Organisation génétique des pili chez les Gram-positifs

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Identification des pili chez les bactéries Gram-positif

Comme indiqué précédemment, les premières identifications de structures fibrillaires à la surface de bactéries Gram-positif datent des années 1970. L’observation par microscopie électronique de souches de Corynebacterium diphtheriae met en évidence des structures flexibles et très fines, de diamètre compris entre 2.5-3.5 nm et de longueur variant entre 0.2- 1.6 µm (Yanagawa et Honda 1976). Dans les années 1980, des pili sont observés à la surface de spores de Bacillus cereus mais ce n’est qu’au début des années 2000 que ce champ d’activité prend de l’ampleur et que les premières études génétiques et moléculaires sont réalisées chez C. diphtheriae, Actinomyces naeslundii, S. agalactiae, S. pyogenes, E. faecalis et B. cereus (Ton That 2003, Wu 2001, Lauer 2005, Mora 2005, Nallaparedy 2006, Budzik 2007).

Identification des pili chez le pneumocoque

En 2002, l’équipe de Camilli effectue un crible d’insertion de 6149 transposons dans la souche TIGR4 et identifie des éléments déterminants pour la virulence de la bactérie dans des modèles murins de pneumonie (Hava 2002). Parmi ces facteurs de virulence, un opéron de 12 kb flanqué de séquences d’insertion attire leur attention car les sept gènes composant cet îlot génétique présentent des similarités de séquences avec des éléments déjà connus. Cet îlot est nommé rlrA, pour Rof-like régulateur car le gène rlrA, codé de façon divergente par rapport aux autres gènes, est un homologue du régulateur RofA chez S. pyogenes. Cet opéron est qualifié a posteriori PI-1 (Pathogenicity Islet-1), car un second pilus PI-2 a été identifié en 2008 (Bagnoli 2008). Par souci de clarté, nous utiliserons dans ce manuscrit la dénomination PI-1.
Les trois gènes en aval de rlrA présentent une similarité de séquences avec la famille des MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) et codent pour des protéines à motif LPxTG. Ceux-ci sont nommés rrgA, rrgB et rrgC (pour RlrA-Regulated gene). Les trois derniers gènes de l’opéron codent pour des sortases. Etant donné la présence de la sortase ménagère SrtA, ces trois sortases supplémentaires sont dénommées srtB, srtC et srtD lors de leur identification (Barocchi 2006). La classification des sortases proposée par S. Dramsi en 2005 permet de classer ces trois sortases dans la classe C, c’est la raison pour laquelle nous utiliserons cette nomenclature : srtB, srtC et srtD sont dorénavant dénommés respectivement srtC-1, srtC-2 et srtC-3. Le rôle de cet opéron dans la formation des pili chez le pneumocoque est démontré en 2006 par observation en microscopie électronique de souches TIGR4 (Barocchi 2006) (Fig.13 et 14).
Comme déjà mentionné, un opéron codant pour un second pilus, PI-2, a été identifié dans la souche clinique INV104 (Bagnoli 2008) (Fig.14). Cinq gènes sont présents dans cet élément génétique de 6575 pb et certains d’entre eux présentent une similarité de séquence avec les éléments du pilus FCT-3 identifié chez S. pyogenes (Mora 2005, Telford 2006). Le premier gène code pour la protéine PitA, similaire à l’adhésine de FCT-3. pitA est suivi par deux éléments génétiques fonctionnellement dépendants, sipA et pitB. Il est proposé que SipA soit une signal peptidase s’associant à la piline majeure PitB. Enfin, les deux derniers gènes identifiés codent pour deux sortases, SrtG1 et SrtG2 (Bagnoli 2008).
PI-1 n’est présent que dans 30 % des souches de pneumocoque et dans 50% des souches résistantes aux antibiotiques (Aguiar 2008, Moschioni 2008). La présence du PI-2 est associée aux sérotypes non vaccinaux émergeants avec une distribution d’environ 16% dans une collection de 305 isolats cliniques (Bagnoli 2008).

Organisation génétique des pili chez les Gram-positifs

Le nombre croissant de génomes bactériens séquencés permet de comparer l’organisation génétique des opérons codant pour les pili et de tenter d’en extraire des informations concernant les mécanismes d’assemblage et/ou la fonction de certaines pilines et sortases (Fig.14). L’expression « piline majeure » désigne la sous-unité constituant la fibre du pilus et « piline accessoire » une autre protéine associée au pilus. Ces notions seront décrites de façon plus détaillée dans la suite du manuscrit.
Un gène codant pour la piline accessoire 1 et pour la piline majeure sont présents dans toutes les espèces bactériennes étudiées, ce qui n’est pas le cas de la piline accessoire 2, suggérant une fonction essentielle uniquement pour les deux premières pilines (Fig.14). Le nombre de sortases est variable, une ou deux sortases sont communément retrouvées par opéron. Le cas du pneumocoque, qui présente trois sortases dans le PI-1 reste actuellement unique. Cette observation résume à elle seule une question importante concernant le mode d’action des sortases et leur spécificité de substrat : comment une seule sortase peut-elle catalysée l’association covalente de deux, voire de trois pilines ? Réciproquement, pourquoi trois sortases sont-elles nécessaires à l’assemblage du pilus chez le pneumocoque ? Un gène codant pour un régulateur de l’opéron de type rofA (M1 de S. pyogenes) est identifié chez S.

La fonction des pili

Chez le pneumocoque

Comme décrit dans le chapitre II, le pneumocoque a développé un grand nombre de facteurs lui permettant de survivre dans des environnements de nature variée, d’augmenter sa capacité à envahir l’organisme hôte ou encore d’échapper au système immunitaire. Etant donnée sa localisation en surface et les similarités de séquences des pilines accessoires 1 avec les MSCRAMMs, le pilus peut potentiellement jouer un rôle dans la virulence de la bactérie. L’utilisation de souches TIGR4 de type sauvage et mutante pour la délétion de l’îlot de pathogénécité PI-I indique que la souche mutante est moins virulente que la souche sauvage dans des modèles murins de colonisation, de pneumonie et de bactériémie. Ce défaut de virulence est restauré lorsque l’expression de l’îlot PI-1 est complémenté (Barocchi 2006). Par ailleurs, l’infection intra-péritonéale de souris par la souche TIGR4 conduit à une réponse inflammatoire TNF élevée dans laquelle le pilus PI-1 paraît jouer un rôle (Barocchi 2006). Dans un modèle cellulaire in vitro, l’introduction de PI-1 dans des souches encapsulées D39 (souches de pneumocoque naturellement dépourvues de PI-I) augmente la capacité de la bactérie à adhérer aux cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 (Barocchi 2006). Ces données indiquent que le pilus peut être qualifié de facteur de virulence car impliqué dans la colonisation des tissus épithéliaux par le pneumocoque mais également dans les processus pathologiques.
Les premiers éléments de réponse concernant l’identification des composants du pilus directement impliqués dans ces fonctions d’interactions avec l’hôte proviennent des cribles STM (Signature Tagged Mutagenesis) réalisés par Hava en 2002. Dans cette étude, l’utilisation d’un mutant TIGR4ΔrlrA conduit à un défaut de virulence localisée dans le nasopharynx. Or, ce régulateur contrôle l’expression de tous les gènes du PI-1 (voir chapitre suivant) ce qui suggère qu’au moins l’un d’entre eux est impliqué dans l’interaction de la bactérie avec les muqueuses de l’appareil respiratoire. L’analyse de simple et double mutants indique que seules les souches présentant des transposons insérés dans rrgA ou srtC-3 montrent des défauts de virulence dans un modèle murin de compétition au niveau des poumons, alors que des défauts de colonisation sont observés chez les doubles mutants rrgA et srtC-1 (Hava 2002).
Ces travaux préliminaires identifiant RrgA comme un élément important dans la fonction d’adhésion du pneumocoque ont été confirmés ultérieurement. La souche TIGR4ΔrrgA présente un taux d’adhérence aux cellules épithéliales A549 huit fois moins élevé que la souche sauvage ou la souche TIGR4ΔrrgBC, qui par ailleurs présentent toutes deux des niveaux d’adhérence comparables (Nelson 2007). Par contre, dans une souche TIGR4 exprimant une copie supplémentaire de rrgA, l’adhérence est plus élevée d’un facteur 1,6 par rapport à la souche parentale (Nelson 2007). D’autre part, la forme recombinante de la protéine RrgA adhère directement aux cellules respiratoires et peut entrer en compétition avec la bactérie piliée pour l’interaction avec les récepteurs cellulaires (Nelson 2007). Hilleringmann et ses collaborateurs montrent par ailleurs par des tests d’interaction en phase solide que la protéine recombinante RrgA reconnaît des composants de la matrice extracellulaire dont la fibronectine, le collagène I et la laminine (Hilleringman 2008). En conclusion, RrgA porte les fonctions adhésives du pilus envers les tissus humains, en reconnaissant des récepteurs cellulaires dont la nature reste encore méconnue. RrgA semble également interagir avec des composants de la bactérie car son rôle dans la formation de biofilms a aussi été montré (Munoz-Elias 2008).

Chez d’autres bactéries Gram-positives

Comme décrit pour le pneumocoque, la majorité des pili exprimés à la surface des bactéries Gram-positif interviennent dans les étapes d’adhérence aux cellules de l’organisme hôte. Chez C. diphteriae, les pilines SpaB et SpaC du pilus spaABC sont impliquées dans l’adhérence de la bactérie aux cellules épithéliales humaines évoquant un rôle lors de l’étape de colonisation (Mandlik 2007). D’autre part, le taux d’adhérence est dépendant du type cellulaire employé indiquant une fonction possible du pilus de C. diphteriae dans le tropisme cellulaire (Mandlik 2007). Les pili exprimés en surface de la souche M1 de S. pyogenes permettent l’adhésion des bactéries à des cellules épithéliales issues d’amygdales mais aussi à des kératinocytes, ces deux tissus représentant les deux principaux sites d’infections de S. pyogenes chez l’homme (Abbot 2007). Le rôle du pilus dans la formation de biofilms a été également décrit chez S. pyogenes (Manetti 2007). Bien que la fonction des pili demeure encore imprécise et étudiée principalement dans des modèles cellulaires in vitro ou des modèles murins d’infection, les pili sont exprimés in vivo dans l’organisme hôte comme le montre l’exemple de patients ayant déclarés une pharyngite à S. pyogenes et chez lesquels des anticorps anti-piline ont été détectés (Manetti 2007).

Régulation transcriptionnelle du PI-1 chez S. pneumoniae

rlrA : l’activateur

Dès l’identification de l’îlot de pathogénécité PI-1, la fonction de régulateur transcriptionnel positif du gène rlrA est proposé (Hava 2002). En effet, lorsque ce gène est muté ou délété, le niveau des ARNm de chacun des 6 gènes du PI-1 est drastiquement diminué (Hava 2002). De plus, chez une souche contenant une seconde copie de rlrA inductible au maltose, la même équipe a montré par des expériences de « RNAse Protection Assay » qu’en présence de maltose, les quantités d’ARNm du gène rlrA natif sont plus importantes, indiquant que RlrA a aussi une capacité d’autoactivation (Hava 2003). Il n’est cependant toujours pas connu quels sont les facteurs qui agissent sur l’expression de rlrA luimême.
La transcription du PI-1 est initiée au niveau de quatre sites promoteurs différents, placés en amont de chacun des gènes rlrA, rrgA, rrgB et srtC-1. Ces informations suggèrent que les autres gènes de l’opéron, rrgC, srtC-2 et srtC-3 sont probablement co-transcrits à partir d’un promoteur distal. Trois des quatre sites de fixation de RlrA (riches en AT) ont été identifiés et ont permis de déterminer la séquence consensus suivante : AYNTTTTTATCAA (Hava 2002). Cette séquence consensus de fixation de RlrA a été retrouvée dans 153 autres sites du génome de TIGR4 : 29 sont présents dans des régions promotrices et 14 sont localisés à 70 pb en amont d’un site d’initiation de transcription (Hava 2002). Cette étude suggère que l’expression d’un grand nombre de gènes, autres que ceux du locus PI-1, est également sous la dépendance de RlrA.

mgrA : le répresseur

En 2003, Camilli et son équipe identifient par criblage STM de la souche TIGR4 un régulateur transcriptionnel codé par le locus sp1800 (Hemsley 2003). Ce gène est appelé mgrA (pour Mga-like repressor A) en raison des 51% de similarité et 25% d’identité qu’il présente avec le régulateur mgA présent chez les streptocoques de groupe A. Contrairement à son orthologue, le régulateur MgrA n’affecte aucunement les gènes de son environnement proche. En revanche, des gènes éloignés dans le génome sont surexprimés chez un mutant de délétion mgrA: il s’agit de l’opéron PI-1 (Hemsley 2003). Les auteurs proposent que MgrA pourrait agir soit sur chaque site promoteur de l’îlot soit uniquement sur rlrA ce qui affecterait indirectement les autres gènes du PI-1. La répression de l’expression du PI-1 par MgrA a été validée par Barrochi et ses collaborateurs en 2006 car l’analyse par FACS et par microscopie électronique à transmission de la souche TIGR4ΔmgrA montre que celle-ci produit une quantité plus importante de pili que la souche sauvage (Barrochi 2006) (Fig.13).

Les autres régulateurs du PI-1 chez le pneumocoque

Chez toutes les bactéries, l’homéostasie des ions divalents est essentielle à leur survie et/ou à leur croissance. Selon les différents compartiments de l’hôte, les concentrations locales en ions peuvent être extrêmement variables : à titre d’exemple, la concentration en Mn²+ dans la salive est de 36µM contre 20nM dans le sérum et le plasma. C’est la raison pour laquelle les microorganismes possèdent des systèmes de transport finement régulés de ces solutés.
Chez S. pneumoniae, le transport de Mn²+ est réalisé par une perméase de type ABC codée par les gènes psaBCA. Le Mn²+ est critique pour de nombreux processus métaboliques de la bactérie ce qui explique que l’inactivation de l’un des gènes de l’opéron psaBCA mène à d’importants défauts de virulence et à une limitation de la croissance bactérienne (McAllister 2004). Cet opéron est régulé par une protéine PsaR, qui agit uniquement lorsque la concentration en Mn²+ est importante. De façon intéressante, PsaR présente également un effet au niveau des gènes du PI-1 qui se traduit par une répression transcriptionnelle du régulateur rlrA conduisant donc à une diminution de l’expression des pili (Johnston 2006). PsaR agit comme un senseur du Mn²+ de l’environnement bactérien, il est possible de proposer les mécanismes suivants de régulation de l’expression des gènes du pilus : dans des compartiments comme le nasopharynx où la concentration en Mn²+ est supposée importante, PsaR aurait un effet négatif sur la transcription des gènes du PI-1, à l’inverse, dans des compartiments pauvres en Mn²+ comme les poumons ou la circulation sanguine, PsaR serait inactif permettant alors l’expression des gènes du PI-1.
D’autres éléments, également connus pour être des senseurs de l’environnement bactérien et contrôlant l’expression des gènes, sont proposés réguler les gènes de l’îlot rlrA : les systèmes à deux composantes TCS08 et TCS09 (Song 2009, Hendriksen 2007). De façon générale, les TCS sont composés par une protéine membranaire, HK Histidine Kinase qui est le senseur de l’environnement et une protéine RR cytoplasmique, régulatrice de la réponse. En réponse à la stimulation de la protéine HK, la protéine RR est phosphorylée et se lie aux promoteurs des gènes cibles. Le génome du pneumocoque contient 13 TCS complets et un régulateur orphelin (Lange 1999, Tettelin 2001). Des travaux ont montré que le système à deux composants TCS08 est un élément essentiel dans les processus de croissance et de survie du pneumocoque in vivo (Throup 2000). En 2009, l’équipe de Song constate que la double délétion des gènes rr08 et hk08 ou la simple délétion de la composante régulatrice rr08 induit la surexpression des gènes du pilus de deux à sept fois supérieure à celle observée chez la souche sauvage, ce qui suggère que ce système TCS08 régule négativement les gènes du PI-1. Par ailleurs, cette régulation a la particularité d’être plus marquée durant la phase de croissance logarithmique tardive (Song 2009).
Le système TCS09 a également pour cible le PI-1 (Hendrinsken 2007). L’étude, réalisée avec un mutant de délétion rr09, a permis de comparer les profils d’expressions de rrgA et rlrA en fonction du milieu dans lequel les bactéries sont cultivées (répression en THY et surexpression BHI) mais également en fonction de la phase de croissance considérée (une forte répression à des densités optiques faibles et une surexpression lors des phases plus tardives). Dans un model murin d’infection comparant TIGR4 et TIGR4Δrr09, les niveaux d’expression de rrgA s’avèrent 10 à 90 fois plus élevé dans la souche sauvage, ce qui suggère bien que RR09 présente un effet activateur de l’expression du PI-1.

Table des matières

TABLE DES ILLUSTRATIONS
INTRODUCTION
I Streptococcus pneumoniae
I.1 Présentation générale
I.1.1 Classification
I.1.2 Caractéristiques biologiques
I.2 La paroi bactérienne
I.2.1 La paroi de S. pneumoniae
I.2.1.1 Le peptidoglycane
I.2.1.2 Les acides teïchoiques et lipoteïchoiques
I.2.2 La capsule de S. pneumoniae
I.3 Données épidémiologiques
I.3.1 Prophylaxie
I.3.2 Moyens curatifs
I.3.3 Difficultés rencontrées dans le traitement et la prévention des infections à pneumocoque
I.3.3.1 Résistance aux antibiotiques
I.3.3.2 Les limites de la protection vaccinale
II. La pathogénicité du pneumocoque
II.1 La capsule
II.2 La pneumolysine
II.3 Les protéines de surface et leur rôle dans la virulence
II.3.1 La GAPDH : un exemple de protéine « moonligthing »
II.3.2 CBPE : un exemple de Choline-Binding Protein
II.3.2.1 Structure de la protéine
II.3.2.2 Rôle de la protéine dans la virulence
II.3.3 AdcAII : un exemple de lipoprotéines
II.3.3.1 Structure de la protéine
II.3.3.2 AdcAII est une adhésine
II.3.4 les protéines LPxTG
II.3.4.1 Topologie des protéines LPxTG
II.4 Les sortases
II.4.1 La sortase A de S. aureus
II.4.1.1 Identification
II.4.1.2 Le mécanisme de transpeptidation
II.4.1.3 Structure tridimensionnelle
II.4.1.4 Paramètres enzymatiques
II.4.2 La classification des sortases chez les bactéries Gram-positif
II.4.3 Les enzymes sortases chez S. pneumoniae
III. Structure et fonction des pili
III.1 Identification des pili chez les bactéries Gram-positif
III.1.1 Identification des pili chez le pneumocoque
III.1.2 Organisation génétique des pili chez les Gram-positifs
III.2 La fonction des pili
III.2.1 Chez le pneumocoque
III.2.2 Chez d’autres bactéries Gram-positives
III.3 Régulation transcriptionnelle du PI-1 chez S. pneumoniae
III.3.1 rlrA : l’activateur
III.3.2 mgrA : le répresseur
III.3.3 Les autres régulateurs du PI-1 chez le pneumocoque
III.4 Les pilines
III.4.1 Pilines majeures
III.4.2 Pilines accessoires
III.4.3 Des ponts intramoléculaires covalents au sein des pilines
III.4.4 Organisation structurale des pili
III.5 Structure et assemblage du pilus chez S. pneumoniae
III.5.1 Les pilines du PI-1
III.5.2 Modèles d’assemblage du pilus chez S. pneumoniae
III.6 Rôle des sortases
II.6.1 C. diphtheriae : les premiers éléments de réponse
III.6.2 Pourquoi trois sortases chez S.pneumoniae ?
III.6.2.1 la polymérisation de RrgB
III.6.2.2 l’incorporation des pilines accessoires
III.6.2.3 les structures des sortases de classe C
III.7 Conclusion
MATERIELS & METHODES
I. Souches, vecteurs et milieux de culture
I.1 Les souches
I.2 Les vecteurs
I.3 Les constructions
I.3.1 Constructions dans le vecteur pLIM01
I.3.2 Constructions dans les vecteurs pETDuet®, pACYCDuet® et pCDFDuet®
I.3.4 Récapitulatif des vecteurs construits pour cette étude
I.3.5 Récapitulatif des souches d’expression réalisées pour cette étude
I.4 Milieux de culture et antibiotiques
I.4.1 Milieux de culture
I.4.2 Antibiotiques
II. Techniques de biologie moléculaire
II.1 Clonage
II.2 Mutagenèse
II.3 Préparation des cellules « Ultra-compétentes » E. coli STAR
II.4 Transformation des cellules compétentes
II.5 Mini préparation plasmidique et séquençage
III. Techniques biochimiques
III.1 Production des protéines recombinantes en grand volume
III.2 Production des protéines recombinantes en mini-cultures
III.3 Purification des protéines recombinantes
III.4 Minipurification des surnageants de co-expressions
III.5 Analyses des protéines
III.5.1 Analyse des protéines par électrophorèse en conditions dénaturantes
III.5.2 Coloration des protéines au bleu de Coomassie
III.5.3 Transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose
III.5.4 Immunorévélation des protéines sur membrane de nitrocellulose
III.5.7 Tests de stabilité par protéolyse à la trypsine et séquençage N-terminal
III.5.8 Tests de stabilité par Thermal Shift Assay (TSA)
IV Principes
IV.1 Principe du Thermal Shift Assay
IV.2 Principe de la plateforme de co-expression chez E. coli
PRESENTATION DES TRAVAUX
RESULTATS
I. Analyse structurale des pilines de S. pneumoniae
I.1 Structure de la piline accessoire RrgA
I.1.1. Bases structurales de la fonction d’adhésion de RrgA
I.1.2. Repliements de type IgG et CNA
I.1.3. Identification de deux ponts intramoléculaires dans RrgA
I.1.4. Rôle de stabilisation des ponts intramoléculaires
I.1.5. Analyse de la protéine recombinante RrgA par microscopie électronique à transmission
I.1.6. Production du domaine D4
I.2 Etude de la piline accessoire RrgC
I.2.1. Topologie de RrgC
I.2.2. Mise en évidence des ponts intramoléculaires de RrgC
I.2.3. Les deux ponts intramoléculaires stabilisent RrgC
I.2.3.1 Sensibilité à la digestion protéolytique
I.2.3.2 Stabilité thermique
I.3 Etude de la piline majeure RrgB
I.3.1. Topologie de RrgB
I.3.2. Mise en évidence des ponts intramoléculaires de RrgB
I.3.3. Les trois ponts intramoléculaires stabilisent RrgB
I.3.3.1 Sensibilité à la digestion protéolytique
I.3.3.2 Stabilité thermique
I.3.4. Structure cristallographique de la piline majeure RrgB
I.4 Conclusions concernant l’étude individuelle des pilines
II. Détermination du rôle des sortases
II.1 Fonction de la sortase C-1
II.1.1 La sortase C-1 associe covalement RrgB et RrgC
II.1.2 La sortase C-1 reconnaît le motif IPQTG de RrgB
II.1.3 Les ponts intramoléculaires de RrgB jouent un rôle dans l’efficacité de reconnaissance des pilines par la SrtC-1
II.1.4 Conclusion
II.2 Fonction de la sortase C-2
II.2.1. La SrtC-2 catalyse deux complexes covalents différents
II.2.2. La SrtC-2 reconnaît le motif YPRTG de RrgA et le motif IPQTG de RrgB
II.2.3. Substrat privilégié de la SrtC-2 : le motif YPRTG de RrgA
II.2.4. Liaison intermoléculaire entre RrgA-RrgB
II.2.5. Rôle des ponts isopeptidiques dans la formation du complexe RrgA-RrgB
II.2.6. SrtC-2 forme un complexe acyl-enzyme stable avec RrgA
II.2.7. SrtC-2 multimérise le domaine D4 de RrgA
II.2.8. SrtC-2 multimérise RrgA
II.2.9 Conclusions concernant l’activité de la SrtC-2
II.3 Fonction de la SrtC-3
II.3.1. La SrtC-3 catalyse deux complexes: RrgB-RrgA et RrgB-RrgC
II.3.2. La SrtC-3 reconnaît le motif IPQTG de RrgB
II.3.3. La SrtC-3 forme un complexe acyl-enzyme stable avec RrgC
II.3.4 Conclusions concernant l’activité de la SrtC-3
DISCUSSION & PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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