PCR (Polymerase Chain Reaction) du cytochrome oxydase I (COI)

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Zea mays L.

Le maïs (Zea mays L.) est une haute plante annuelle au système radiculaire fibreux abondant. Elle est largement cultivée pour son grain, utilisé pour l’alimentation humaine et animale.

Origine, position systématique et variétés de Zea mays L.

Le maïs (Zea mays L.) est originaire d’Amérique Centrale notamment au Mexique et fut importé par les explorateurs espagnols et portugais. Il est introduit en Afrique vers le XVIe siècle par ces derniers (ISRA, 2005). Même si la plupart des chercheurs pensent que cette plante tire son origine du téosinte (Euchluenavat mexicana, Schrod), plante annuelle qui serait le plus proche parent du maïs, d’autres au contraire soutiennent qu’il provient d’un maïs sauvage, aujourd’hui disparu (Fao, 1993).
Source : http://www.freakcommander.de/wp-content/uploads/2009/06/mais_under_teosinte.jpg. La position systématique actuelle de Zea mays (L) est : Classe des monocotylédones, Sous-classe des Commelinidaes, Ordre des Cypérales, Famille des Poacées (ou Graminées), Sous-famille des Panicoïdées, Genre Zea et Espèce Zeamais.
Au XIXe siècle un botaniste américain, Sturtevant, établit une classification en groupes, fondée principalement sur les caractéristiques du grain :
Zea mays amylacea ou maïs farineux, Zea mays ceratina (maïs cireux ou waxy), Zea mays everta (Pop-corn ou maïs perlé), Zea mays indentata ou maïs denté, Zea mays indurata (maïs corné, maïs précoce cultivé), Zea mays saccharata (maïs doux, aussi appelé « maïs grain », destiné à l’alimentation humaine) et Zea mays tunicata ou maïs vêtu.

Grain de maïs et ses vertus

L’espèce en question est à pollinisation croisée, où les inflorescences femelles (épis) et mâles (panicules) occupent des endroits distincts sur la plante. Le fruit, un caryopse, se développe sur l’épi, qui peut en porter 300 à 1000 grains (FAO, 1993). Chaque grain est composé d’un germe (embryon + cotylédon), d’un albumen et d’une enveloppe extérieure dure qui empêche l’entrée de champignons et de bactéries, le péricarpe :
 l’embryon (11 % du grain), couramment appelé « germe », situé à la base du grain qui comprend l’embryon proprement dit ou « gemmule » et le scutellum,
 l’albumen (83 %), tissu de réserve (blanc ou jaune), essentiellement composé de grains d’amidon et
 l’enveloppe extérieure (6 %), fine membrane (incolore, rouge ou violette) translucide et fibreuse, issue du péricarpe de l’ovaire (FAO, 1993).
Le maïs reste dans les pays les moins développés, avant tout une culture vivrière et conserve une place dans l’alimentation humaine. Il est devenu pour beaucoup de pays, la base essentielle de l’alimentation animale ainsi qu’une matière première très importante pour l’industrie. Le grain est un aliment très complet constitué essentiellement d’amidon (environ 70 %), des protéines (10%), des matières grasses (environ 5%), des minéraux (calcium, phosphore) et des vitamines (la provitamine A’ ou caroténoïdes, et la vitamine E). Les fibres alimentaires sont le composant chimique en quantité abondante du grain de maïs après les glucides, les protéines et les graisses.

Espèces du genre Sitophilus

Position systématique des espèces du genre Sitophilus

Appartenant à la plus grande famille de Coléoptères (environ 50 000 espèces), le genre Sitophilus compte 3 espèces inféodées aux céréales: le charançon du maïs, Sitophilus zeamais (Motschulsky, 1855) ; celui du riz, S. oryzae (Linnaeus, 1758) et S. granarius (Linnaeus, 1758) pour le blé. La position systématique actuelle de ces charançons inféodés aux céréales.

Charançon du maïs, Sitophilus zeamais

Ecologie de l’insecte

Sitophilus zeamais Motschulsky, vit dans les pays tropicaux et subtropicaux. L’infestation initiale de grains de maïs est observée aussi bien pour les stocks au magasin que les épis avant la récolte (Adedire et Lajide, 2003 in Asawalam et al., 2008). En écartant les bractées des épis au champ, on constatera non seulement la présence de charançons, mais également les perforations irrégulières qu’ils pratiquent dans les grains, lors des prises de nourriture ou lors de la ponte (Ortega, 1988). Cependant, avec une dispersion plus grande, cet insecte prolifère surtout dans le maïs égrainé, et parait plus exigeant pour la température que S. oryzae. On peut le trouver sur le riz ou même le sorgho, si sa céréale préférée n’est pas disponible. Son développement est ralenti considérablement par une baisse de l’humidité relative en dessous de 20-40% (Kouassi, 1991).

Cycle de vie

Le cycle de vie de S. zeamais dure en moyenne 36 jours avec une femelle qui pond environ 200 œufs au cours de sa vie. A l’aide de son rostre, elle creuse un trou dans le grain et y dépose des œufs qu’elle recouvre d’un bouchon muqueux facilement détectable (Philogène et al., 1989). Cet insecte à reproduction sexuée infeste le grain par la ponte d’un ou plusieurs œufs mais une seule larve s’y développe (Delobel et Tran, 1993 ; Philogène et al., 2002 ; Danho, 2003). A la suite d’une période d’incubation de 5 à 6 jours, la larve éclot et se développe à l’intérieur du grain (Sharifi et Mills, 1971; Longstaff, 1981). Elle en profite pour produire une poudre qui rend le maïs impropre à la consommation. Toujours à l’intérieur du grain, elle mue quatre fois, pour donner une nymphe, après 6 à 8 semaines. Les adultes émergent laissant un trou au grain, ainsi, ils sont capables de voler dès leur sortie et peuvent vivre pendant 5 à 8 mois (annexe II).

Charançon du riz, Sitophilus oryzae

Ecologie de l’insecte

Tout comme Sitophilus zeamais, S. oryzae L. se rencontre en association et a sa propre céréale de prédilection (le riz), mais est à mesure de coloniser d’autres types de cultures si cette dernière n’est pas disponible. Il est en train de s’établir dans les régions tempérées en raison surtout de l’importation des matières premières (Anon., 2012). Certains ont la capacité de voler et peuvent donc attaquer les céréales aux champs avant la récolte. Dans de bonnes conditions (28 à 30°C; 70% HR), le cycle complet dure environ un mois (Camara, 2009). S. oryzae se développe bien à une température comprise entre 13°C et 34°C avec une teneur en eau des grains de 14% et une humidité relative avoisinant 45. Il se développe dans les mêmes grains que le charançon du blé; mais, il se rencontre, d’autre part, en Afrique du Nord, dans les légumineuses telles que le pois chiche et le niébé (Duget, 1986 in Kouassi, 1991).

Cycle de vie

Avec un cycle de vie similaire à celui du charançon de maïs, S. oryzae est sexuellement mature le jour même où l’insecte sort du grain. Après accouplement, la femelle pratique à l’aide de son rostre, un trou dans le grain, pour y déposer directement, l’œuf qu’elle recouvre d’une matière gélatineuse qui durcit à l’air (Kouassi, 1991). Apres durcissement, il apparait une petite zone en relief sur la surface du grain, ce qui fournit la seule preuve visible de l’infestation. La durée d’incubation est environ 10 à 15 jours au cours desquels, la larve ronge l’intérieur du grain, se développe et s’y nymphose. Dans les conditions de 28 à 30°C et 70% HR le cycle complet dure 30 jours et l’imago émerge au bout d’une semaine (Camara, 2009).

Pertes infligées par les charançons, Sitophilus zeamais et Sitophilus oryzae

Communément appelé charançon du maïs, Sitophilus zeamais (Motschulsky) est un ravageur primaire largement répandu sur le maïs en Afrique. Etroitement dépendant de la pluviométrie et de la teneur en eau du grain, ce coléoptère peut à lui seul engendrer en 5 mois de stockage 50% de dégâts (Moyal, 1992).
Dans les régions chaudes, le charançon du riz, S. oryzae, est considéré comme l’ennemi le plus redoutable des grains. Des études antérieures ont révélé l’importance des dégâts que causent ces insectes au niveau des stocks. En effet, la larve de ce charançon consommerait 10 mg de grains pendant son développement (incontestablement à l’intérieur du grain) alors que l’adulte consommerait 0,49 mg par jour (Kehe, 1975 ; Fleurat-Lessard, 1984 ; Yadi, 1987 in Kouassi, 1991). Les pertes au cours du stockage nous renseignent qu’autant les épis que le maïs égrené sont sujets aux attaques des ces charançons qui réduisent subséquemment le poids de la denrée en cas de forte infestation. D’après Guèye et al. (2011), en six mois seulement, les taux évalués sont estimés à près de 18 % avec le maïs égrène, 20 % avec la conservation en épis et près de 27 % dans le cas d’un stockage en épis suivi d’un égrenage.

Marqueurs moléculaires

D’après Avise (2006), un marqueur moléculaire est un fragment d’ADN (information génétique) ou sa représentation moléculaire (ARN, protéines). C’est un type de marqueur génétique composé de fragments d’ADN qui servent de repères pour suivre la transmission d’un segment de chromosome d’une génération à l’autre. Les principales variations des marqueurs moléculaires proviennent soit d’un polymorphisme de séquence, soit d’un polymorphisme de nombre d’unités de répétitions (c’est le cas des microsatellites, qui présentent des répétitions en tandem). Il existe différentes sortes de marqueurs :
 les marqueurs nucléaires, comme le 18S, le 28S, l’ITS1, l’ITS2,…
 et les marqueurs mitochondriaux entre autres, le cytochrome b, cytochrome oxydase I (COI), cytochrome oxydase II (COII),…

MATERIEL ET METHODES

Echantillonnage

Les échantillons de Sitophilus zeamais et S. oryzae qui ont fait l’objet de cette étude ont été collectés dans 7 localités du Sénégal, plus précisément: Bambey (région de Diourbel) située à 14°42’ N / 16°27’W ; Mbassis, (14°04’ N / 16°25’ W) zone insulaire ; Keur Ayip ( 13°35’ N / 15°36’ W) ; Karang (13° 35’ N / 16°42’ W) ; Missirah ( 13°31’ N / 13°30’ W) ; Salémata ( 12°37’ N / 12°49’ W) et Diaroumé (12°59’ N / 15°37’ W). L’étude est étendue dans une localité appartenant à la région naturelle de la Moyenne Guinée qui est la plus grande zone maïsicole de la République de la Guinée : Labé (11° 19′ N et 12° 16′ W).
Chaque population correspond à un groupe d’individus provenant d’une même localité. Les populations issues d’une même zone agro-écologique forment un groupe. Chaque échantillon est codé en utilisant la première lettre du nom de genre en majuscule, la première et la dernière lettre du nom de la localité de collection respectivement en majuscule et minuscule, et un numéro d’ordre (exemple SKg1, S = Sitophilus, Kg = Karang ; 1= individu numéro 1).
Ainsi, les individus SSa, SDi, SBa, SMi, SKg, SKe et SMb proviennent du Sénégal et les spécimens SLa, de la République de Guinée. Le ciblage des zones de l’étude a été fait en tenant compte de la position géographique; donc de l’appartenance des localités aux zones agro-écologiques (tableau 1).
Le planning d’échantillonnage a débuté au moment du stockage dans les maisons ou dans les lieux de commercialisation. C’est ainsi que 1 kilogramme de maïs, cultivé dans le pays par des producteurs locaux soit pour la consommation soit pour la vente dans le marché local, est prélevé soit au niveau des greniers, des cuisines, des cases, des chambres soit dans les champs ou les magasins. Ces échantillons sont ensuite ramenés à l’insectarium et des insectes y sont collectés et conservés dans de l’alcool 96% en vue de faire des études génétiques. Le maïs ainsi débarrassé de ces insectes adultes contient aussi des œufs et autres formes larvaires. Ce qui permet d’en faire un élevage de masse dans des bocaux afin d’augmenter la population échantillonnée par une deuxième génération.

Analyses d’ADN

Pourquoi le COI ?

Dans la perspective d’apporter des réponses à la problématique de l’étude, un marqueur mitochondrial (le Cytochrome Oxydase I) a été retenu. Le COI est un élément indispensable de la chaîne respiratoire mitochondriale et permet la production d’une grande partie de l’énergie nécessaire à la cellule. Cette sous-unité joue un rôle essentiel dans la respiration mitochondriale et contribue à la synthèse d’ATP (Malatesta et al., 1995). En outre, l’ADN mitochondrial, dont la transmission est uniparentale (par la mère) possède une importance privilégiée pour étudier l’évolution, car, son taux de mutation est élevé, il n’a pas de recombinaison méiotique et ses variations ne sont donc dues qu’à des mutations cumulées (pas de métissage). Sa variation est donc lente et se prête par ailleurs très bien au calcul de distance génétique sur des périodes brèves.

Extraction d’ADN

L’ADN des insectes est extrait en utilisant la méthode du Kit Qiagen DNeasy Tissue. Pour chaque individu de Sitophilus disséqué, seuls le prothorax et les pattes sont utilisés pour l’extraction. Ces parties sont ensuite placées dans un tube 1,5ml dans lequel on ajoute 180 μl de tampon ATL pour une dissociation des tissus et une individualisation des cellules puis 20 μl de protéinase K pour dégrader toutes les protéines après une incubation à 55°C pendant 3h à toute une nuit. L’étape qui suit consiste à ajouter 200 μl de tampon de lyse cellulaire (AL) et à incuber les échantillons à 70° pendant 10 minutes. Après incubation, 200 μl d’éthanol 96-100% est ajouté au mélange qui est vortexé et transvasé dans une colonne placée au préalable sur un tube collecteur de 2 ml ensuite centrifugé à 1361 rad/s pendant 1 min. Ceci permet ainsi de retenir l’ADN au niveau de la membrane de la colonne. En effet, par interaction ionique, L’ADN (chargé négativement) est adsorbé sur la membrane de la colonne. Ensuite l’ADN fixé sur la colonne est purifié pour éliminer toutes traces de contaminants. Ce lavage est réalisé par ajout successif de 500 μl de chacun des 2 tampons (AW1 et AW2) qui passent à travers la membrane par centrifugation à1361 rad/s pendant respectivement 1 et 3 minutes. Et enfin 40 μl et 20 μl du tampon AE au préalable incubés à 70°C pour augmenter le rendement de 15 à 20% sont directement versé sur la membrane que nous avons placée sur un tube de 1,5 ml pour décrocher l’ADN qui sera conservé à -20°C.

Migration électrophorétique

Elle consiste à séparer des fragments d’ADN en fonction de leur taille par migration dans une matrice solide appelée gel d’agarose soumis à un champ électrique. Sous l’effet du champ électrostatique, la molécule d’ADN chargée négativement va migrer vers l’anode. La distance parcourue (mesurée à partir des puits de dépôt), dépendra de la taille de chaque fragment. De ce fait, plus la taille du fragment est importante moins grande sera la distance parcourue et vice-versa. Les échantillons, 7μl d’extraits d’ADN + 3μl de bleu de bromophénol, seront déposés sur un gel d’agarose de 1,5 % et migrés à 100 volts pendant 30 à 35 minutes. L’ADN migré est révélé dans une chambre noire sous UV après passage dans un bain de Bromure d’Ethidium (BET).

PCR du cytochrome oxydase I (COI)

La PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction de polymérase en chaîne) est l’amplification in vitro d’une séquence particulière d’ADN matrice par extension de deux amorces par une ADN polymérase, en présence de désoxyribonucléotides et d’ions Mg2+. Réalisée dans un thermocycleur, l’amplification est faite par la répétition de cycles qui assure une multiplication par 2 du segment d’ADN cible à chaque cycle. Elle se déroule en 3 étapes : dénaturation initiale à 94°C pendant trois minutes, suivie de 35 cycles de dénaturation à 94°C pendant 1 minute; d’hybridation a 47°C pendant 1 minute et une élongation du brin d’ADN complémentaire à 72°C pendant 1 minute ; et une élongation finale à 72°C pendant 10 minutes termine la PCR. La visualisation des fragments d’ADN se fait par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5% dans un tampon TAE 0,5x, coloré au bromure d’éthydium. La taille des fragments est déterminée à l’aide d’un marqueur de poids moléculaire (PM) composé de plusieurs fragments d’ADN de taille connue qui est déposé dans le gel et migre en même temps que les échantillons. Pour chaque individu, deux PCR de 25 μl ont été effectuées pour les besoins de séquençage.

Séquençage du cytochrome oxydase I (COI)

Technique consistant à déterminer la séquence en nucléotides d’un fragment d’ADN (ici le COI, une portion du gène mitochondrial), le séquençage est basé sur une réaction de PCR particulière utilisant, en plus des composés habituels (ADN matrice, polymérase, amorces, dNTPs, Mg2+), des nucléotides modifiés : les didesoxyribonucléotides (ddNTPs). Ces ddNTPs ont la particularité d’être couplés à des fluorochromes : ddATP-vert, ddTTP-rouge, ddCTP-bleu et ddGTP-jaune (en noir sur l’électrophorégramme) mais aussi de ne pas posséder de groupement OH à l’extrémité 3′ du désoxyribose (annexe I). L’incorporation de ces ddNTPs par la polymérase bloque donc l’élongation de la molécule d’ADN complémentaire en cours de copie ; ce qui génère des fragments de différentes tailles. Les fragments de différentes tailles ainsi synthétisés sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’acrylamide (des plus petits aux plus grands). La lecture du gel est réalisée par le balayage automatique d’un laser qui permet de détecter les différents fluorochromes couplés aux 4 ddNTPs. Les amorces C1-N-2191 (5’-CCAGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’) et C1-J-1751 (5’-GGATCACCTGATATAG CATTCCC-3’) ont été utilisées pour l’amplification du Cytochrome Oxydase I. Le séquençage a été réalisé par une société Sud-Coréenne.

Analyses génétiques

Les séquences obtenues sont blastées dans le but de connaitre les espèces qui composent nos échantillons. Après Blast, les séquences ont été alignées, vérifiées et corrigées manuellement par l’aide du logiciel BioEdit version 7.0.5.3 Hall (1999). Le logiciel MEGA version 5.05 Tamura et al., (2011) a permis de voir les pourcentages de transition et transversion. Les sites polymorphes, monomorphes, les diversités haplotypique, nucléotidique et les Fst entre populations, ont été obtenus par l’utilisation du logiciel Dnasp version 5.10.01 Rozas et al. (2010). Le réseau d’haplotypes est obtenu par l’aide du logiciel NETWORK 4.6.1.1. Copyright (2012). L’isolement par la distance par l’utilisation du Test de Mantel (corrélation entre la distance géographique et le Fst) a été testée avec un niveau de signification de 0,05 par l’aide du logiciel XLSTAT 2013.1.01. L’hypothèse nulle du test (H0) est : les matrices ne sont pas corrélées et l’hypothèse alternative (Ha) : les matrices sont corrélées. La corrélation est de type Pearson et le nombre de permutations est de 10000. Seules les populations de S. zeamais sont concernées pour ce test puisqu’il faut au minimum trois populations, et pour S. oryzae on en a que deux. Les analyses AMOVA ont été réalisées par l’aide du logiciel Arlequin Version 3.1
Excoffier (2006) avec un niveau de signification de 0,05 et 1000 permutations. Les analyses de Mismatch Distribution pour chaque espèce et au niveau de chaque zone ont été faites avec le logiciel Dnasp version 5.10.01. Elles fournissent des renseignements sur l’expansion démographique des populations de S. zeamais et S. oryzae. Le logiciel MEGA version 5.05 a permis aussi de faire la reconstruction des arbres pour voir les affinités phylogénétiques des individus par 3 méthodes. La méthode de Neighbor-Joining qui utilise les distances génétiques, la méthode du Maximum de Parcimonie qui considère qu’un arbre est optimal lorsque sa longueur totale est minimale et celle du Maximum de Vraisemblance permettant de tester toutes les histoires ayant pu engendrer le jeu de données actuelles analysées. Pour ces arbres, une séquence du COI de Tribolium castaneum a été utilisée comme out group et la robustesse des branches a été évaluée pour 1000 répétitions de bootstrap. Le logiciel Mr Bayes version 3.1.2 a permis de sortir les arbres par la méthode Bayésienne par le calcul de probabilité postérieure à partir de probabilité définie à priori. Cette reconstruction a été obtenue avec 1000000 de générations, 4 chaines de Markov, 1 échantillonnage à chaque 10000 générations et seul le model GTR (6 types de substitutions) a été considéré.

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1.Description du cadre d’étude
I.2. Zea mays (L)
I.2.1. Origine, position systématique et variétés de Zea mays (L)
I.2.2. Grain de maïs et ses vertus
I.3. Espèces du genre Sitophilus
I.3.1. Position systématique des espèces du genre Sitophilus
I.3.2. Charançon du maïs, Sitophilus zeamais
I.3.2.1. Ecologie de l’insecte
I.3.2.2. Cycle de vie
I.3.3. Charançon du riz, Sitophilus oryzae
I.3.3.1. Ecologie de l’insecte
I.3.3.2. Cycle de vie
I.3.4. Pertes infligées par les charançons, Sitophilus zeamais et S. oryzae
I.4. Marqueurs moléculaires
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
II.1.Echantillonnage
II.2. Analyses d’ADN
II.2.1.Pourquoi le COI ?
II.2.2. Extraction d’ADN
II.2.3. Migration électrophorétique
II.2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction) du cytochrome oxydase I (COI)
II.2.5. Séquençage du cytochrome oxydase I (COI)
II.3. Analyses génétiques
CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION
III.1.RESULTATS.
III.1.1. Analyse de la diversité génétique
III.1.1.1. Variations génétiques du COI
III.1.1.2. Haplotypes
III.1.1.3. Diversité et différentiation génétiques
III.1.1.3.1. Diversités haplotypique et nucléotidique pour chaque espèce
III.1.1.3.2. Diversité haplotypique intra-zone agro-écologique
III.1.1.3.3. Diversité nucléotidique intra-zone agro-écologique
iIII.1.2. Analyse de la structure génétique
III.1.2.1. Différenciation et flux génétique
III.1.2.2. Structure génétique…
III. 1.2.2.1. Analyses AMOVA pour S. zeamais
III. 1.2.2.2. Analyses AMOVA pour S. oryzae
III.1.3. Histoire démographique
III.1.4. Arbres phylogénétiques
III.2.DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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