Pathologie fungique au cours de la mucoviscidose

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Le complexe d’espèce Pseudallescheria boydii / Scedosporium apiospermum

Taxonomie et nomenclature

Pseudallescheria est un genre faisant partie des Ascomycetes, de l’ordre des Microascales et de la famille des Microascaceae 1.
Jusqu’à récemment, S. apiospermum était considéré comme l’anamorphe de P. boydii. Les travaux de Gilgado et al. 4-6 ont permis de mettre en évidence plusieurs espèces au sein de ce complexe et de différencier S. apiospermum de P. boydii. Il est maintenant admis que ce complexe d’espèce comprend : P. apiosperma, P. boydii, S. aurantiacum, P. minutispora et S. dehoogii. La distinction des sous-groupes P. ellipsoidea, P. fusoidea et P. angusta au sein de l’espèce P. boydii fait toujours l’objet de débat 7,8.

Identification du complexe

Sur milieu de Sabouraud, les espèces du complexe P. boydii / S. apiospermum donnent des colonies cotonneuses / laineuses de couleur blanchâtre à grise allant parfois jusqu’au noir en vieillissant, le verso est brunâtre (cf. fig. 3).
Pour permettre un isolement plus facile de ces espèces dans des isolats cliniques, notamment respiratoires, il est préférable d’utiliser des milieux sélectifs de Scedosporium spp, comme le milieu SceSel+ contenant du benomyl qui inhibe le développement des champignons filamenteux à pousse plus rapide (ex. : Aspergillus spp).
La forme sexuée ne se voit que très rarement en laboratoire clinique et seulement sur milieu pauvre après incubation prolongée.
Il existe 2 formes asexuées (cf. fig. 4)
La forme Scedosporium présente des conidies ovoïdes ou claviformes naissant directement sur le côté des filaments végétatifs (alleuroconidies) ou à l’extrémité de conidiophores fins dressés à angle droit sur le filament ou branchés entre eux. (cf. fig. 5) culture sur lame, coloration au bleu de lactophénol ; A : alleuroconidies (grossi. x 400) ; B : conidiophore solitaire (grossi. x 1000)
La forme Graphium est caractérisée par des annellides regroupées donnant naissance à des conidies hyalines légèrement plus fines (cf. fig. 6).
Dans un laboratoire de microbiologie non spécialisé, l’identification au rang d’espèce de ces champignons est excessivement difficile sur des critères uniquement morphologiques, c’est pourquoi il a été mis au point de nombreuses techniques pour la faciliter.
Initialement, la différenciation des espèces de ce complexe a été faite par Gilgado et al. (2005) 4 par séquençage partiel de plusieurs loci : 2 régions du gène de la β-tubuline, une région du gène de la calmoduline et la région ITS de l’ARN ribosomal (BT2, TUB, CAL et ITS respectivement). Cette technique étant longue et fastidieuse d’autres méthodes de biologie moléculaire ont été mises au point, pour la plupart basées sur l’étude du gène de la β-tubuline ou de la région ITS. Certaines se font à partir des champignons en culture : PCR temps réel (qPCR), loop mediated isothermal amplification (LAMP), PCR based reverse line blot hybridisation 12 (PCR-RLB), restriction fragment lenght polymorphism 8 (RFLP) ou rolling circle amplification 13 (RCA). D’autres ont pour but de détecter et d’identifier ces pathogènes directement depuis le prélèvement clinique par PCR Multiplex 14 ou PCR-RLB 15 par exemple.
D’autres techniques ne faisant pas appel à la biologie moléculaire sont à l’étude, comme l’utilisation de la spectrophotométrie de masse 16.

Épidémiologie

Les espèces du complexe P. boydii / S. apiospermum sont le plus souvent retrouvées en milieux tempérés. Il est maintenant établi qu’il existe une corrélation étroite entre l’activité humaine et la fréquence à laquelle sont retrouvées les espèces du complexe dans l’environnement 11. Kaltseis et al. (2009) 17, dans une étude réalisé en Autriche et aux Pays-Bas, ont estimé que S. apiospermum était l’espèce la plus présente suivi de S. dehoogii et S. aurantiacum. Les résultats de Harun et al. (2010) 11, dans une étude réalisée en Australie, place S. aurantiacum, comme l’espèce la plus représentée. Ces résultats laissent penser que la répartition environnementale des espèces du complexe est très dépendante de la géographie. Cette hypothèse semble confirmée par des études à propos de la colonisation bronchique de patients atteints de mucoviscidose 18, 19.
Jusqu’à récemment, l’ensemble des manifestations cliniques provoquées par les espèces du complexe P. boydii / S. apiospermum étaient attribuées à Scedosporium apiospermum qui était sensé être l’anamorphe de Pseudallescheria boydii. C’est pourquoi il n’est possible de parler de l’épidémiologie clinique que du complexe dans son ensemble et non de chaque espèce prise à part. Pour plus de facilité, dans les paragraphes qui suivent, nous désignerons l’ensemble du complexe d’espèce par la seule espèce S. apiospermum.
Les pathologies provoquées par les champignons de ce complexe sont très variées, on peut les séparer en 3 groupes : les infections localisées faisant suite à un traumatisme, les colonisations de cavités, symptomatiques ou asymptomatiques, et les infections systémiques 20 (cf. fig. 7).
Scedosporium apiospermum est un agent classique responsable de mycétomes à grains blancs, l’inoculation faisant suite à des plaies superficielles 21. Le même mode d’inoculation peut-être responsable d’arthrites, d’ostéomyélites ou d’endophtalmies chez des sujets immunocompétents 21, dans ces cas l’infection peut rester asymptomatique ou paucisymptomatique pendant plusieurs années. De la même façon, il a été observé des infections cutanées avec lymphadénites sans mycétome chez des sujets immunodéprimés 21.
La propension de Scedosporium apiospermum à coloniser des cavités peut être responsable de sinusites mais aussi d’otites externes plus ou moins invasives selon le statut immunologique des patients 22. S. apiospermum est aussi à l’origine de balles fungiques sinusales mais le plus souvent pulmonaires chez des patients ayant une pathologie sous-jacente 23 (sarcoïdose, tuberculose…). Il a été décrit de véritables bronchopneumopathies allergiques à S. apiospermum 24. Nous aborderons plus tard la place des espèces du complexe dans la mucoviscidose.
Chez des patients le plus souvent fragilisés par une pathologie sous-jacente, on peut constater un passage systémique de S. apiospermum menant à des infections invasives. Il a été observé de véritables pneumonies invasives à S. apiospermum 23 ou « mycétomes pulmonaires », favorisées par une corticothérapie et sur des terrains généralement débilités 20. Des endocardites à S. apiospermum peuvent parfois se déclarer à distance de chirurgies cardiaques. Les infections invasives profondes et touchant plusieurs organes ne s’observent quasiment exclusivement que chez des patients immunodéprimés (transplantation d’organe solide ou de cellules souches hématopoïetiques, leucémie aigüe, cancer solide…) 25. S. apiospermum possède un tropisme vasculaire important 26, il engendre donc régulièrement des complications au niveau du système nerveux central à type de méningites ou d’abcès cérébraux, aussi bien chez l’immunocompétent que l’immunodéprimé 27. Un mode de contamination particulier à S. apiospermum, suivi d’infection disséminée et de complication neurologique se voit chez des patients rescapés de noyade et ayant inhalé de grande quantité d’eau polluée, appelé en anglais le « near-drowning syndrome » 28.

Virulence

Les espèces du complexe sont de virulences différentes ; il a été prouvé sur des modèles murins que S. aurantiacum était l’espèce la plus virulente suivie de S.
Les taux de mortalité observés lors d’infections par des espèces du complexe P. boydii / S. apiospermum sont la preuve de la virulence de ces champignons et / ou de la fragilité des patients atteints. Les taux de mortalité constatés sont de 26,8% et 57,2% en cas d’atteinte pulmonaire invasive ou non respectivement 23, 74% lors d’atteintes du système nerveux central que ce soit chez des patients immunodéprimés ou non 27, 70% lors du « near-drowing » syndrome 28 et 58% chez des patients transplantés 31.

Sensibilité aux antifungiques

L’ensemble des sensibilités in vitro aux antifungiques des espèces du complexe P. boydii / S. apiospermum est résumé dans le tableau 1, basé sur les études de Gilgado et al., 2006 32 et de Lackner et al., 2012 33.
Les différences de résultats observées vis-à-vis de la micafungine, seule echinocandine testée dans l’étude de Gilgado et al., sont dues au fait que ces derniers utilisent la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) au lieu de la Concentration Minimale Efficace (CME) pour juger de l’efficacité de cette molécule, contrairement à Lackner et al.. C’est bien la CME qui doit être utilisée pour définir la sensibilité d’un isolat aux echinocandines comme conseillé dans les dernières recommandations de l’EUCAST 34 (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) et du CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute).
S. aurantiacum est l’espèce du complexe la plus résistante aux antifungiques avec une sensibilité la plus basse pour le voriconazole.

Infection / Colonisation

Au cours de la mucoviscidose, l’importante surmorbidité et surmortalité observée est en grande partie attribuée aux infections chroniques et récurrentes de l’arbre pulmonaire 46.
L’épaississement des sécrétions muqueuses bronchiques et leur production en moins grande quantité entraînerait un défaut de la clairance mucociliaire et donc faciliterait l’adhésion des bactéries aéroportées et des spores fungiques, ainsi que leur prolifération sous forme de biofilm. Ces colonisations chroniques sont à l’origine de réactions immunitaires locales et humorales et cette inflammation est un facteur aggravant à part entière des symptômes respiratoires des patients.
L’écologie microbienne des voies respiratoires et son évolution en fonction de l’âge des patients suivent un schéma relativement similaire chez tous les malades.
Durant l’enfance, ce sont les infections à Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae qui sont les plus fréquentes avec un taux de colonisation à S. aureus avoisinant les 70% 46. Les souches de S.aureus résistantes à la meticilline (SARM) sont souvent transmissibles d’un patient à un autre et ces souches épidémiques sont généralement les plus virulentes 47, d’où l’importance des mesures d’hygiène intra et extra hospitalières.
La colonisation puis l’infection chronique par Pseudomonas aeruginosa marque un tournant de la maladie pulmonaire. Le passage de la colonisation à l’infection correspond au changement de phénotype des souches de P. aeruginosa de l’état non-mucoïde à l’état mucoïde 46. Sous cette dernière forme, le germe s’organise en biofilm et devient ainsi très résistant aux antibiotiques. Les traitements actuels n’arrivent pas à éliminer le pathogène une fois la colonisation confirmée. Comme pour S. aureus, il existe des souches épidémiques de P. aeruginosa et certaines sont responsables d’une majoration des signes cliniques comparé aux souches non- épidémiques 47.
Avec l’amélioration du contrôle des espèces citées ci-dessus, l’incidence d’autres bactéries ne cesse d’augmenter, tel Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter xylosoxidans et certaines mycobactéries atypiques 48.

Pathologie fungique au cours de la mucoviscidose

La colonisation fungique des voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose survient plus tardivement dans l’histoire de la maladie, en général vers l’adolescence. Il est supposé que les dommages infligés à l’épithélium
bronchopulmonaire par les colonisations / infections bactériennes sont nécessaires à la bonne adhésion des spores fungiques 49.
L’espèce la plus retrouvée est A. fumigatus ; sa prévalence dans les sécrétions bronchiques de patients atteints de mucoviscidose varie selon les études de 16 à 56,7 % 49. Initialement la colonisation s’effectue par de nombreux génotypes différents et ensuite seulement, un génotype unique prédomine et perdure 49. L’aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA) est la manifestation clinique la plus fréquente de la colonisation à A. fumigatus. Les critères diagnostics proposés par le groupe de travail de l’ISHAM (International Society of Human and Animal Mycology) sur l’ABPA compliquant l’asthme 50 sont exposés dans le tableau 3.

La technologie DiversiLab®

La technologie DiversiLab® (bioMérieux SA, Marcy l’Etoile, France) permet de réaliser des rep-PCR de façon semi-automatique, elle associe :
– des réactifs permettant la rep-PCR à proprement parler : amorces spécifiques à chaque kit, acides nucléiques en excès, contrôles positifs et négatifs.
– un système de puces dans les puits desquelles chaque produit d’amplification est marqué par fluorescence.
– un appareil, l’Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Les Ulis, France), qui réalise une microélectrophorèse à partir des produits amplifiés déposés sur les puces. Il fournit un profil électrophorétique « brut » qui est ensuite standardisé grâce à des marqueurs internes de poids moléculaire connus à 150 et 700 paires de bases (pb).(cf. fig. 9)
– le logiciel DiversiLab®, hébergé sur internet, qui permet la gestion des données et le suivi du processus (extraction, PCR, électrophorèse…) pour
chaque échantillon ainsi que l’élaboration de rapports où sont comparés les profils électrophorétiques entre eux ou par rapport à une bibliothèque de profils connus.
Profil électrophorétique brut où l’on voit les marqueurs de poids moléculaire (à droite). Profil standardisé en fonction de l’intensité des marqueurs (à gauche).
Dans notre étude, nous avons réalisé les rep-PCR sur les isolats avec le DiversiLab® Fungal kit dont les amorces ont été initialement conçues pour l’étude de l’ensemble des champignons filamenteux, et le DiversiLab® Aspergillus kit dont les amorces ont été conçues pour l’étude du genre Aspergillus.
Les paramètres du thermocycleur Veriti (Life Technologies, Saint-Aubin, France) ont été les suivants pour le DiversiLab® Fungal kit : dénaturation initiale à 94°C pendant 2 min, 35 cycles de dénaturation à 92°C pendant 30 sec, hybridation à 50°C pendant 30 sec, extension à 70°C pendant 90 sec et une extension finale à 70°C pendant 3min.
Pour le DiversiLab® Aspergillus kit : dénaturation initiale à 94°C pendant 2 min, 35 cycles de dénaturation à 94°C pendant 30 sec, hybridation à 50°C pendant 30 sec, extension à 70°C pendant 90 sec et une extension finale à 70°C pendant 3 min.
La microélectrophorèse a été réalisée sur l’Agilent 2100 selon les recommandations du constructeur.
Les profils ont été traités à l’aide du logiciel DiversiLab® 3.4 qui calcule un indice de similarité entre chaque profil par la corrélation de Pearson pour ensuite créer un dendrogramme par la méthode UPGMA (Unweigthed Pair Group Method with Arithmetic mean).

Règles d’interprétation

Les outils de traitement des données fournis par le logiciel ont permis de comparer les profils électrophorétiques entre eux selon les règles conseillées par le fournisseur.
– les profils standardisés qui présentent moins de 2 pics dont la fluorescence atteint 100 sont a priori ininterprétable.
– les pics situés après 700 pb n’ont pas été pris en compte car les fragments de haut poids moléculaire sont amplifiés de façon moins reproductibles, ils ont donc été considérés comme non spécifiques.
– deux pics de profils différents et de même poids moléculaire ont été considérés différents si l’un était d’une intensité au moins double de l’autre et que le reste des profils étaient d’intensité comparable.
– deux profils ont été considérés :
– identiques si aucun pic ne différait
– proches s’il y avait 1 à 2 pics d’écart
– différents à partir de 3 pics d’écart

Séquençage et identification

Afin de permettre une identification au rang d’espèce des isolats, des extraits d’ADN ont été préparés pour chacun d’eux à l’aide du DNA Plant mini kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). Une PCR du locus TUB du gène de la-tubuline a été réalisée, puis les amplicons ont été séquencés et les séquences obtenues ont été comparées à celles déposées dans Genbank pour chacune des espèces du complexe P. boydii / S. apiospermum.
Le séquençage a été réalisé par l’équipe du laboratoire de Parasitologie / Mycologie du CHU d’Angers.

Résultats

L’ensemble des résultats est visible dans le tableau 5 (p 31)

Séquençage

Le séquençage a permis l’identification au rang d’espèce de tous les isolats sauf un (14361).
Il a été trouvé : 35 P. boydii, 2 P. ellipsoidea, 21 S. apiospermum et 4 S. aurantiacum.

DiversiLab® Fungal kit

La rep-PCR a permis de fournir des profils électrophorétiques exploitables pour l’ensemble des 65 isolats (cf. annexe 1).
Onze génotypes différents ont été mis en évidence.
Les isolats d’un même génotype appartiennent à une seule et même espèce.
La classification génotypique obtenue est identique à celle obtenue par RAPD, excepté pour 2 isolats d’un même patient qui étaient de génotypes différents des autres en RAPD mais qui sont similaires entre eux et aux autres par rep-PCR (P1). (cf. fig. 10)
Parmi les 5 patients pour lesquels des isolats multiples et séquentiels ont été recueillis, 4 d’entre eux sont colonisés par un génotype unique différent d’un patient à l’autre (P1, P3, P4, P7).
Le cinquième est colonisé par 2 génotypes différents de S. apiospermum rencontrés une fois simultanément (P8).
Pour les 4 patients avec un seul prélèvement réalisé, il n’a été retrouvé qu’un génotype unique par patient, propre à chaque patient (P2, P5, P6, P9).
Les deux isolats de P. minutispora présentent un seul et même génotype. Nous n’avons pas trouvé de profils « proches »

Table des matières

Introduction
PREMIÈRE PARTIE
1 Rappels de mycologie
1.1 Bases fondamentales
1.2 Développements « récents »
2 Le complexe d’espèce Pseudallescheria boydii / Scedosporium apiospermum
2.1 Taxonomie et nomenclature
2.2 Identification du complexe
2.3 Épidémiologie
2.4 Virulence
2.5 Sensibilité aux antifungiques
2.6 Typage
3 La mucoviscidose
3.1 Généralités
3.2 Infection / Colonisation
3.3 Pathologie fungique au cours de la mucoviscidose
4 Les espèces du complexe P. boydii / S. apiospermum au cours de la mucoviscidose
5 But de l’étude
SECONDE PARTIE
6 Matériel et Méthodes
6.1 Patients et isolats
6.2 Culture et extraction
6.3 La rep-PCR
6.3.1 La technologie DiversiLab®
6.3.2 Règles d’interprétation
6.4 Séquençage et identification
7 Résultats
7.1 Séquençage
7.2 DiversiLab® Fungal kit
7.3 DiversiLab® Aspergillus kit
8 Discussion
8.1 Règles d’interprétation des profils
8.2 Comparaison des kits de rep-PCR
8.3 Comparaison avec la RAPD
8.3.1 DiversiLab® Fungal kit
8.3.2 DiversiLab® Aspergillus kit
8.4 Comparaison avec les données de la littérature
8.4.1 Génotypage
8.4.2 Physiopathologie
8.5 Considérations technico-économiques
Conclusion
Bibliographie

Télécharger le rapport complet