Organisation générale de l’enveloppe des bactéries gram-négatives : les facteurs de la résistance intrinsèque

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Klebsiella spp

Le genre Klebsiella regroupe actuellement cinq espèces toutes immobiles et généralement encapsulées. D’un point de vue biochimique, elles produisent une lysine décarboxylase mais pas d’ornithine décarboxylase, sont oxydase négatives, catalase positives, indole et uréase positives (Drancourt, 2000).
Les Klebsiella sont bien connues des cliniciens comme agents de pneumonies communautaires. Toutefois, la grande majorité des infections à Klebsiella est associée au secteur hospitalier (Podschun & Ullmann, 1998). En tant que pathogènes opportunistes, Klebsiella spp. infectent préférentiellement les individus immunodéprimés ou présentant une pathologie sous-jacente sévère telle que le diabète. Chez l’homme, K. pneumoniae est une espèce saprophyte présente dans le tractus intestinal et le nasopharynx, mais elle représente aussi l’espèce la plus importante du genre sur le plan médical, à l’origine des infections nosocomiales. A un moindre degré, K. oxytoca est également isolée à partir de prélèvements humains. En 1998, on estimait que Klebsiella spp. représentaient 8 % des infections nosocomiales aux Etats-Unis et en Europe, le tractus urinaire constituant le site d’infection le plus fréquent (Podschun & Ullmann, 1998). Le fait le plus inquiétant est l’émergence de souches multirésistantes aux antibiotiques, responsables de véritables épidémies nosocomiales. En effet, depuis les années 80, la production de β–lactamases à spectre étendu (BLSE) rend les souches résistantes à une large gamme de β–lactamines y compris des céphalosporines de 3ème génération (De Champs et al., 1991 ; Bauernfeind et al., 1993 ; Bradford, 2001 ; Karlowsky et al., 2003). En Europe, les BLSEs produites par Klebsiella sont de type SHV-5, alors qu’aux Etats-Unis il s’agit surtout des enzymes TEM-10 et TEM-12 (Podschun & Ullmann, 1998). L’incidence de ces isolats de K. pneumoniae producteurs de BLSEs a été estimée à 5 % aux Etats-Unis (Jacoby, 1996). En Europe, cette fréquence est plus élevée, atteignant les 15 % en France et au Royaume-Uni (Sirot, 1995). Les BLSEs ont une origine plasmidique ; ces plasmides sont facilement transmissibles au sein des entérobactéries et sont très stables par les avantages qu’ils offrent à la survie des bactéries en milieu hospitalier. La production de BLSEs est associée à un phénotype multirésistant et limite donc les possibilités thérapeutiques. A ce  jour, la plupart les isolats de K. pneumoniae producteurs de BLSEs restent sensibles aux β–lactamines de la famille des carbapénèmes (imipénème et méropénème). Néanmoins, des souches de K. pneumoniae résistantes à l’imipénème ont été observées récemment et leur développement est très surveillé (Bradford et al., 1997 ; Hasdemir et al., 2004).
Les facteurs de pathogénicité ont été étudiés chez K. pneumoniae et comportent les adhésines qui entraînent une hémo-agglutination, la résistance au pouvoir bactéricide des anticorps, les antigènes capsulaires qui déterminent 77 sérotypes, les antigènes du polyliposaccharide qui déterminent 8 sérotypes et les sidérophores (Drancourt, 2000).
Depuis une quinzaine d’années, on note en France une diminution constante de la représentation de K. pneumoniae au profil d’une autre entérobactérie, Enterobacter aerogenes (source C-CLINs).

Enterobacter spp

Le genre Enterobacter est très proche du genre Klebsiella mais s’en distingue par sa mobilité et ses caractéristiques biochimiques : généralement ornithine décarboxylase positif et uréase négatif. Le genre Enterobacter regroupe actuellement 14 espèces ; parmi elles E. cloacae (espèce type du genre) et E. aerogenes sont les espèces pathogènes pour l’homme les plus fréquemment isolées en clinique (Farmer, 1985 ; Sanders & Sanders, 1997).
Le genre Enterobacter a pris ces dernières années une importance croissante du fait de son émergence comme agent nosocomial et de sa capacité à acquérir des mécanismes de résistance aux antibiotiques. En milieu hospitalier, le risque de colonisation et d’infection est associé à plusieurs facteurs : l’hospitalisation elle-même qui entraîne une modification de la flore intestinale du patient, l’immunodépression quelle que soit son origine (traitements médicamenteux, situations post-opératoires, patients âgés, VIH…), la pose d’appareillages médicaux invasifs (cathéters veineux ou urinaires), et surtout la prise d’antibiotiques.
En tant que pathogènes nosocomiaux émergents, on connaît encore très mal les facteurs de pathogénicité et de virulence d’Enterobacter spp., en dehors de l’endotoxine commune à toutes les bactéries gram-négatives (Bone, 1993). La plupart des aspects épidémiologiques des infections à Enterobacter reflètent plus le caractère opportuniste que la virulence intrinsèque du microorganisme. En effet, la « pathogénicité » d’Enterobacter spp. et leur prévalence comme pathogènes nosocomiaux résident dans leur niveau de résistance aux agents antibactériens (désinfectants et antibiotiques), considéré comme le plus élevé parmi toutes les entérobactéries (Sanders & Sanders, 1997).

Enterobacter cloacae

C’est l’espèce type du genre Enterobacter. Les souches sont ornithine décarboxylase positives, arginine décarboxylase positives et lysine décarboxylase négatives. Elles fermentent le D-sorbitol, le saccharose et la mélibiose (Farmer, 1985).
E. cloacae possède une pénicillinase chromosomique constitutive ainsi qu’une céphalosporinase chromosomique inductible, qui rendent compte de sa résistance naturelle à de nombreuses β–lactamines. En 1989, De Champs et collaborateurs décrivent les premiers cas d’infections nosocomiales à des souches productrices d’une BLSE, entraînant un niveau de résistance élevé aux céphalosporines de 3ème génération (De champs et al., 1989). Les céphalosporines de « 4ème génération » (céfépime et cefpirome) ainsi que les carbapénèmes (imipénème et méropénème), diffusant très rapidement à travers la membrane externe, restent le plus souvent actifs.
La présence de facteurs de virulence chez E. cloacae est peu documentée. Deux groupes ont pourtant mis en évidence la production d’un sidérophore, l’aérobactine, une capacité d’hémo-agglutination et une activité hémolytique dans plusieurs isolats cliniques (Barnes et al., 1996 ; Keller et al., 1997). Une de ces études a abouti à la purification et à la caractérisation biochimique d’une cytotoxine de 13 kDa, proche de celle de Shigella (Barnes et al., 1996 ; Paton & Paton, 1996). L’expression de facteurs de virulence représente une valeur ajoutée pour des pathogènes opportunistes, en leur permettant de s’adapter à la vie dans l’hôte.

Enterobacter aerogenes

Cette espèce est phénotypiquement et génotypiquement très proche de K. pneumoniae. Elle est mobile, ornithine décarboxylase positive, uréase et indole négative (Farmer, 1985).
Avant 1993, E. cloacae était l’espèce du genre Enterobacter la plus fréquemment isolée à partir de prélèvements cliniques humains et E. aerogenes n’était alors que très rarement retrouvée (Gaston, 1988). Depuis 1995, cette tendance s’est inversée et E. aerogenes a émergé en tant qu’agent d’infections nosocomiales important et des souches multirésistantes aux antibiotiques sont à l’origine de nombreux épisodes épidémiques en France (Arpin et al., 1996 ; Davin-Régli et al., 1996, Neuwirth et al., 1996 ; Albertini et al., 2002 ; Arpin et al., 2003 ; Lavigne et al., 2004), mais aussi en Belgique (De Gheldre et al., 2001 ), en Espagne (Cantòn et al., 2002 ; Salso et al., 2003) et aux Etats-Unis (Streit et al., 2004). En France, E. aerogenes représente aujourd’hui la 3ème cause d’infections urinaires et est fréquemment associée à des infections respiratoires et gastro-intestinales en unités de soins intensifs (Bornet et al., 2000a). Cette espèce est naturellement résistante aux aminopénicillines, aux céphamycines et aux  premières céphalosporines par l’intermédiaire d’une pénicillinase et d’une céphalosporinase chromosomiques. La dé-répression de la céphalosporinase chromosomique ou l’acquisition d’une BLSE plasmidique lui confère un haut niveau de résistance vis-à-vis des dernières céphalosporines jusqu’ici actives. Depuis une dizaine d’années, de nombreuses études rendent compte de l’évolution de la résistance chez E. aerogenes et de sa capacité à acquérir des mécanismes de résistance efficaces lui permettant de s’adapter à l’environnement hospitalier (Charrel et al., 1996 ; Malléa et al., 1998 ; Sirot et al., 2002 ; Karlowsky et al., 2003 ; Wenzel et al., 2003). Les premiers isolats d’E. aerogenes porteurs de BLSE de type TEM-24 ont été isolés et caractérisés en 1988 dans l’hôpital universitaire de Clermont-Ferrand (De Champs et al., 1991). Aujourd’hui la grande majorité des isolats d’E. aerogenes expriment cette enzyme et correspondent en fait à un seul et même clone qui s’est répandu dans les hôpitaux français (Bosi et al., 1999 ; Dumarche et al., 2002). Une rétrospective chronologique des enquêtes menées en France donne une bonne illustration de la dissémination de ce clone. En 1994, Davin-Régli et coll. recueillent 185 isolats d’E. aerogenes à l’hôpital de Ste Marguerite à Marseille et mettent en évidence la prévalence d’un clone producteur de BLSE de type TEM-24 (Davin-Régli et al., 1996). En 1996, Arpin et coll. rapporte une épidémie dans l’hôpital Pellegrin à Bordeaux causée par des souches d’ E. aerogenes résistantes à la ceftazidime et produisant une BLSE de type TEM ou SHV (Arpin et al., 1996). Toujours en 1996, Neuwirth et coll. caractérisent 10 isolats d’ E. aerogenes recueillis dans l’hôpital Bocage à Dijon. Tous appartiennent à un même clone producteur de BLSE de type TEM-24 (Neuwirth et al., 1996). En 1999, Bosi et coll. établissent la prévalence de ce clone dans 23 hôpitaux français (Bosi et al., 1999). Depuis 2000, la dissémination à long terme de ce clone dans les hôpitaux français est confirmée (Galdbart et al., 2000 ; Dumarche et al., 2002). Pour E. aerogenes, l’acquisition de TEM-24 comme mécanisme de résistance à l’action des céphalosporines à large spectre représente un facteur sélectif à l’origine de ses capacités d’adaptation et de dissémination. Le grand plasmide (environ 85-kb) codant TEM-24 confère également une résistance aux sulfamides, au chloramphénicol et aux aminoglycosides (Marchandin et al., 2000). Depuis quelques années, ce clone est isolé lors d’épidémies nosocomiales en Belgique et en Espagne (De Gheldre et al., 2001 ; Cantòn et al., 2002).
La situation épidémiologique des Enterobacteriaceae est très dynamique et représente un problème grandissant. Le plasmide TEM-24 a été détecté dans d’autres espèces bactériennes de la famille des Enterobacteriaceae (K. pneumoniae, S. marcescens, E. coli et Proteus spp.) mais aussi dans Pseudomonas aeruginosa co-isolées avec E. aerogenes en clinique (Marchandin et al., 1999 ; Marchandin et al., 2000 ; Neuwirth et al., 2001). Cela résulte d’un transfert horizontal inter-espèces. Le clone d’E. aerogenes producteur de TEM-24 est donc une double menace : il se répand rapidement et constitue un réservoir pour la dissémination de TEM-24.
L’émergence d’E. aerogenes comme pathogène nosocomial est principalement liée à l’utilisation des céphalosporines et des fluoroquinolones à large spectre. De façon alarmante, on observe aujourd’hui l’apparition de souches d’E. aerogenes résistantes à l’imipénème (De Gheldre et al., 1997). Ces souches représentent déjà plus de 5 % de la collection d’isolats cliniques au laboratoire. Dans ces isolats, la résistance à l’imipénème est due à une disparition des portes d’entrée que sont les porines de la membrane externe (Chow et al., 1991 ; Tzouvelekis et al., 1994 ; Charrel et al., 1996 ; Bornet et al., 2000b). L’incidence de ce mécanisme chez E. aerogenes va certainement augmenter avec l’usage de l’imipénème en clinique.
Depuis 1998, on décrit des isolats d’E. aerogenes multirésistants présentant une production de BLSE associée à la disparition des porines et la présence d’un efflux actif, aboutissant à un échec thérapeutique (Malléa et al., 1998 ; Pradel & Pagès, 2002 ; Gayet et al., 2003).

Les mécanismes de résistance

D’origine naturelle, semi-synthétique ou synthétique, les antibiotiques peuvent être classés en quatre grandes catégories selon leur activité. Les glycopeptides et les β-lactamines empêchent la formation de la paroi de peptidoglycane. Les aminoglycosides, les tétracyclines, le chloramphénicol et les macrolides bloquent la synthèse protéique. La rifampicine, les quinolones, les sulfamides et le triméthoprime inhibent la synthèse des acides nucléiques. Enfin, les polymyxines agissent sur les membranes mais sont réservées à un usage local externe du fait de leurs effets secondaires importants. Bien que le développement des antibiotiques ait connu un essor sans précédent au cours de ces dernières années, les bactéries, en parallèle, ont su rapidement mettre en place des mécanismes de résistance appropriés.
La description des différents mécanismes de résistance qui suit concerne surtout les bactéries gram-négatives. Ils peuvent être classés en trois catégories illustrées dans la figure 1:
– l’altération de la cible bactérienne,
– la modification ou la dégradation enzymatique de l’antibiotique,
– la réduction de la concentration intracellulaire de l’antibiotique.

Résistance par altération de la cible

La modification d’une cible bactérienne limite l’interaction avec l’antibiotique et devient insensible à son action. Par ce mécanisme, la résistance s’étend ainsi à tous les antibiotiques d’une même famille.
Chez les bactéries gram-négatives, les β-lactamines atteignent leurs cibles, les protéines liant la pénicilline (PLPs), dans le périplasme après avoir traversé la membrane externe par l’intermédiaire des porines. Les PLPs sont des protéines assurant l’assemblage des sous-unités de la paroi bactérienne. La résistance aux β-lactamines par altération des PLPs concerne surtout les bactéries gram-positives, mais quelques exemples ont été décrits chez Neisseria gonorrhoeae (Hakenbeck & Coyette, 1998). Dans ce cas, les bactéries résistantes produisent des PLPs modifiées de faible affinité pour l’antibiotique.
La résistance aux fluoroquinolones est généralement attribuée à des mutations de leurs cibles, représentées par l’ADN gyrase et la topoisomérase IV (respectivement gyrA et parC), deux enzymes jouant un rôle capital dans la conformation de l’ADN. Les mutations décrites se situent dans une région de 40 acides aminés de la sous-unité A de la gyrase. Cette zone, commune à de nombreuses espèces bactériennes, est appelé Quinolone Resistant Determining Region (QRDR) (Hooper, 2000).
Enfin, la modification de la cible ribosomale est le principal mécanisme de résistance aux tétracyclines (Chopra & Roberts, 2001), aux macrolides (Leclercq & Courvalin, 1991) et, dans une moindre mesure, aux aminoglycosides (Wright et al., 1998).

Résistance par modification ou dégradation enzymatique de l’antibiotique

Le mécanisme majeur de résistance aux β-lactamines est la production de β-lactamases. Ces enzymes inactivent les pénicillines et les céphalosporines en hydrolysant leur noyau β-lactame commun. Aujourd’hui, quatre classes de β-lactamases sont reconnues selon leurs substrats: les pénicillinases (classe A), les métallo-β-lactamases (classe B), les céphalosporinases (classe C) et les oxacillinases (classe D) (Thomson & Smith, 2000). Les bactéries productrices de β-lactamases sécrètent ces enzymes dans l’espace périplasmique pour détruire les β-lactamines avant qu’elles n’atteignent leur cible. On estime qu’une β-lactamase est capable d’hydrolyser 103 molécules de pénicilline par seconde. Donc, si 105 enzymes sont sécrétées par une bactérie résistante, alors 100 millions de molécules de pénicilline sont détruites toutes les secondes (Walsh, 2000). Clairement, c’est un mécanisme de résistance très efficace. A l’exception de quelques espèces telles que E. coli, Salmonella spp., Yersinia pestis, Shigella spp. et Proteus mirabilis, les Enterobacteriaceae et les Pseudomonas sont naturellement résistantes aux pénicillines voire à certaines céphalosporines par l’expression d’une pénicillinase et/ou d’une céphalosporinase chromosomiques (Freney, 2000). Pour résoudre ce problème, plusieurs alternatives s’envisagent : l’association des β-lactamines avec des inhibiteurs des β-lactamases (acide clavulanique, sulbactame et tazobactame) ou l’utilisation de céphalosporines stables (céfépime et cefpirome, carbapénèmes, monobactame). L’expression de la céphalosporinase chromosomique peut être soit constitutive soit inductible par la présence des β-lactamines elles-mêmes. De plus, ce type de résistance n’est pas levé par l’utilisation d’inhibiteurs des β-lactamases. En clinique, le mode de production inductible est répandu et bien décrit, notamment chez Enterobacter spp. (Livermore, 1995). La résistance aux β-lactamines peut être également due à l’acquisition de BLSEs d’origine plasmidique (Bradford, 2001). Les BLSEs les plus fréquemment rencontrées chez les Enterobacteriaceae sont de type TEM ou SHV, et de nombreux variants en dérivent par mutations ponctuelles (Jacoby & Medeiros, 1991 ; Ehrhardt & Sanders, 1993 ; Davies, 1994). A l’inverse des céphalosporinases, la plupart des BLSEs sont sensibles aux inhibiteurs des β-lactamases in vitro et in vivo. Cependant, il existe des variants « TEM résistantes aux inhibiteurs », comme par exemple TEM-24 retrouvée dans le clone prévalent d’E. aerogenes.
Les aminoglycosides ne sont pas hydrolysables, mais ceux-ci peuvent être rendus inactifs par trois types de substitutions chimiques qui empêchent leur fixation sur l’ARN ribosomal cible. Les enzymes de résistance aux aminoglycosides peuvent être des O-phosphotransférases, des O-adényltransférases ou des N-acétyltransférases, et les gènes correspondants sont bien souvent portés par des éléments mobiles (Wright et al., 1998 ; Wright, 1999). Chez E. aerogenes par exemple, l’enzyme de type AAC6’ est associée à la BLSE de type TEM-24 sur le même plasmide. Cette enzyme inactive la nétilmicine, la kanamycine, la tobramycine et l’amikacine, mais reste sans effet sur la gentamycine (Marchandin et al., 2000).
Enfin, la résistance aux phénicolés est liée à la synthèse d’une chloramphénicol-acétyltransférase conférant un haut niveau de résistance à ces antibiotiques (Murray & Shaw, 1997).

Résistance par diminution de la concentration intracellulaire de l’antibiotique

Pour que les antibiotiques puissent exercer leur action, ils doivent avoir accès à leur cible intracellulaire. Dans le cas des bactéries gram-négatives, ceci implique la traversée de la membrane externe. Or celle-ci constitue une barrière imperméable à la pénétration des antibiotiques et explique, du moins en partie, le niveau de résistance intrinsèque élevé des bactéries gram-négatives comparées aux bactéries gram-positives vis-à-vis de nombreux antibiotiques (Nikaido, 2003).

Organisation générale de l’enveloppe des bactéries gram-négatives : les facteurs de la résistance intrinsèque

L’enveloppe des bactéries gram-négatives est constituée de deux membranes : la membrane interne ou cytoplasmique et la membrane externe. Ces deux membranes délimitent l’espace périplasmique ou se situe le peptidoglycane, qui contribue à la résistance mécanique de l’enveloppe (figure 2).
La membrane externe joue un rôle important dans la physiologie des bactéries gram-négatives. Dans le cas des entérobactéries, dont l’habitat naturel est le tractus intestinal des mammifères, la membrane externe agit comme une véritable barrière de protection contre l’action détergente des sels biliaires et contre la dégradation par les enzymes digestives (Nikaido & Nakae, 1979). En même temps, la membrane externe des entérobactéries et d’autres bactéries gram-négatives est imperméable à de nombreux antibiotiques (Nikaido & Nakae, 1979). La membrane externe présente une organisation asymétrique. Son feuillet externe caractéristique presque exclusivement formé par le lipopolysaccharide (LPS) est à la base de cette imperméabilité (figure 2). Le LPS est un lipide polyanionique constitué de trois régions : le lipide A, le noyau oligosaccharidique et l’antigène O. Deux facteurs contribuent à faire du LPS une structure hautement imperméable. D’une part, les acides gras qui forment le LPS des entérobactéries sont tous saturés. Une telle composition offre une très faible fluidité et le domaine hydrocarboné se présenterait alors sous l’état d’un « gel » même à 37°C. D’autre part, les molécules de LPS, riches en charges négatives, fixent des cations divalents (Mg2+, Ca2+) et ces interactions électrostatiques permettent un lien fort entre les molécules adjacentes (Nikaido, 2003). Par sa rigidité, le LPS tend à diminuer le taux de diffusion transmembranaire des antibiotiques lipophiles tels que les macrolides, les β-lactamines les plus hydrophobes, la novobiocine, l’acide fusidique… Néanmoins, les liens rigides du LPS qui assurent l’intégrité de la membrane externe en sont aussi le « tendon d’Achille ». Ainsi, les antibiotiques polycationiques que sont les polymyxines se complexent au LPS, à la place des cations divalents stabilisateurs, et entraînent sa désorganisation (Nikaido, 2003). Outre l’imperméabilité membranaire, le LPS offre également d’autres avantages : il permet aux bactéries gram-négatives d’échapper à la phagocytose et de se protéger contre les actions du complément et des anticorps circulants (Mäkelä et al., 1980).

Les facteurs favorisant la (multi)résistance

L’émergence de la multirésistance aux antibiotiques est sans aucun doute le problème majeur de notre relation actuelle avec les bactéries. Pourtant la résistance bactérienne n’a rien de nouveau : depuis des millénaires d’existence, les bactéries sont confrontées à des molécules toxiques qui menacent leur survie et ont développé des parades contre ces agressions. Ce qui est nouveau en revanche, c’est que nous réalisons aujourd’hui la facilité avec laquelle les bactéries expriment et disséminent les facteurs de résistance.
L’émergence de la multirésistance bactérienne aux antibiotiques résulte de plusieurs facteurs tenant aussi bien du comportement de l’homme que de l’adaptation de la bactérie. Face aux doses croissantes d’antibiotiques administrées au cours de ces 60 dernières années, les bactéries ont répondu en déployant tout un arsenal de mécanismes de défense (cf. section 2.1). En milieu hospitalier, la pression de sélection exercée par l’utilisation excessive d’antibiotiques à large spectre est telle qu’elle favorise la colonisation des patients par les souches les plus résistantes, puis leur propagation. De plus, la dissémination des gènes de résistance entre les espèces bactériennes via des éléments génétiques mobiles amplifie ce problème. Enfin, avec l’accroissement du nombre de patients immunodéprimés et l’allongement des séjours de ces patients, les microorganismes opportunistes sont devenus de véritables pathogènes « spécialisés » envers les personnes les plus vulnérables.
Les traitements antibiotiques à long-terme représente une opportunité pour analyser l’évolution phénotypique d’isolats cliniques individuels in vivo. De telles études permettent ainsi d’étudier l’influence des prescriptions sur l’apparition de la multirésistance. Cependant ces investigations sont rares du fait de la dimension éthique et des problèmes techniques qui leurs sont associés. L’équipe EA2197 a obtenu des résultats intéressants en observant a posteriori l’impact d’un traitement à l’imipénème sur des isolats d’E. aerogenes recueillis sur plusieurs patients sur une période de 2 à 9 semaines. Le typage épidémiologique de ces isolats au cours du temps a tout d’abord révélé qu’ils appartenaient tous au clone prévalent en France précédemment décrit (Bosi et al., 1999). Tous étaient également producteurs de la β-lactamase TEM-24 et l’imipénème était donc la seule alternative thérapeutique. Sensibles en début de traitement, tous ces isolats ont finalement développé une résistance à l’imipénème en cours de traitement, puis ont retrouvé leur sensibilité en quelques jours après l’arrêt du traitement. Une observation importante concernait la variation de la production de la porine majoritaire Omp36 pendant l’antibiothérapie. En effet, cette étude a montré une forte corrélation entre la présence d’Omp36 et la sensibilité aux β-lactamines dans ces isolats : la perte d’Omp36 était toujours associée à un phénotype résistant et inversement (Bornet et al., 2000b). Ces données montrent clairement que le traitement antibiotique peut sélectionner ou favoriser l’émergence d’un phénotype résistant à partir d’une souche préexistante sensible, et cela de façon très rapide.

L’efflux actif : un mécanisme ubiquitaire à l’origine de la multirésistance

Distribution et classification phylogénique des transporteurs d’efflux

Toutes les cellules procaryotes et eucaryotes renferment une panoplie de transporteurs dans leur membrane cytoplasmique assurant des fonctions vitales telles que l’import de nutriments, l’expulsion des substances toxiques, de facteurs de virulence, de signaux effecteurs et la maintenance de l’homéostasie cellulaire. La littérature rapporte l’identification d’un nombre croissant de tels systèmes de transport, notamment grâce aux facilités de clonage et de séquençage actuelles.
L’activité de nombreux systèmes de transport confère une résistance vis-à-vis de composés toxiques, à la fois chez les bactéries et les eucaryotes. Par exemple, la résistance des cellules cancéreuses aux agents chimiothérapeutiques anti-tumoraux est généralement due à l’activité d’efflux de la P-glycoprotéine. De même, chez les bactéries, la résistance aux antibiotiques et aux antiseptiques résulte de l’action de pompes membranaires qui expulsent ces composés hors des cellules.
Les transporteurs d’efflux peuvent être classés sur la base de trois critères principaux. Tout d’abord l’analyse comparative de la séquence primaire de ces transporteurs a permis leur regroupement en plusieurs familles ou superfamilles distinctes (http://www.biology.ucsd.edu/ ~msaier/transport/). A ce jour, cinq familles de pompes d’efflux ont été décrites : la superfamille ATP-binding cassette (ABC) (Higgins, 2001), la superfamille major facilitator (MF) (Saier et al., 1999), la famille small multidrug resistance (SMR) (Chung et al., 2001), la famille multidrug and toxic compound extrusion (MATE) (Brown et al., 1999) et la famille resistance-nodulation-cell division (RND) (Saier et al., 1994 ; Zgurskaya & Nikaido, 2000b). L’organisation membranaire de ces familles de pompes diffère selon qu’elles permettent l’efflux à travers une ou deux membranes (Nikaido, 1996). Cela paraît évident pour les bactéries gram-positives, qui ne sont enveloppées que d’une seule membrane, mais les deux arrangements existent chez les bactéries gram-négatives. Les pompes d’efflux de la famille SMR ne fonctionnent qu’avec un seul composant : le transporteur localisé dans la membrane interne (figure 4). Au contraire, les pompes appartenant aux familles ABC, MF, MATE et RND catalysent l’efflux à travers les membranes interne et externe en une seule étape, sans intermédiaire périplasmique. Dans ce cas, les transporteurs s’assemblent avec deux protéines supplémentaires : une protéine canal localisée dans la membrane externe et une protéine adaptatrice localisée dans le périplasme (figure 4). L’efflux est un mécanisme actif ; et on distingue deux types de transporteurs, primaires ou secondaires, selon qu’ils l’hydrolysent de l’ATP ou utilisent la force proton-motrice (gradient électrochimique transmembranaire de protons) comme source d’énergie. Chez les bactéries, la grande majorité des transporteurs identifiés et ayant une relevance clinique sont des transporteurs secondaires (figure 4) (Paulsen et al., 1996 ; Nikaido, 1998). Cette prédominante est claire chez E. coli : sur les 37 transporteurs d’efflux putatifs identifiés dans cet organisme, seuls 7 sont de type ABC (Nishino & Yamaguchi, 2001). Enfin, nous pouvons différencier les transporteurs d’efflux selon leur spécificité de substrats. Les études pionnières de Stuart Levy dans les années 70 sur la résistance aux tétracyclines ont mis en évidence les protéines Tet capables d’expulser cette seule classe d’antibiotiques (Levy, 1992). A l’inverse, on identifie aujourd’hui un nombre croissant de pompes d’efflux capables d’expulser un large spectre de substances toxiques (multiples colorants, détergents, solvants, antibiotiques…) ne présentant aucune caractéristique structurale commune (Nikaido, 1998).

La superfamille « ATP Binding Cassette » (ABC)

Cette superfamille présente une distribution ubiquitaire parmi tous les organismes vivants et regroupe actuellement plus de 30 familles de transporteurs (Saier, 1998). Les transporteurs ABC assurent, de façon spécifique ou non, le transport vital (import ou export) de molécules très variées telles que des sucres, des ions, des acides aminés, des complexes liés au fer et même des protéines (Higgins, 2001). Dans tous les cas, c’est l’ATP qui fournit l’énergie nécessaire au transport.
Les transporteurs ABC sont constitués par l’assemblage d’une protéine intégrale de membrane contenant 6 segments transmembranaires (TMS : transmembrane segments) en hélices α et d’une protéine fixant l’ATP localisée sur la face cytoplasmique de la membrane. Ces deux protéines peuvent être liées de façon non-covalente, ou covalente par l’intermédiaire d’une chaîne polypeptidique. Le système complet s’organise en dimère et contient alors 12 TMS. Alors que chez les eucaryotes les deux domaines sont fusionnés en une seule protéine codée par un seul gène, chez les procaryotes, les sous-unités sont codées par plusieurs gènes puis s’assemblent dans la membrane (Higgins, 2001).
Les systèmes d’efflux de type ABC ne sont pas vraiment répandus chez les bactéries, mais on peut citer par exemple le transporteur LmrA de Lactobacillus lactis (Bolhuis et al., 1996) et la pompe MacAB d’E. coli spécifique de l’efflux des macrolides (Kobayashi et al., 2001).

La superfamille « Major Facilitator » (MF)

Cette superfamille de transporteurs est retrouvée des bactéries jusqu’aux eucaryotes supérieurs ; elle assure le symport, l’antiport et l’uniport de nombreux substrats tels que des sucres, des intermédiaires de cycle de Krebs, des esters de phosphate, des oligosaccharides et des antibiotiques (Saier et al., 1999). L’énergie nécessaire au transport est fournie par la force proton-motrice (FPM). Dans cette superfamille, les transporteurs d’antibiotiques peuvent être séparés en deux familles ou clusters selon qu’ils contiennent soit 12 soit 14 TMS. Les transporteurs spécifiques d’une classe d’antibiotiques et les transporteurs non-spécifiques se répartissent indifféremment dans ces deux familles, suggérant des mécanismes de reconnaissance et de fonctionnement similaires (Paulsen et al., 1996). Les transporteurs spécifiques de la famille MF sont surtout impliqués dans la résistance aux tétracyclines et au phénicolés, respectivement les protéines Tet et FloR chez les entérobactéries (passées en revue dans Levy, 1992). Un grand nombre de pompes d’efflux de type MF conférant un phénotype de multirésistance ont été identifiées dans diverses bactéries. Les exemples les plus étudiés proviennent de bactéries gram-positives tels que la pompe NorA à 12 TMS chez Staphylococcus aureus et ses homologues Bmr et Blt chez Bacillus subtilis, et la pompe QacA à 14 TMS chez S. aureus (passées en revue dans Paulsen et al., 1996 ; Li & Nikaido, 2004).
Les transporteurs d’efflux de type MF fonctionnent habituellement comme des pompes à composant unique (e.g. NorA et QacA chez S. aureus ; les protéines Tet chez E. coli) mais, chez les bactéries gram-négatives, certaines s’associent avec une protéine périplasmique et une protéine de membrane externe pour former des pompes d’efflux à trois composants (e.g. EmrAB-TolC chez E. coli) (Lomoskaya & Lewis, 1992).
Les analyses de séquences par alignements multiples ont révélé des caractéristiques intéressantes. Tout d’abord, des similarités de séquences significatives ont été observées entre les moitiés N et C-terminales des transporteurs à 12 TMS. Ces homologies internes suggèrent que cette famille a évolué par duplication à partir d’un gène ancestral à 6 TMS (Paulsen & Skurray, 1993). De telles observations sont beaucoup moins évidentes pour la famille des transporteurs à 14 TMS. De plus, le taux de conservation est beaucoup plus élevé entre les moitiés N-terminales qu’entre les moitiés C-terminales. Etant donné la large spécificité de substrats des transporteurs, il a donc été proposé que les régions N et C-terminales étaient respectivement impliquées dans la translocation des protons et dans la reconnaissance des substrats (Griffith et al., 1992). Ces analyses ont également mis en évidence plusieurs motifs conservés, signatures caractéristiques de chaque cluster de la superfamille. En particulier Paulsen et Skurray ont identifié deux motifs (A et B) conservés parmi tous les transporteurs de type MF, un motif (C) spécifique des transporteurs d’antibiotiques et enfin plusieurs motifs (de D à G) dont certains sont exclusifs au cluster des transporteurs à 12 TMS et d’autres au cluster des transporteurs à 14 TMS. La conservation de ces motifs suggère qu’ils jouent des rôles structuraux et/ou fonctionnels importants au sein de chaque cluster (Paulsen & Skurray, 1993). Cela a été démontré par plusieurs expériences de mutagenèse dirigée. Au contraire, aucun de ces motifs ne semblent être impliqués dans la discrimination des substrats.

La famille « Multidrug And Toxic compound Extrusion » (MATE)

Les transporteurs de la famille MATE présentent une topologie membranaire similaire à celle des transporteurs de la superfamille MF, mais ne montrent aucune homologie de séquence avec ces derniers (Brown et al., 1999). Très peu de transporteurs de cette famille ont été identifiés et caractérisés à ce jour. Les protéines NorM chez la bactérie marine Vibrio parahaemolyticus et YdhE chez E. coli leur confèrent une résistance multiple vis-à-vis des colorants cationiques, des aminoglycosides et des fluoroquinolones. Ces deux transporteurs fonctionnent grâce au gradient électrochimique de sodium (Morita et al., 1998).

La famille « Small Multidrug Resistance » (SMR)

Les transporteurs de la famille SMR sont des antiporteurs d’antibiotiques énergisés par la FPM. Ce sont de petites protéines membranaires d’environ 110 résidus d’acides aminés, contenant seulement 4 TMS et qui fonctionnent sous forme tétramérique (Ma et al., 2004). Quelques membres de cette famille ont été caractérisés, comme par exemple les protéines Smr chez S. aureus (Grinius et al., 1992) et EmrE chez E. coli (Schuldiner et al., 1997). La gamme de leurs substrats est restreinte aux composés cationiques lipophiles dont font partie certains antiseptiques, désinfectants, colorants tels que bromure d’éthidium et quelques antibiotiques tels que l’érythromycine et la tétracycline.

La superfamille « Resistance/Nodulation/Cell division » (RND)

Cette superfamille compte au moins 7 familles distinctes de transporteurs. Initialement considérés comme spécifiques des bactéries, les transporteurs RND sont également présents chez les eucaryotes (Saier, 1994 ; Tseng et al., 1999). Leur activité est énergisée par la FPM.
Les pompes d’efflux de type RND sont très répandues parmi les bactéries gram-négatives et représente la famille la plus documentée. Les transporteurs RND se caractérisent par une très large spécificité de substrats (figure 5). Ainsi, chez les bactéries gram-négatives, l’expression constitutive de certaines pompes d’efflux de type RND participe à la résistance intrinsèque. Lorsque leur taux d’expression est augmenté, à la suite d’une mutation génétique ou de l’induction d’une cascade de régulation, elles peuvent engendrer une multirésistance de haut niveau vis-à-vis de nombreux antibiotiques utilisés en clinique (Nikaido, 1998). Les transporteurs RND sont de grandes protéines d’environ 1000 résidus d’acides aminés et présentent une topologie membranaire inhabituelle contenant 12 TMS et deux larges boucles périplasmiques entre les TMS 1-2 et 7-8 (Zgurskaya & Nikaido, 2000b). Toutes les pompes d’efflux contenant un transporteur RND présentent une organisation transmembranaire commune. Le transporteur, localisé dans la membrane interne, forme un complexe tripartite avec une protéine périplasmique ancrée dans la membrane interne, et une protéine canal, localisée dans la membrane externe. Dans la plupart des cas, les gènes codant chaque composant de la pompe sont organisés sous forme d’opéron et leur transcription est sous le contrôle d’un promoteur unique. Des preuves biochimiques attestent aussi de cet assemblage à trois composants. Grâce à cette organisation, les antibiotiques peuvent être expulsés directement du cytoplasme et/ou du périplasme dans le milieu extracellulaire. Les protéines AcrB (membre du système AcrAB-TolC) chez E. coli et MexB (membre du système MexAB-OprM) chez P. aeruginosa sont les représentants les plus étudiés, et sont responsables de la multirésistance dans ces espèces.
Dans la suite de ce manuscrit, nous nous concentrerons surtout sur les pompes d’efflux des bactéries gram-négatives en prenant comme exemples E. coli et P. aeruginosa. En particulier, nous insisterons sur les composants, le mécanisme d’action, la régulation et l’importance en clinique des pompes de la famille RND.

Table des matières

CHAPITRE I : INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
1. Les entérobactéries du groupe Klebsiella, Enterobacter, Serratia (KES) : description et données épidémiologiques
1.1. Serratia spp.
1.2. Klebsiella spp.
1.3. Enterobacter spp.
1.3.1. Enterobacter cloacae
1.3.2. Enterobacter aerogenes
2. La résistance aux antibiotiques
2.1. Les mécanismes de résistance
2.1.1. Résistance par altération de la cible
2.1.2. Résistance par modification ou dégradation enzymatique de l’antibiotique
2.1.3. Résistance par diminution de la concentration intracellulaire de l’antibiotique
2.1.3.1. Organisation générale de l’enveloppe des bactéries gram-négatives : les facteurs de la résistance intrinsèque
2.1.3.2. La résistance par perte ou modification des porines
2.1.3.3. La résistance par efflux
2.2. Les facteurs favorisant la (multi)résistance
3. L’efflux actif : un mécanisme ubiquitaire à l’origine de la multirésistance
3.1. Distribution et classification phylogénique des transporteurs d’efflux
3.1.1. La superfamille « ATP Binding Cassette » (ABC)
3.1.2. La superfamille « Major Facilitator » (MF)
3.1.3. La famille « Multidrug And Toxic compound Extrusion » (MATE)
3.1.4. La famille « Small Multidrug Resistance » (SMR)
3.1.5. La superfamille « Resistance/Nodulation/Cell division » (RND)
3.2. Pompes d’efflux chez Escherichia coli et autres entérobactéries
3.3. Pompes d’efflux chez Pseudomonas aeruginosa et autres bactéries non-fermentatives
3.4. Les protéines des pompes d’efflux tripartites
3.4.1. La protéine canal de membrane externe
3.4.1.1. Structure tridimensionnelle de la protéine TolC d’Escherichia coli
3.4.1.2. Les homologues de TolC chez les bactéries gram-négatives
3.4.1.3. Caractérisation biophysique des protéines d’efflux de la membrane externe
3.4.2. Le transporteur de membrane interne : structure et bases moléculaires de la large spécificité de substrats
3.4.3. La protéine périplasmique adaptatrice : données structurales
3.4.4. Assemblage des pompes d’efflux tripartites
3.5. Régulation du locus acrAB chez les entérobactéries
4. Les stratégies thérapeutiques futures : vers des inhibiteurs d’efflux ?
CHAPITRE II : RESULTATS
CHAPITRE III : DISCUSSION

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