Patrimoine génétique et les enzymes du VHB

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TAXONOMIE DU VHB (DENIS et al., 1999)

• Famille :Hepadnaviridae
• Genre :Orthohepadnavirus
• Espèce :Virus de l’hépatite B
• Taille : 42 nm
• Capside :Icosaédrique
• Enveloppe : Bicouche lipidique et protéines virales
• Génotypes : 8 majeurs (A à H)
• Réplication : Groupe VII dans la classification de Baltimore.

STRUCTURE DU VHB

Le virus a une structure complexe (Fig. 4, p 6) (PATIENT et al., 2008).

Enveloppe

L’enveloppe virale est composée d’une centaine de sous-unités de protéine dont 80% sont constituées d’antigènes de surface de l’hépatite B (Ag HBs). Au cours de l’infection, ces derniers sont synthétisés en grande quantité dans les hépatocytes. Cependant, seule une petite quantité se combine avec la nucléocapside complet (ADN capside) pour former le virus complet. La majeure partie de l’Ag HBs est libérée dans le sang sous forme de particules sphériques de 22 nm de diamètre et de bâtonnets.

Capside

La capside et l’ADN forment la nucléocapside d’un diamètre d’environ 28 nm. Elle possède une protéine antigénique nommée antigène de capside (core) de l’hépatite B (Ag HBc), très immunogène (les Ac produits par l’hôte sont un marqueur précoce et durable de l’infection). L’Ag HBc, composant interne du virus, est présent dans le foie mais n’est pas décelable dans le sang du patient. Un Ag nommé antigène de l’enveloppe de l’hépatite B (Ag HBe) correspond à un produit de sécrétion de l’Ag HBc amputé d’une de ses parties terminales (C terminale). Contrairement à l’Ag HBc, l’Ag HBe est excrété dans le sang du patient. Sa présence témoigne une multiplication virale intense.

Patrimoine génétique et les enzymes du VHB

A l’intérieur de la capside se trouvent l’ADN et les deux enzymes jouant un rôle dans la réplication et la maturation du VHB : ADN-polymérase et protéine kinase.
Le génome est composé de 2 brins circulaires d’ADN. Il est bicatenaire sur les ¾ de sa longueur. Ce génome code pour les protéines de l’enveloppe, de la capside, de l’ADN-Polymérase et de la protéine kinase.

MARQUEURS DIRECTS DE LA REPLICATION VIRALE : LES ANTIGENES

– Ag HBs : C’est l’antigène de surface, premier marqueur détecté lors d’une analyse biomédicale. Un antigène protéique constitué de 2 protéines : protéine moyenne (Pré S2 + S) et grande protéine (Pré S1 – Pré S2 + S) produit par le virus. C’est le premier marqueur de l’hépatite B aiguë et permet d’identifier une infection en cours par le virus avant l’apparition des symptômes. Sa persistance aboutit à la chronicité.
– Ag HBe : C’est une protéine virale permettant de détecter la présence des VHB car elle est retrouvée dans le sang uniquement lorsque ces derniers sont présents. En cas de traitement efficace, l’Ag HBe est éliminé et des anticorps anti-HBe sont apparus.
– ADN viral : Lors de la réplication virale, un génome viral est formé et détecté dans le sang grâce à la PCR.

MARQUEURS INDIRECTS DE LA REPONSE IMMUNE : LES ANTICORPS

– IgG anti-HBs : Les anticorps anti-HBs sont dirigés contre les antigènes de surface. Ils indiquent une exposition ancienne au virus. Ils protègent aussi contre une infection future.
En plus de l’exposition contre le virus, les anticorps peuvent aussi être acquis au cours d’une vaccination efficace.
– IgG anti-HBe : Ce sont des anticorps qui se forment après guérison ou après une vaccination contre l’hépatite B. Ils peuvent parfois disparaître après plusieurs années.
– IgM anti-HBc : Ce sont des anticorps dirigés contre l’antigène de core du virus. Ces derniers marquent le contact avec le virus. (FRIED et al., 2002.)

CINETIQUE DES MARQUEURS

Le niveau de gravité d’une inféction virale de l’hépatite B est donné dans le tableau 1 où différents profils des marqueurs sont obsérvés. Lors d’une infection par le VHB et à n’importe quel stade d’évolution, l’Ag HBs est positif. Pour préciser le stade d’évolution de l’hépatite B, la recherche d’emblé des marqueurs sont nécessaires (Ag HBs + Ac HBs + Ac HBc + Ag HBe + Ac HBe + ADN viral).

MATERIELS CONSOMMABLES ET REACTIFS

TEST DE DIAGNOSTIC RAPIDE (TDR)

Le kit OnSite Rapid Test est composé :
– d’une bandelette (R0042C) ;
– d’un compte-goutte en plastique ;
– d’un buffer (SB-R0042).

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Un kit ELISA (Recombilisa) prêt à l’emploi constitue l’un des matériels nécessaires pour cette technique (annexe 3). Il est composé :
– d’une plaque (E0710W) contenant les cupules ;
– de contrôle positif (E0710P) : solution tampon Tris Hcl composé de Sérum Albumine Bovine (SBA) et d’Ag HBs purifié ;
– de contrôle négatif (E0710N) : solution tampon Tris de SAB ;
– de conjugué (E0710H) : protéine A marqué à la Peroxydase de Raifort ;
– de substrat A (TME 2000A) et B (TME 2000B) : peroxyde d’hydrogène et Tetraéthylbenzidine ;
– de solution stop (SE1000) : acide sulfurique ;
– de la solution de lavage (WE 3000) : solution tampon de phosphate, tampon Tris et de chlorure de sodium (NaCl).
En plus du kit, des équipements complémentaires sont requis :
• un incubateur (Jouan) ;
• un spectrophotomètre (MR-96A) ;
• des micropipettes (P 100, P 1000) ;
• de l’eau distillée.

METHODOLOGIES

Dans la présente étude, la recherche de l’Ag HBs est réalisée par deux tests : le test immuno-chromatographique connu sous le nom commercial du TDR (OnSite Rapid Test) et le test immuno-enzymatique ou ELISA (Recombilisa) où des anticorps sont utilisés pour détecter les antigènes.

TEST IMMUNO-CHROMATOGRAPHIE : TEST DE DIAGNOSTIC RAPIDE (TDR)

Un test de diagnostic rapide est un test immuno-chromatographique permettant de détecter qualitativement l’Ag HBs. Il peut être réalisé à partir du sang total, de la salive, du plasma ou du sérum en fonction des matrices recommandées par le fabricant.

PRINCIPE

L’une des extrémités de la bandelette comporte un micropuit contenant un Ac de capture spécifique à l’Ag HBs. L’autre extrémité comporte deux bandes où il y a la zone test, contenant un deuxième Ac de capture, et la zone contrôle, contenant un Ac témoin (Fig. 9).
Lors de l’introduction du VHB, l’Ag HBs va se lier avec l’Ac en donnant un complexe Ag HBs-Ac anti-HBs. Après, ce dernier migre par capillarité et l’antigène est capturé en sandwich par un deuxième Ac fixé sur la membrane. Cette capture est alors traduite par l’apparition d’une ligne mauve à la zone test (T). L’excès du conjugué va continuer à migrer et va être immobilisé par un Ac témoin, l’accumulation du complexe coloré va aussi entraîner l’apparition d’une ligne mauve à la zone contrôle (C) (VALERIE et al., 2011).

REALISATION DU TEST

Pour réaliser le test, trois étapes sont à suivre. Premièrement, deux à trois gouttes d’échantillon sont déposées directement sur le micropuit de la bandelette à l’aide du compte-goutte en veillant à ce qu’il n’y ait aucune bulles d’air. Deuxièmement, l’échantillon est dilué avec deux gouttes de tampon lyse [buffer (SB-R0042)] en maintenant verticalement le flacon. Troisièmement, il faut attendre 10 à 15 minutes avant la lecture du résultat.

LECTURE DES RESULTATS

Les résultats sont interprétés selon l’apparition des traits sur les lignes (Fig. 10) :
– En présence du VHB, le test est positif et deux traits apparaissent sur la bande contrôle (C) et test (T).
– En absence de VHB, le test est négatif avec un seul trait visible sur la ligne (C).
– Le test est invalide, s’il n’y a pas de trait visible sur la bande contrôle (C).

RESULTATS

Au total, 160 patients ont été inclus durant la période d’étude dont 89 de sexe féminin et 71 de sexe masculin, avec un sexe-ratio de 1,2 et sont répartis selon les variables suivants :

– Globalement, la tranche d’âge dans l’étude a été classée en six tranches continues partant de 0 à plus de 60 ans et sont répartis comme suit :

• 6 sont des enfants de 0-5 ans, soit 3,7 % des cas

• 7 âgés de 6-14 ans avec un pourcentage de 4,3

• 22 âgés de 15-24 ans avec un pourcentage de 13,1

• 62 âgés de 25-39 ans avec un pourcentage de 38,7

• 53 âgés de 40-59 ans avec un pourcentage de 33,7

• 10 plus de 60 ans soit 6,25 % des cas

L’âge moyen des patients est de ± 39 ans (intervalle de 3 à 78 ans). Pour les sujets de sexe masculin, il est de ± 40 ans (intervalle de 3 à 78 ans), et celui de sexe féminin est de ± 37 ans (intervalle de 4 à 72 ans).

– Durant les trois mois d’étude, les échantillons ont été recueillis dans six sites de Madagascar et ont les effectifs et les fréquences suivantes :

• 74 venant d’Antananarivo, soit 46,2 %

• 13 venant de Fianarantsoa, soit 8,1 %

• 36 venant de Toamasina, soit 22,5 %

• 16 venant de Mahajanga, soit 10 %

• 11 venant d ’Antsirabe, soit 6,8 %

• 10 venant de Moramanga, soit 6,2 %

– Les 160 patients ont des motifs de diagnostic de l’hépatite B différents et sont répartis comme suit: • 5 sont des sujets suspects d’être atteint de l’hépatite B, ils représentent 3,1

% des sujets ;

• 39 faisaient des visites médicales. Ils représentaient 24,3 % des sujets

• 17 ont suivi des traitements et ont fait du contrôle. Ils représentaient 10,6 % des sujets ;

• 28 sont des sujets qui vont poursuivre leurs études à l’étranger et représentaient 17,5 % des cas.

• Pour la visite d’embauche, 21 ont été dépistés. Ils représentaient 13,1 % des cas ;

• Parmi les 89 sujets de sexe féminin, 32 sont enceintes. Elles représentaient 20 % des échantillons ;

• Les 18 restant représentaient 11,2 % des personnes dépistées Elles n’ont pas de renseignements cliniques propres.

CARACTERISTIQUES DES ECHANTILLONS

Les résultats des échantillons testés avec les deux types de diagnostic sont donnés sur la figure 12.

Parmi les 48 échantillons révélés positifs au TDR, 3 sont douteux (sous forme de trace sur la ligne test) et après confirmation avec le test ELISA, ils ont été révélés négatifs. Les 45 sérums ont été confirmés positifs au test de référence.

Sur les 45 échantillons positifs, des rapports entre les variables (âge, genre) ont été étudiés et repartis selon les figures (13, p 26) suivants :

 Rapport entre le genre et la résidence

Entre le genre et la résidence, les valeurs ne sont pas significatives car le Khi carré est à 0,07 tandis que le 5 % de ce Khi carré est à 6,84.

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Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I. HEPATITE
II. HEPATITE B
III. VIRUS DE L’HEPATITE B
III.1 HISTORIQUE
III.2 TAXONOMIE DU VHB (DENIS et al., 1999)
III.3 STRUCTURE DU VHB
III.3.1 Enveloppe
III.3.2 Capside
III.3.3 Patrimoine génétique et les enzymes du VHB
III.4 Variétés des particules virales
IV. Diagnostic
IV.1 Marqueurs directs de la réplication virale : les Antigènes
IV.2 Marqueurs indirects de la réponse immune : les Anticorps
V. Cinétique des marqueurs
VI. Histoire de l’ évolution de l’ infection
VI.1 Infection aiguë
VI.2 Infection chronique
VII. Transmissions
VIII. Cycle viral
IX. Traitements
X. Préventions
XI.1 Mesure vaccinale :
XI.2 Mesure non vaccinale :
I. MATERIELS UTILISES
I.1 LES PATIENTS
I.1.1 Population d’étude
I.1.2 Critère d’inclusion
I.1.3 Critère d’exclusion
I.1.4 Taille de l’échantillon
I.2 MATERIELS
I.2.1 MATERIEL BIOLOGIQUE
I.2.3 MATERIELS CONSOMMABLES ET REACTIFS
I.2.3.1 Test de Diagnostic Rapide (TDR)
I.2.3.2 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
II. METHODOLOGIES
II.1 TEST IMMUNO-CHROMATOGRAPHIE : TEST DE DIAGNOSTIC RAPIDE (TDR)
II.1.1 Principe
II.1.2 Réalisation du test
II.1.3 Lecture des résultats
II.1.4 Avantages
II.1.5 Inconvénients
II.2 TEST IMMUNO-ENZYMATIQUE OU ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)
II.2.1 Principe
II.2.2 Etapes
II.2.3 Réalisation du test
II.2.3.1 Calcul du titre (d’index de stimulation)
II.2.3.2 Performances du test
II.2.4 Interprétation des résultats
II.2.5 Avantages
II.2.6 Inconvénients
III. CONSIDERATION ETHIQUE
IV. ANALYSE STATISTIQUE
TROISIEME PARTIE : RESULTATS
I. CARACTERISTIQUES DES ECHANTILLONS
II. PERFORMANCES DU TEST
II.2 PROPRIETE EXTRINSEQUE
QUATRIEME PARTIE : DISCUSSIONS
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIQUES