Paramètres clés de l’extraction sur phase solide

Le chimiste analyste est confronté à de nombreux défis dans divers domaines d’applications (environnemental, agroalimentaire, biomédical, toxicologique, etc) du fait du très grand nombre de composés à analyser qui sont le plus souvent présents à l’état de traces dans des matrices extrêmement complexes. Cette demande sociétale a ainsi conduit à l’amélioration des techniques de séparation chromatographique et électrophorétique existantes ainsi que le développement de détecteurs de plus en plus sensibles et sélectifs tels que les spectromètres de masse. Le couplage des techniques séparatives sus-citées avec la spectrométrie de masse a notamment permis l’accomplissement de progrès considérables pour l’analyse de composés à l’état de traces. Toutefois, l’analyse de traces dans des échantillons complexes nécessite encore le plus souvent une étape de traitement de l’échantillon. Cette étape est cependant souvent négligée, alors qu’elle est une source d’erreurs importante et peut représenter plus de 60 % du temps de l’analyse. Elle permet pourtant d’augmenter grandement les performances des méthodes analytiques car elle induit une forte préconcentration des analytes tout en permettant de purifier l’échantillon de manière à s’affranchir des nombreux effets de matrice pouvant survenir, y compris en spectrométrie de masse.

Parmi les techniques de traitement de l’échantillon disponibles, l’extraction sur phase solide (SPE, Solid Phase Extraction) est apparue comme un outil puissant pour le développement de méthodes d’analyse de composés à l’état de traces. De nombreux types de supports tels que des silices greffées ou des phases polymériques ont été développés de manière à extraire et préconcentrer les analytes par interactions hydrophobes et/ou électrostatiques. Cependant ces supports se révèlent être peu sélectifs et de nombreux composés interférents peuvent être coextraits par ceux-ci pouvant engendrer des erreurs dues à des co-élutions lors de l’étape de séparation ou à des effets de matrices affectant la détection. Ce problème d’interférences concerne tous les types de matrices, qu’elles soient environnementales, alimentaires ou biologiques. Pour pallier ce manque de sélectivité, des supports d’extraction sélective basés sur des mécanismes de reconnaissance moléculaire ont été récemment développés.

Analyse de traces dans les matrices complexes

Ces dernières années, les techniques d’analyse et d’instrumentation se sont grandement améliorées en termes de quantités d’échantillons nécessaires ainsi que de durée de séparation et de sensibilité de détection. Des progrès considérables ont en effet été réalisés du point de vue des phases stationnaires utilisées en chromatographie pour permettre l’utilisation de hauts débits de phase mobile mais aussi du point de vue de la détection avec, entre autres, le couplage des techniques séparatives et électrophorétiques avec la spectrométrie de masse. De nombreuses méthodes peuvent de ce fait être utilisées pour analyser des composés souvent à l’état de traces dans les matrices biologiques, environnementales ou alimentaires. Cependant, malgré ces avancées, la présence de composés interférents dans les matrices complexes ainsi que les faibles niveaux de concentrations recherchées dans ces dites matrices rendent souvent l’analyse du ou des composés cibles difficile. Il est donc indispensable de procéder à une étape préalable dite de préparation (ou traitement) de l’échantillon permettant de purifier la matrice et de préconcentrer le ou les analytes d’intérêt afin d’améliorer les performances globales de l’analyse.

L’extraction liquide-liquide a été l’une des premières méthodes de préparation de l’échantillon à être utilisée. Cette technique est basée sur le partage des analytes entre deux phases liquides non miscibles qui consistent généralement en une phase aqueuse (eau environnementale, sang, urine, etc) et une phase organique. Cependant, les nombreux inconvénients de cette technique tels que son caractère chronophage, le risque d’émulsion et l’utilisation de grandes quantités de solvants, nocifs pour l’environnement et dangereux pour l’expérimentateur, ont conduit à l’émergence d’autres techniques, dont l’extraction sur phase solide. Cette méthode constitue un outil puissant pour la purification et la préconcentration d’analytes contenus dans des matrices environnementales, biologiques ou alimentaires.

L’extraction sur phase solide 

L’extraction sur phase solide (SPE : Solid Phase Extraction) est une méthode de traitement de l’échantillon basée sur un principe similaire à la chromatographie liquide. Elle est basée sur le partage de composés entre une phase liquide, l’échantillon, et une phase solide, l’adsorbant. Le format le plus conventionnel consiste à conditionner l’adsorbant dans une cartouche entre deux frittés et à percoler les différentes solutions à travers la cartouche par gravité, par pression positive à l’entrée de la cartouche, par application d’un vide en sortie de la cartouche ou par centrifugation.

Principe 

La première étape est une étape de conditionnement consistant à mouiller l’adsorbant de manière à activer les sites de rétention. A la fin de cette étape, le dernier solvant utilisé doit avoir des propriétés similaires à celles de l’échantillon en termes de pH et de polarité de manière à avoir une force éluante proche de celle de l’échantillon et éviter ainsi l’élution prématurée des analytes. La deuxième étape est l’étape de percolation de l’échantillon sur l’adsorbant. Lors de cette étape, les analytes cibles sont retenus sur le support et certains interférents sont, quant à eux, éliminés. Cependant une grande partie des molécules interférentes peut présenter une forte affinité pour le support et être retenue sur celui-ci. Dans le but d’éliminer ces interférents, il est nécessaire de procéder à une troisième étape dite de lavage. Cette étape consiste à percoler, au travers de la cartouche, un ou plusieurs solvants de faible force éluante vis-a-vis des analytes cibles de façon à éluer un maximum de composés interférents sans éluer les composés recherchés. Une fois cette étape réalisée, on procède à la quatrième et dernière étape du protocole, l’élution. Lors de cette étape les analytes cibles sont élués grâce à un solvant ayant cette fois une force éluante suffisante pour rompre les interactions entre les analytes cibles et l’adsorbant.

La capacité 

Un autre paramètre important en SPE est la capacité du support [2]. Elle est directement liée au nombre de sites actifs à la surface de l’adsorbant. Lorsque la quantité d’analyte percolée est supérieure à la capacité du support, une élution anticipée de l’analyte survient même si le volume Vf de fin de fixation n’a pas été dépassé. Cependant, dans le cas de phases conventionnelles, le dépassement de capacité reste peu fréquent du fait principalement des faibles concentrations d’analytes cibles dans les échantillons en analyse de traces. La capacité d’une cartouche de SPE conventionnelle est généralement comprise entre 1 et 5 % de la masse de l’adsorbant [2, 4]. Après optimisation de la procédure d’extraction, la capacité correspond à la quantité d’analytes maximale à partir de laquelle une chute des rendements d’extraction est observée, signe de la saturation du support.

Couplage de l’extraction sur phase solide aux techniques séparatives 

L’extraction sur phase solide peut être réalisée de deux manières différentes : soit en différé, soit en ligne. Ces deux approches seront décrites successivement dans cette partie.

Extraction en différé 

Dans le cas d’une extraction en différé, la fraction d’élution obtenue en appliquant la procédure décrite en Figure 1 est collectée et injectée ensuite partiellement dans le système analytique après une éventuelle étape d’évaporation et/ou de dilution. Cette approche permet de modifier et d’optimiser facilement de nombreux paramètres, notamment la quantité d’adsorbant conditionné. De plus, il n’existe pas de contraintes de compatibilité entre la nature de l’adsorbant et le système analytique utilisé. Seule la nature du solvant de redissolution de l’extrait doit être compatible avec le système chromatographique [2]. Il s’agit également d’une approche peu onéreuse du fait de la simplicité de l’équipement nécessaire à sa réalisation. Cependant, le gros désavantage lié à cette méthode reste les risques de pollution et l’augmentation de l’incertitude sur le résultat final pouvant résulter des nombreuses étapes réalisées manuellement par un opérateur. Celles-ci comprennent des étapes telles que l’évaporation, la reprise, la dilution ou encore l’injection des diverses fractions collectées en sortie du dispositif. L’automatisation peut malgré tout limiter ces désavantages mais ne résout pas le problème de l’injection partielle de l’échantillon et les risques de pertes par évaporation.

Phases utilisées en SPE

La première étape de l’élaboration d’un protocole d’extraction est le choix du support à utiliser. Le potentiel de rétention de l’adsorbant dépend des forces d’interactions entre les analytes et les groupements fonctionnels présents à sa surface soumis à la présence du solvant constituant l’échantillon. De ce fait, le choix du support est orienté suivant le type de matrices à analyser et la nature des analytes à extraire. Une grande diversité de phases est disponible. L’adsorbant peut interagir avec les analytes par des interactions hydrophobes (apolaire-apolaire), hydrophiles (polairepolaire, liaison H, dipôle-dipôle, dipôle-dipôle induit) ou électrostatiques. On peut ainsi classer les différents types de supports selon la nature et l’intensité de ces interactions.

Les phases polaires

Les adsorbants polaires sont appropriés pour la rétention de composés à partir de matrices apolaires telles que les huiles. En effet, les solvants hydrophobes présentent une faible force éluante pour ce type de phases conférant aux analytes une forte rétention. Ce type de phases est utilisé dans les conditions qui s’apparentent à la chromatographie en phase normale. Ces adsorbants incluent des phases telles que la silice vierge, le Florisil (silicate de magnésium), l’alumine et la silice fonctionnalisée avec des groupements polaires [1, 2]. Le mécanisme de rétention d’un analyte avec ce type de phases repose sur les interactions entre les groupements polaires de l’analyte et les groupements polaires à la surface de l’adsorbant (liaisons H, les interactions dipôle-dipôle et les interactions dipôle-dipôle induit, etc). Un composé retenu grâce à ce type d’interactions sera élué en percolant un solvant plus polaire que la matrice d’origine [1].

Table des matières

1 Introduction
2 L’extraction sur phase solide
2.1 Principe
2.2 Paramètres clés de l’extraction sur phase solide
2.2.1 Volume de fin de fixation
2.2.2 La capacité
2.3 Couplage de l’extraction sur phase solide aux techniques séparatives
2.3.1 Extraction en différé
2.3.2 Extraction en ligne
2.4 Phases utilisées en SPE
2.4.1 Les phases polaires
2.4.2 Les phases apolaires
2.4.3 Les phases à échange d’ions
2.4.4 Les phases à mécanismes mixtes
2.4.4.1 Les phases mixtes
2.4.4.2 Les phases à accès restreint
2.4.4.3 Les supports à particules de grande dimension
2.4.5 Limitation des phases conventionnelles
3 Les outils sélectifs à reconnaissance moléculaire
3.1 Outils biomimétiques : les polymères à empreintes moléculaires
3.1.1 Synthèse
3.1.2 Application en SPE
3.1.3 Avantages
3.1.4 Inconvénients
3.2 Outils biologiques pour l’extraction sélective
3.2.1 Les immunoadsorbants (IS)
3.2.1.1 Les anticorps
a Structure
b Production
3.2.1.2 Immobilisation des anticorps
a Les supports d’immobilisation
b Méthodes d’immobilisation
3.2.1.3 Procédures d’immunoextraction
a Développement d’une procédure en différé
a-1 Nature de l’échantillon percolé et étape de lavage
a-2 Conditions d’élution
b Contrôle de la sélectivité de la procédure d’immunoextraction
c Couplage en ligne
3.2.1.4 Caractéristiques des immunoadsorbants
a Taux de greffage
b Capacité
c Rendements d’extraction
d Réactivité croisée et spécificité
3.2.1.5 Régénération et réutilisation
3.2.1.6 Apport en sélectivité des immunoadsorbants
a Immunoadsorbants appliqués aux petites molécules
b Immunoadsorbants appliqués aux protéines
3.2.2 Les oligoadsorbants (OS)
3.2.2.1 Les aptamères
a Structure
a-1 Structure primaire
a-2 Structure secondaire
a-3 Structure tertiaire
b La sélection des aptamères
b-1 Principe général de la sélection in vitro
b-2 Les bibliothèques d’oligonucléotides
b-3 Etape de sélection
b-4 Etape d’amplification
b-5 Automatisation et miniaturisation du procédé SELEX
c Caractéristiques des aptamères
3.2.2.2 Immobilisation des aptamères
a Immobilisation non-covalente
b Immobilisation covalente
3.2.2.3 Procédure d’oligoextraction
a Nature de l’échantillon percolé
b Conditions d’élution
c Contrôle de la sélectivité de la procédure d’extraction
3.2.2.4 Potentiel des Oligoadsorbants
a Capacité et densité d’immobilisation
b Rendements d’extraction
c Réactivité croisée
3.2.2.5 Apport en sélectivité des oligoadsorbants
a Oligoadsorbants appliqués aux petites molécules
b Oligoadsorbants appliqués aux protéines
3.2.2.6 Régénération et réutilisation
3.2.3 Conclusions
4 Miniaturisation des outils analytiques
4.1 Modes de contrôle de l’écoulement et phases utilisées
4.1.1 Contrôle de l’écoulement dans les systèmes miniaturisés
4.1.1.1 Intérêt de l’approche électrocinétique
4.1.1.2 Intérêt de l’approche hydrodynamique
4.1.2 Les phases utilisées dans les systèmes miniaturisés
4.1.2.1 Approches en tube ouvert
4.1.2.2 Phases basées sur des structures microfabriquées
4.1.2.3 Phases particulaires
a Conditionnement dans des colonnes capillaires
b Conditionnement dans les canaux de microsystèmes
4.1.2.4 Phases monolithiques
a Les monolithes organiques
b Les monolithes inorganiques
4.2 Miniaturisation des supports de SPE conventionnels
4.3 Miniaturisation des outils bioanalytiques
5 Conclusion

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