Soutenance mémoire
Principe de la réaction en chaine par polymérase
Au début des années 80, le diagnostic des maladies infectieuses et génétiques étaient basées sur des sondes. Ces techniques nécessitent une culture biologique pour augmenter le nombre de cellules ou d’organismes à déceler, mais cette culture n’est pas toujours facile ou réussie [Schochetman et al., 1988]. Le processus chimique de réaction en chaine par polymerase (PCR) a permis de ne plus dépendre du processus biologique de culture. La PCR consiste en l’amplification in vitro de l’ADN ou de l’ARN [Erlich, 1989]. C’est un outil universel dans le domaine de la biologie pour la détection des acides nucléiques. Avant de détailler le principe de la PCR, nous allons d’abord définir quelques termes biologiques utilisés.
Définitions de quelques notions biologiques
L’unité fondamentale de tout organisme vivant est la cellule. Pour les eucaryotes (ce qui nous concernent), la cellule comprend essentiellement deux parties : le cytoplasme et le noyau. Ce dernier contient les chromosomes où se trouve une molécule d’Acide DesoxyriboNucléique (ADN). Dans cette dernière est contenue l’information génétique qui constitue le génotype d’un organisme. La molécule d’ADN est composée de deux brins face à face formant une double hélice. Chaque hélice est caractérisée par la succession de nucléotides ou bases azotées : Adénine (A), Thymine (T), Guanine (G), Cytosine (C) . Entre chaque hélice, on observe une complémentarité des bases azotées : T associée à A et inversement ; G associée à C et inversement.
Expression génétique
L’expression génétique est un processus biochimique qui permet de traduire un gène en protéines. Ceci se fait en deux phases :
— La transcription : de l’ADN vers l’Acide RiboNucléique (ARN). Un seul brin (ou hélice) d’ADN est utilisé pour la transcription. La molécule d’ARN est construite par complémentarité au brin d’ADN.
— La traduction : de l’ARN vers une protéine.
L’ARN est aussi composée d’une succession de nucléotides : Uracile (U), Adénine (A), Guanine (G) et Cytosine (C). On note que la thymine (T) du brin de l’ADN devient l’uracile (U) en ARN.
Reproduction cellulaire
La reproduction ou division cellulaire est le mode de multiplication de toute cellule. Elle comporte deux catégories : la mitose et la méiose . La mitose assure la naissance de cellules identiques à la cellule mère et la méiose aboutit à la production de cellules sexuelles. Ainsi durant une reproduction cellulaire, l’information génétique contenue dans l’ADN est recopiée.
Dans ce qui suit, nous allons détailler le concept de la PCR. Reproduisant les phénomènes à l’œuvre lors de la division cellulaire, l’ADN est multiplié ou répliqué grâce à l’ADN polymérase qui est un ADN assurant la recopie de la même information génétique de la molécule d’ADN matrice à une nouvelle molécule avec quelques erreurs de recopie.
Cadre géneral de la PCR
La réaction en chaine par polymérase appelée Polymerase Chain Reaction (PCR) en anglais, est un concept technologique de multiplication en chaîne découvert par Kary Mullis en 1985 [Mullis and Faloona, 1987]. Une PCR permet d’obtenir, à partir d’un échantillon d’ADN peu abondant, d’importantes quantités d’ADN. En quelques heures, le nombre de molécules d’ADN obtenues peut atteindre des millions de copies suffisant pour une analyse ultérieure [Muyzer et al., 1993]. La PCR consiste en une répétition de réactions chimiques en cycle qui aboutissent à chaque cycle au doublement de la quantité d’ADN grâce aux polymérases. Ces dernières sont des enzymes qui permettent la synthèse du nouveau brin d’ADN.
Avant la réalisation du premier cycle de la PCR, l’ADN est placé à température ambiante et il est sous sa forme en double hélice. Cet état est appelé conditions natives . Il s’en suit l’étape intitulée Dénaturation initiale qui ne sera réalisée qu’une seule fois avant le tout premier cycle. Elle consiste à chauffer à 95 oC pendant 10 à 15 min environ jusqu’à déshybrider (séparer) les ADN double brin, de casser les structures secondaires, d’homogénéiser le milieu par agitation thermique, d’activer les polymérases et de dénaturer d’autres enzymes qui pourraient être présents dans la solution.nous répètons les 3 opérations suivantes pour chaque cycle d’environ 1 min :
1. Dénaturation : Cette étape permet de déshybrider les ADN, d’enlever les polymérases restantes et d’homogénéiser le milieu réactionnel avec une température maintenue à 95 °C.
2. Hybridation : On fait varier la température entre 40 et 65 °C pour permettre aux amorces de s’hybrider (se lier) aux brins d’ADN matrices.
3. Élongation : Cette étape permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire de leur ADN matrice à une température qui remonte légèrement jusqu’à 72 °C.
Techniques associées
Il existe plusieurs techniques associées à la PCR. Parmi celles-ci nous pouvons citer :
a) Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) : Il s’agit d’une PCR « classique » réalisée sur un ADN complémentaire (ADNc), qui est une copie d’un ARN, obtenue par une transcription inverse . Elle a été mise en place pour utiliser les ARN comme matrice d’amplification de la PCR [Liu and Saint, 2002]. Elle peut être utilisée pour la construction de plusieurs ADNc et pour la construction de sondes d’ADN.
b) PCR multiplex : C’est un processus qui, avec l’utilisation de trois amorces (courtes séquences d’ARN ou d’ADN) au moins par réaction de PCR, permet d’amplifier plus d’un ADN à la fois [Markoulatos et al., 2002]. Comme exemple d’utilisation, la PCR-multiplexe a été utilisée pour l’analyse des microsatellites (séquence d’ADN formée par une répétition continue de motifs composés de 2 à 10 nucléotides) et les polymorphismes d’un seul nucléotide (variation d’une seule paire de bases du génome entre les individus d’une même espèce) [Hayden et al., 2008].
c) PCR en point final : C’est la première technique inventée pour mesurer la quantité d’ADN. La mesure se fait à la fin de tous les cycles d’où le nom de point final. Elle est nommée ainsi que depuis l’apparition de la PCR quantitative (cf point suivant). Néanmoins, il n’y a pas de différence du point de vue biologique entre ces deux concepts.
d) PCR quantitative (en temps réel) : Cette technologie est basée sur la détection et la quantification d’un agent biologique pendant la réaction de la PCR à partir d’un traceur fluorescent (voir sous partie suivante) [Ramakers et al., 2003].
Pour notre travail, nous nous plaçons dans le cadre de la PCR quantitative que nous allons détailler dans la sous partie qui suit.
PCR quantitative (qPCR)
C’est une technique destinée à mesurer la quantité d’ADN initialement présente dans un échantillon. À chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN totale (amplicon) est mesurée grâce à un marqueur fluorescent. Un suivi en temps réel de la qPCR à chaque cycle est réalisé et le signal d’émission de la fluorescence obtenu est représenté par une courbe [Livak and Schmittgen, 2001]. Ce signal permet d’obtenir une quantification absolue ou relative de l’ADN cible.
Matériels de PCR en temps réel : Le thermocycleur est un appareil automatisant la réaction en chaine par polymérase. Il est couplé à un système de détection de fluorescence appelé fluoromètre. Parmi les matériels, nous pouvons citer le Light CyclerTM qui est commercialisé par Roche Diagnostics. Il y a aussi les ABI- PrismTM 7000 qui sont fabriqués par Applied Biosystems et le RotorGene Q commercialisé par Qiagen.
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Table des matières
Introduction générale
1 PCR et techniques de détection du cycle repère
1.1 Principe de la réaction en chaine par polymérase
1.1.1 Définitions de quelques notions biologiques
1.1.2 Cadre géneral de la PCR
1.1.3 Techniques associées
1.1.4 PCR quantitative (qPCR)
1.2 Fluorescence
1.2.1 Présentation d’un signal de fluorescence issu d’une qPCR
1.2.2 Fluorescences issues de la puce microfluidique
1.2.3 Principe du recalage d’image
1.3 Conclusion
2 Modèles et techniques de détermination d’un cycle repère
2.1 Modèle théorique et estimation de la quantité de molécules cibles
2.1.1 Modèle théorique
2.1.2 Estimation de la quantité de molécules initiales
2.2 Comment déterminer un cycle repère ?
2.2.1 Modèles géométriques
2.2.2 Modèles globaux
2.3 Conclusion
3 Filtrage erreurs de mesures et modèle des fluorescences
3.1 Modèle représentatif de la fluorescence issue de la qPCR
3.1.1 Problématique
3.1.2 Filtrage des observations aberrantes
3.1.3 Modèle représentatif de la fluorescence
3.2 Résultats expérimentaux
3.2.1 Présentation des données
3.2.2 Erreurs de mesures
3.2.3 Décroissance au début de la fluorescence
3.3 Conclusion
4 Méthode statistique de détection de changements
4.1 Introduction
4.2 Méthode du CUSUM
4.2.1 Le rapport de vraisemblance
4.2.2 La règle du CUSUM
4.2.3 Algorithme du CUSUM
4.3 Calibration
4.3.1 Choix de h
4.3.2 Fixation des paramètres m et b de la régression
4.4 Résultats expérimentaux
4.4.1 Évaluer la précision des mesures
4.4.2 Robustesse de la règle du CUSUM
4.5 Conclusion
Conclusion
Bibliographie
