Paramètres influençant la formation du biofilm

Les travaux présentés dans cette thèse publier sur chatpfe.com ont pour objectifs de permettre le développement de surfaces antibactériennes pour des applications dans les industries agroalimentaires et de participer à la compréhension des mécanismes impliqués dans la dégradation des microorganismes par photocatalyse hétérogène, notamment sous forme de surfaces.

Les bactéries sont ubiquitaires dans notre environnement. Leur mode de vie principal est sous forme de biofilm. Les bactéries au sein de ces biofilms, qu’elles soient pathogènes ou non, sont capables de s’adapter et de résister à de nombreux stress. La présence de ces communautés bactériennes, capables de persister sur les surfaces, représente, un problème préoccupant dans certains domaines, notamment dans les environnements médicaux ou ceux des industries agroalimentaires. La présence des biofilms dans les IAA est un problème récurrent qui peut avoir des répercussions d’ordre économique mais également des conséquences sur la sécurité sanitaire des aliments.

Les procédures de nettoyage et de désinfection classiquement utilisées dans les IAA apparaissent parfois insuffisantes pour éliminer les biofilms (mise en œuvre non adaptée, efficacité limitée des produits utilisés face aux biofilms). Il est, par conséquent, nécessaire de trouver de nouveaux moyens de lutte efficaces permettant de limiter la présence de ces flores microbiennes dans les IAA.

De nouvelles stratégies de lutte contre la présence des biofilms sont à développer. Parmi ces stratégies, l’utilisation de la photocatalyse hétérogène apparaît pertinente aussi bien pour la désinfection de l’eau, de l’air mais également pour la mise au point de surfaces et matériaux auto-nettoyants et décontaminants. La photocatalyse hétérogène fait partie des Procédés d’Oxydation Avancée (POA). Il s’agit d’une technique non sélective, capable de dégrader des composés organiques comme des polluants chimiques (pesticides, colorants, composés organiques volatils, …), mais aussi des microorganismes. La photocatalyse bénéficie d’une mise en œuvre aisée, propre, écologique et peu coûteuse. Ce procédé, fonctionnant à des températures et pressions proches des conditions ambiantes, met en œuvre une activation photochimique pour la synthèse d’espèces réactives de l’oxygène (EROs). Ces EROs sont des composés extrêmement oxydants et réactifs comme le peroxyde d’hydrogène ou les radicaux hydroxyles.

Dans le cadre de cette thèse, financée par l’Agglomération de Saint-Brieuc et le Conseil Général des Côtes d’Armor, l’élaboration de surfaces antibactériennes pour application dans les IAA, a été menée. La fonctionnalisation de surfaces à l’aide de dioxyde du titane, le TiO2 leur confère une activité bactéricide. De nombreuses applications ont vu le jour, notamment dans le domaine médical. Les surfaces fonctionnalisées élaborées ont été testées contre des microorganismes qui sont retrouvés, sous forme de biofilms, dans les IAA. Il s’agit de bactéries pathogènes responsables de toxi-infections alimentaires telles que Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica. Est également concernée, Pseudomomas fragi, qui est une bactérie appartenant à la flore d’altération et responsable de l’implantation de biofilms dans les IAA.

Afin d’élaborer des surfaces antibactériennes, la première étape est le choix et l’optimisation de la méthode d’obtention des surfaces à base de composés du titane, le TiO2. La méthode sélectionnée est la pulvérisation cathodique radio-fréquence qui permet de déposer, à l’aide d’un plasma, une couche mince sur un support. Cette couche mince permet de fonctionnaliser ce support en lui apportant la capacité de photocatalyse. Une fois la technique de dépôt validée, les surfaces sont testées vis à-vis des souches bactériennes sélectionnées pour cette étude et qui sont caractéristiques d’environnements agroalimentaires, et plus particulièrement des IAA de la filière « viande ». Différentes approches sont alors menées afin de mettre en évidence l’effet photocatalytique et antibactérien des couches minces obtenues. La première approche consiste à déterminer les espèces réactives de l’oxygène responsable du stress oxydatif à la surface de la couche mince. La seconde approche a pour objectif l’observation des effets de la photocatalyse sur les bactéries. Enfin, la mise en œuvre de couches minces de dioxyde de titane capable de photocatalyse sur un substrat rencontré dans les IAA est menée en vue de tester leur applicabilité.

Dans l’environnement, les microorganismes sont ubiquitaires et peuvent être trouvés sous deux formes différentes. La première est la forme unicellulaire libre, dite planctonique, où les bactéries sont retrouvées de manière plus ou moins isolée. Pour la seconde forme, les bactéries peuvent se trouver au sein de communauté bactérienne, constituant une structure tridimensionnelle complexe, appelée biofilm. Cette organisation constitue le mode de vie naturel et privilégié pour 90 % des micro organismes (Briandet, 2013). Dans ces structures, les bactéries planctoniques deviennent sessiles en s’agrégeant entre elles dans une matrice extracellulaire. En effet, les microorganismes ne sont pas capables de coloniser une surface inerte sans la production de polymères organiques qui constituent cette matrice (Carpentier et Cerf, 1993). Cette matrice est composée essentiellement d’eau, de protéines, de polysaccharides et de sels ; elle constitue une protection pour les bactéries du biofilm (Guerrero et al., 2009; Abdallah et al., 2014)

Les biofilms sont définis comme des écosystèmes complexes et dynamiques, constitués de microorganismes vivants et morts, adhérés entre eux et à une surface réceptrice. Cette surface peut être une surface biotique telle que les cellules de la muqueuse intestinale ou une surface abiotique comme les équipements d’industries alimentaires (Roux et Ghigo, 2006) .

Au sein d’un biofilm, les bactéries sont capables d’avoir une activité collective, coordonnée par des interactions et communications entre les bactéries. Ces différentes interactions jouent un rôle crucial dans la formation et la structure du biofilm ainsi que pour la résistance des cellules face aux différents stress (Kostaki et al., 2012; Giaouris et al., 2014).

bactériens peuvent jouer un grand rôle dans la reconnaissance d’une surface abiotique ainsi que dans l’adhésion.

Lorsque les liaisons chimiques sont maintenues pendant un laps de temps suffisant, de nouveaux mécanismes chimiques et physiques se mettent alors en place et les rendent permanentes et irréversibles. La multiplication bactérienne est également un facteur qui rend l’adhésion permanente grâce à des appendices cellulaires, des pilis, mais surtout grâce à la sécrétion de substances polymériques extracellulaires (EPS, Extracellular Polymeric Substances). Ces EPS sont constituées d’exopolysaccharides, de protéines.

Toutes ces substances possèdent un rôle primordial dans la consolidation et le maintien du biofilm (Carpentier et Cerf, 1993; Donlan, 2002; Karatan et Watnick, 2009; Abee et al., 2011). De ce fait, les liaisons mises en jeu à cette étape nécessitent un accroissement de l’énergie mécanique pour les rompre.

La colonisation du support se fait ensuite par la multiplication bactérienne et agrégation des bactéries. Le biofilm acquiert une structure tridimensionnelle complexe. En outre, selon les signaux environnementaux reçus, comme par exemple la température, l’humidité, le pH, la disponibilité en nutriments ou encore la communication intercellulaire via le « quorum sensing », les bactéries peuvent alors moduler la formation du biofilm (Abdallah et al., 2014). Bien que la formation de biofilm reste un phénomène plutôt discret, son épaisseur peut atteindre quelques millimètres en quelques jours (Myszka et Czaczyk, 2011).

Table des matières

Introduction Générale
Chapitre I : Revue Générale
I. Adhésion bactérienne et Biofilms
A. Définition du biofilm
B. Formation d’un biofilm
Cycle de formation
Paramètres influençant la formation du biofilm
C. Biofilms au sein des industries agroalimentaires
Bactéries présentes dans les IAA
Impact de la présence des biofilms dans les IAA
II. Moyens de lutte
A. Procédures de nettoyage et de désinfection
B. Nouvelles approches
Limiter l’adhésion initiale et les interactions
Limiter la communication
Déstructurer le biofilm
Modifications de surfaces
III. Les procédés d’oxydation avancée
A. Principe de la photocatalyse hétérogène
B. Dioxyde de titane
Généralités
Applications du TiO2
IV. Stress généré par la photocatalyse
A. Effet de l’exposition aux rayonnements UV
B. Stress oxydatif généré par la photocatalyse
Espèces réactives de l’oxygène
Cibles du TiO2
V. Mécanismes de réponse au stress généré par le TiO2
A. Mécanisme de réparation de l’ADN
B. Prévention des EROs
Gestion du fer
Superoxyde dismutase
Catalase
Peroxydase
Chapitre II : Matériels et Méthodes
I. Introduction
II. Obtention des couches minces
A. Pulvérisation cathodique radio-fréquence
1. Description du bâti de pulvérisation
2. Préparation des échantillons
3. Conditions de dépôts
III. Caractérisation des couches minces
A. Caractérisation optique et physique
1. Morphologie et épaisseur de la couche mince
2. Détermination du band-gap (Eg)
3. Phase cristalline du TiO2
B. Test de décoloration du bleu de méthylène
C. Effet antibactérien
IV. Détection et dosage des EROs
A. Peroxyde d’hydrogène H2O2
B. Anions superoxydes O2-
C. Radicaux hydroxyles OH
V. Méthodes d’analyses des réponses bactériennes face au stress de la photocatalyse
A. Effet des UV – Microdépôt sur milieu gélosé
B. CMI
C. Capacité d’adhésion – Test de MATS
D. Marquages épifluorescents in situ
E. Suivi de l’expression de gènes d’intérêt
Conclusion Générale

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