc des rôles importants mais distincts. EVN joue un rôle essentiel pour le développement du pollen, TUN est importante pour la croissance et l’intégrité du tube pollinique en affectant la stabilité d’ANXUR (Lindner et al., 2015). En effet, chez le mutant tun, ANXUR1 est dégradée par une voie de dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD, Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation). Ces résultats indiquent que la N-glycosylation des protéines est importante pour les interactions entre les gamétophytes mâles et femelles comme chez les animaux.
Un autre acteur dans la signalisation de la perception du tube pollinique par les synergides a été identifié. Il s’agit de MARIS (MRI), un RLCK (RECEPTOR-LIKE CYTOPLASMIC KINASE). MRI est exprimé préférentiellement dans le tube pollinique et également dans les poils absorbants des racines. La perturbation de l’expression de ce gène induit une explosion spontanée des tubes polliniques. Ces travaux suggèrent donc que MRI contrôle l’intégrité de la paroi en aval d’ANXUR1/2 (Boisson-Dernier et al., 2015).
Un groupe de petite protéine femelle-spécifique ENs (early nodulin-like proteins) serait également requis pour la réception des tubes polliniques. Elles possèderaient un domaine PCNL (plastocyanin-like domain), une ancre GPI (glycosylphosphatidylinositol) et une partie glycanique contenant des arabinogalactanes. EN14 interagit fortement et spécifiquement avec le domaine extracellulaire de FER. La surexpression d’EN15 perturbe le guidage des tubes polliniques vers l’ovule et la fécondation, suggérant un rôle central des ENs dans la communication mâle-femelle et dans la fécondation (Hou et al., 2016).
Après la libération des cellules spermatiques dans les synergides, elles vont fusionner avec l’oosphère et le noyau de la cellule centrale (Russell, 1992). A ce stade, il n’y a plus de tubes polliniques attirés par les synergides afin d’éviter la polyspermie (Beale et al., 2012), sauf dans le cas d’un échec de la fécondation. Dans ce cas, le gamétophyte femelle peut alors encore attirer d’autres tubes polliniques pour qu’il y ait fécondation. Ceci est possible grâce au maintien d’une synergide persistante et fonctionnelle pour l’attraction des tubes polliniques
(Kasahara et al., 2012). En cas de fécondation réussie, le gamétophyte femelle fécondé induit une cascade de signalisation indépendante qui vise à éliminer la synergide persistante en orientant cette cascade de signalisation par la production d’éthylène (Beale et al., 2012; Kasahara et al., 2012; Maruyama et al., 2013; Völz et al., 2013). Plus récemment, un mutant jagger ou agp4 a été étudié. JAGGER serait impliquée dans la synthèse de l’arabinogalactane protéine 4. Chez ce mutant, même en cas de fertilisation réussie, les synergides persistent, ne dégénèrent pas après la double fécondation et continuent d’attirer d’autres tubes polliniques. JAGG‐R jouerait donc le rôle d’un intermédiaire dans la dégénération de la synergide (Pereira et al., 2016a, 2016b).
Prado et al. (2004) ont montré que l’oxyde nitrique (NO) agissait comme un chimiotrope négatif lors du guidage des tubes polliniques aux ovules. Le NO joue, par ailleurs, un rôle crucial durant différents stades de croissance de la plante en agissant comme un messager (Domingos et al., 2015). Chez le mutant Atnos1, une nitric oxyde synthase potentielle, la fertilité est réduite (Guo et al., 2003; Prado et al., 2008).

La paroi du tube pollinique

La paroi cellulaire végétale, également appelée matrice extracellulaire, est un élément de structure cellulaire qui entoure chaque cellule végétale. Durant la croissance de la cellule, une première paroi, dite paroi primaire, est synthétisée autour de la cellule, elle est prédominante chez les cellules jeunes. Au niveau des tissus, elle permet de compartimenter les cellules par le biais de la lamelle moyenne. La paroi est synthétisée en premier lors de la division mitotique. La paroi se caractérise par une composition hétérogène d’enchevêtrements de polysaccharides et de protéines qui confèrent à chaque tissu ou cellule différentes propriétés mécaniques spécifiques, définies par une balance entre l’élasticité permettant l’élongation cellulaire et la rigidité permettant de résister à la pression de turgescence (Ray et al., 1972).
Elle confère également des propriétés physiologiques à la cellule permettant la transduction des signaux (Roberts, 2001), la défense des plantes en réponse à une attaque par des pathogène (Silipo et al., 2010), une adaptation aux stress abiotiques, l’adhésion cellulaire (Durand et al., 2009) ou la communication avec les cellules voisines (Brownlee, 2002). Après la fin de l’élongation cellulaire et de la différentiation, une paroi dite secondaire pourra se déposer à l’intérieur de la cellule dans certains tissus afin de consolider la paroi primaire.
La compréhension des mécanismes de synthèse et de la fonction des polymères de la paroi est devenue possible grâce à des approches de biochimie et de génomique fonctionnelle. La paroi du tube pollinique, en dépit du fait que ce soit une cellule extrêmement spécialisée, représente un excellent modèle pour l’étude de la synthèse et du remodelage de la paroi. Le tube pollinique a l’avantage d’être une cellule unique à croissance rapide et cultivable in vitro. La mise en place de la paroi et sa synthèse représentent pour la plante un coût énergétique élevé. ‐nviron 10% des gènes d’A. thaliana sont impliqués dans son métabolisme (McCann and Carpita, 2008). Mais, selon des données transcriptomiques, la proportion de gènes exprimés dans la plante et le grain de pollen est variable. Le pollen utilise 3% de ses gènes dans le métabolisme de la paroi, ce qui est équivalent à la proportion de gènes exprimée au niveau de la plante (Becker and Feijó, 2007). En effet, A. thaliana possède 800 gènes impliqués dans la synthèse de la paroi et un tiers de ses gènes est exprimé et/ou spécifique au pollen (Pina et al., 2005).

Les différents polysaccharides de la paroi

On distingue 3 catégories de polymères en fonction de leurs extractabilités et de leurs compositions en monosaccharides: la cellulose, les hémicelluloses et les pectines. Ces 3 catégories interagissent entres elles. Les polymères d’hémicellulose s’associent aux filaments de cellulose via des liaisons non covalentes (hydrogène) formant un réseau cellulose-hémicellulose, et conférant une certaine résistance mécanique. Un second réseau va venir s’ajouter à celui-ci, la matrice pectique, qui participe également à la dynamique de la paroi (Fig. 12). Ces polysaccharides sont synthétisés par le biais d’enzymes comme les synthases et les glycosyltransférases (GT) (Coutinho and Henrissat, 1999; http:// afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).
La composition de la paroi est définie par l’âge et/ou la fonction de la cellule, l’espèce et le cycle de vie. Le tube pollinique possède une organisation de paroi spécifique (Fig. 13). In vivo et in vitro, les tubes polliniques sont composés de deux parois en arrière de l’apex, tandis qu’à l’apex, site de dépôt des composés pariétaux, une seule paroi est présente (Li et al., 1995; Ferguson et al., 1998 ; Hesagawa et al., 1998). La paroi interne est riche β-glucanes (callose et cellulose) et la paroi externe est composée de cellulose, d’hémicellulose (plus précisément de xyloglucane) et de pectines. Au niveau apical, la paroi est riche en glycoprotéines (plus précisément en AGPs), en pectines (qui sont fortement méthylestérifiées), en xyloglucane et contient peu de cellulose (Mollet et al., 2002; Dardelle et al., 2010).

Les β-glucanes

La cellulose
Le polymère le plus abondant sur terre, elle représente 15 à 20% de la masse sèche de la paroi primaire. Elle est utilisée en industrie pour la fabrication du papier, d’isolation phonique et thermique dans les habitations, mais aussi comme additif alimentaire (E460 et E466). La cellulose est sous forme de microfibrilles (Fig. 14) composées de 36 chaines de D-glucose liés en β-(1,4). Ces chaines sont des répétitions de motif de cellobiose, un disaccharide formé de 2 D-glucoses inversés (Haworth, 1932).
Le degré de polymérisation (DP) de ces chaines n’excède pas 8000 dans la paroi primaire (Brett, 2000). Les 36 chaînes de glucanes co-cristallisent en se liant entre elles par des liaisons faibles (Van Der Waals et hydrogène) (Harris et al., 2010). La synthèse de la cellulose se fait au niveau de la membrane plasmique via les complexes cellulose synthases composés de 36 sous-unités protéiques, chacune synthétisant une chaîne glucanique (Somerville, 2006). Elles sont regroupées en rosette chez les plantes supérieures (Cosgrove, 2005; Mueller and Brown, 1980).
Deux familles multigéniques joueraient un rôle dans la synthèse de la cellulose, CESA (CELLULOSE SYNTHASE A) dont 10 membres ont été identifiés dans le génome d’A. thaliana, ainsi que 6 membres de CSLD (CELLULOSE SYNTHASE LIKE-D) chez A. thaliana (Richmond, 2000; Richmond and Somerville, 2000; Doblin et al., 2002).
La cellulose joue un rôle dans la détermination de la forme et de la taille de la cellule, et dans le contrôle du volume cellulaire (Bessueille and Bulone, 2008) via le maintien de la turgescence en assurant une résistance à la pression osmotique. Les microfibrilles de cellulose jouent également un rôle dans le contrôle de la direction de la croissance, en effet l’orientation des microfibrilles dans la paroi à la surface de l’épiderme contrôle la direction de la croissance de l’organe (Kutschera, 2008).
Chez le lys, A. thaliana et Solanum chacoense, les microfibrilles de cellulose sont orientées de façon longitudinale par rapport à la direction de croissance des tubes polliniques (Aouar et al., 2010; Lehner et al., 2010; Chebli et al., 2012; Hepler and Winship, 2015). La paroi des tubes polliniques contient très peu de cellulose par rapport aux cellules végétatives. Pourtant, sa présence est importante pour la croissance et le maintien du tube pollinique (Geitmann, 2010). En effet, la cellulose est présente tout le long de la paroi du tube pollinique permettant de stabiliser l’apex, particulièrement dans la zone de transition, entre la partie apicale et la partie cylindrique. Chez Torenia fournieri, la distribution de la cellulose change de façon spacio-temporelle. Elle est abondante dans les tubes polliniques qui viennent de germer et absente de l’apex des tubes polliniques plus vieux (Wu et al., 2008). Chez N. tabacum, CESA et CSLD sont détectées sur toute la longueur du tube pollinique avec une concentration plus élevée à l’apex (Cai et al., 2011).
Un membre de la famille des CELLULOSE SYNTHASE-LIKE D1, identifié chez Nicotiana alata, la NaCSLD1, est exprimée uniquement dans les anthères et dans les tubes polliniques in vitro (Doblin et al., 2001). Les mutants cesa1 et cesa3 sont des mutants létaux. Une proportion non négligeable des tubes polliniques de ces mutants hétérozygotes (50%) est fortement déformée ou ne produit pas de tubes polliniques (Persson et al., 2007). Chez les mutants csld1 et clsd4, les tubes polliniques ont un apex instable et finissent par exploser. In vivo, ces mutants sont stériles en raison de leurs tailles anormalement réduites, et à la désorganisation de la structure de la paroi des tubes polliniques (Wang et al., 2011).
Les mêmes phénotypes sont observés lors du traitement des tubes polliniques avec une cellulase ou un inhibiteur de la synthèse de la cellulose, tel que le dichlorobenzonitrile (DCB) (Anderson et al., 2002; Aouar et al., 2010; Hao et al., 2013).

Table des matières

R‐M‐RCI‐M‐NTS
LIST‐ D‐S ‑IGUR
LIST‐ D‐S TABL‐AUX
LIST‐ D‐S ABR‐VIATIONS
AVANT-PROPOS
INTRODUCTION
I – La reproduction
1-1 L’anatomie de la fleur
1-1-1- Le stigmate
1-1-2- Le style
1-1-3- L’ovaire
1-2- Le gamétophyte mâle
1-2-1- La formation du grain de pollen
1-2-2- La pollinisation
1-2-3- La réhydratation du grain de pollen
1-2-4- Le tube pollinique
1-2-5- Etude in vitro des tubes polliniques
1-3- Les interactions avec le tissu de transmission femelle
II- La paroi du tube pollinique
2-1- Les différents polysaccharides de la paroi
2-1-1- Lesβ-glucanes
2-1-2- Les hémicelluloses
2-1-3- Les pectines
2-2-Les glycoprotéines de la paroi
2-2-1- Les arabinogalactanes protéines (AGPs)
2-2-2- Les extensines
2-3- Le remodelage de la paroi du tube pollinique
2-3-1- Xyloglucane-endo-transglucosidases/hydrolases
2-3-2- Pectines méthylestérases et leurs inhibiteurs/ pectines acétylestérases
2-3-3- Glycane hydrolase
III- L’adhésion cellulaire
3-1- Généralités sur l’adhésion
3-2- Adhésion cellulaire et reproduction sexuée
3-2-1- L’adhésion du pollen au stigmate
3-2-2- L’adhésion du tube pollinique à la matrice extracellulaire du style
IV- La génétique chimique
4-1- Le principe
4-2- La méthodologie
4-3- Les avantages et les inconvénients
4-4- Les applications en recherche végétale
OBJECTIF DES TRAVAUX DE THESE
MATERIEL ET METHODES
I Matériel végétal et Tests biologiques
1-1- Culture des plantes
1-2- Récolte des fleurs et culture du pollen
1-3- Le test d’adhésion des tubes polliniques
1-4- La chimiothèque et le traitement des tubes polliniques
II- Méthodes d’imagerie cellulaire
2-1- Coloration cytochimique de la callose à l’aniline bleue décolorée
2-2- Immunomarquages des tubes polliniques
2-3- Observations au microscope confocal inversé des tubes polliniques d’A. thaliana pLAT52::lifeact-mEGFP et CRIB4-GFP.
III – Méthodes préparatives et analytiques de la matrice d’adhésion
3-1- Obtention de la paroi brute
3-2- Extraction de fractions enrichies en pectines
3-2-1- Imidazole-HCl
3-2-2- Oxalate d’ammonium
3-3- Extraction de fractions enrichies en hémicelluloses
3-4- ‐xtraction du mucilage de graines d’A. thaliana
3-5- Traitements enzymatiques des fractions enrichies en pectines
3-6- Chromatographie d’exclusion stérique (S‐C)
3-7- Chromatographie en phase gazeuse (GC-FID)
3-7-1- Préparation des échantillons
3-7-2- Analyse
3-8- Analyse de Polysaccharides par Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
3-9- Détermination du degré de méthylesterification des pectines
3-10- Dot-blot
RESULTATS
Partie 1 (article): Deux nouvelles petites molécules isolées par criblage affectent la germination des grains de pollen et la croissance et le développement des tubes polliniques d’Arabidopsis thaliana .
Partie 2 : ‐tude de l’adhésion in vitro des tubes polliniques d’Arabidopsis thaliana par une approche enzymatique de déconstruction d’une matrice enrichie en polysaccharides.
DISCUSSION
I- Deux nouvelles petites molécules isolées par criblage affectent la croissance et le développement des tubes polliniques d’Arabidopsis thaliana
II- ‐tude de l’adhésion in vitro des tubes polliniques d’Arabidopsis thaliana par une approche enzymatique de déconstruction d’une matrice enrichie en polysaccharides
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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