Soutenance mémoire
La double hélice d’ADN
C’est en 1952 que Hershey et Chase identifient la molécule d’ADN comme support héréditaire de l’information génétique. En marquant radioactivement soit l’ADN soit les protéines de phages T2, les auteurs ont montré que le transfert d’ADN, et non de protéines, était requis pour la croissance des phages dans des bactéries infectées (Hershey and Chase, 1952). Dix ans plus tard, dans les années 60, Khorana, Nirenberg et Holley « interprétèrent le code génétique et sa fonction dans la synthèse protéique », en établissant le lien entre ADN, ARN et protéines. Cette découverte majeure leur value l’obtention du prix Nobel de physiologie et de médecine en 1968 (Raju, 1999). L’histoire de la découverte de l’ADN commence bien plus tôt, en 1869, lorsque Meischer étudie la composition biochimique des leucocytes. En testant de nombreuses conditions d’extraction des constituants de ces cellules, il constate la formation d’un précipité blanc en condition acide. N’ayant pas les mêmes propriétés que les protéines ou les lipides connus jusquelà, Meischer conclu à l’indentification d’une nouvelle molécule organique. Il montre ensuite que cette molécule est riche en phosphates, localisée dans le noyau des cellules et la nomme « nuclein » ((Miescher-Rüsch, 1871), pour revue (Dahm, 2008)). Puis Levene décrit en 1919 le nucléotide comme unité de base de l’ADN. Un nucléotide est constitué d’un groupement phosphate, d’un sucre (désoxyribose dans l’ADN) et d’une base azotée (parmi quatre : adénosine (A), tyrosine (T), guanine (G) et cytosine (C) (Levene, 1919)). Enfin Chargaff montre que les bases A et G sont présentes dans les tissus en mêmes quantités que les T et C respectivement (Chargaff, 1950). Toutes ces études, en n’oubliant évidemment pas les clichés révélateurs acquis par Rosalind Franklin and Maurice Wilkins, ont mené Watson et Crick à la découverte de la structure en double hélice de la molécule d’ADN par diffractions aux rayons X en 1953 ((Watson and Crick, 1953), pour revue (Pray, 2008)). Dans cette étude, les auteurs décrivirent une conformation d’ADN dite de type B (Figure 2, centre) : les bases A s’appariant avec les bases T et les bases G avec les bases C forment des plateaux au centre de l’hélice, perpendiculairement à son axe. Les groupements phosphate sont disposés vers l’extérieur et constituent l’ossature de l’hélice, d’orientation droite. De plus, les deux brins d’ADN ont une orientation antiparallèle (on distingue les extrémités 5’-phosphate et 3’-OH). Chaque tour comprend 10 nucléotides (Watson and Crick, 1953). Toutefois, la molécule d’ADN est dynamique et de nombreuses autres conformations peuvent être générées en modifiant la géométrie et les liaisons hydrogènes entre les deux bases (Ghosh and Bansal, 2003). Même si une vingtaine de conformations différentes ont pu être décrites, seules trois sont majoritairement observées in vivo : les conformations A, B et Z (Ha et al., 2005; Rich and Zhang, 2003; Richmond and Davey, 2003; Wood, 2016). La conformation A correspondrait à la forme déshydratée de la conformation B. Les bases sont inclinées, déplacées de l’axe de l’hélice et sa structure est légèrement plus lâche, avec 11 nucléotides par tour (Figure 2, gauche (Ghosh and Bansal, 2003; Wood, 2016)). La conformation Z est retrouvée au niveau des répétitions G-C-G-C et est stabilisée par les super-enroulements négatifs. Elle est orientée vers la gauche et son ossature forme un zigzag (Figure 2, droite (Ghosh and Bansal, 2003; Ha et al., 2005; Rich and Zhang, 2003)). La conformation B est la plus répandue dans le monde vivant (Wood, 2016). Dans cette conformation, deux nucléotides adjacents sont séparés de 0,34 nm (Watson and Crick, 1953). Sachant que le génome humain comprend six milliards de paires de bases (pb), chaque cellule de notre corps contient près de 2 mètres d’ADN linéaire répartis sur 23 paires de chromosomes. Afin d’être « rangées » dans un noyau de 10 µm de longueur, ces longues molécules d’ADN doivent être compactées par un facteur 1 000. Le niveau de compaction de l’ADN peut même atteindre un facteur 10 000 au moment de la division cellulaire. Malgré son fort niveau de compaction, la séquence d’ADN doit rester accessible aux machineries de transcription, de réplication et de réparation. Ainsi, la compaction de l’ADN n’est pas aléatoire dans le noyau des cellules mais requiert un haut degré de régulation. Nous précisons que le terme de compaction employé ici et dans le reste du manuscrit fait référence à la restriction du volume occupé par l’ADN, sans modification des interactions chimiques. Le terme de condensation fait lui référence à la modification des interactions chimiques au sein d’une molécule, conduisant à sa séparation du solvant (par exemple, formation d’un précipité).
Le nucléosome
Les histones sont de petites protéines basiques d’environ 15 kDa très conservées chez les eucaryotes. Leur partie C-terminale est repliée en trois hélices a qui forment un motif spécifique (« histone fold motif ») leur permettant d’interagir entre elles et avec l’ADN (Luger et al., 1997). Il existe quatre histones dites canoniques : H2A, H2B, H3 et H4 (DeLange and Smith, 1971). Deux hétéro-dimères H2A/H2B s’associent avec un tétramère H3/H4 pour former un octamère d’histones (Figure 3, (Kornberg and Thomas, 1974)). La structure formée par l’enroulement de 146/147 pb d’ADN autour de cet octamère (en 1,7 tour) est appelée nucléosome et est considérée comme le premier niveau de condensation de l’ADN (Kornberg, 1974; Olins and Olins, 1974; Oudet et al., 1975). Un nucléosome forme un cylindre de 5,5 nm de hauteur et 11 nm de diamètre (Olins and Olins, 2003). Sa structure cristallographique a été révélée en 1997 à 2,8 Å de résolution (Luger et al., 1997), avant d’être affinée à 1,9 Å (Davey et al., 2002). Alors que le repliement de l’ADN autour de l’octamère d’histones parait relativement uniforme entre les nucléosomes, l’angle avec lequel l’ADN sort du nucléosome peut, lui, varier. Comme nous allons le voir plus loin, ce paramètre peut jouer un rôle important dans l’organisation de la fibre nucléosomale.
Chez la levure S. cerevisiae
Alors que l’hétérochromatine et l’euchromatine sont visuellement distinguables dans les cellules de mammifères, ces deux états chromatiniens le sont beaucoup moins chez S. cerevisiae (Figure 8c). En effet l’observation du noyau de levure par MET ne révèle pas de structures denses aux électrons comparables aux régions hétérochromatiniennes des cellules de mammifère (à l’exception du nucléole) (Grunstein and Gasser, 2013; Léger-Silvestre et al., 1999). Le niveau élevé d’acétylation des histones (Waterborg, 2000) et le sous-enrichissement de l’histone linker Hho1 par rapport aux histones canoniques ((Downs et al., 2003; Freidkin and Katcoff, 2001), voir plus haut) favorisent un état décondensé du génome de levure (Dekker, 2008). De plus, l’absence de machinerie de méthylation de l’ADN, ainsi que d’orthologues de HP1 ou des marques d’histones H3K9me3 et H3K27me3 ne permettent pas l’établissement de régions d’hétérochromatine constitutive semblables à celles des cellules de mammifères. Cependant, certaines régions peuvent être assimilées à de l’hétérochromatine facultative : les régions sub-télomériques, les loci HM (« Homothallic Mating ») impliqués dans le changement de type sexuel et l’ADN ribosomique (pour revue (Taddei and Gasser, 2012)). Ces régions sont réprimées transcriptionnellement et enrichies en nucléosomes hypo-acétylés (Braunstein et al., 1996; Rine and Herskowitz, 1987; Rine et al., 1979; Shore and Nasmyth, 1987). La mise en silence des régions sub-télomériques peut également se propager sur les séquences adjacentes, on parle alors chez la levure de « Telomere Position Effect » (Gottschling et al., 1990; Hecht et al., 1995). On peut noter que les centromères de S. cerevisiae, contrairement à ceux de l’autre levure modèle S. pombe, sont de courtes régions (environ 250 pb) qui ne présentent pas les caractéristiques de l’hétérochromatine (Bloom and Carbon, 1982; Furuyama and Biggins, 2007). Pour conclure ce chapitre, nous avons évoqué qu’un nucléosome résultait de l’enroulement de l’ADN autour d’un octamère d’histones. L’enchainement de nucléosomes constitue la fibre de 10 nm, qui peut être compactée en clusters ainsi qu’en boucles de chromatine. En parallèle, cette fibre peut se trouver dans deux états chromatiniens différents (i.e. hétérochromatique et euchromatique) pouvant également influencer son niveau de compaction et sa position dans l’espace. Nous détaillerons dans le Chapitre IV de cette partie que ces deux processus (boucles de chromatine vs. états chromatiniens) entrent en compétition pour réguler le repliement de la fibre de 10 nm dans l’espace nucléaire (Nuebler et al., 2018).
La découverte des SMCs
Le terme SMC fut employé pour la première fois en 1985 par Larionov et al. lors de l’identification chez la levure S. cerevisiae d’un gène impliqué dans la stabilité des mini-chromosomes centromériques. Ils le nomment alors SMC1 pour « Stability of Mini-Chromosomes » (Larionov et al., 1985). Quelques années plus tard, Niki et ses collaborateurs recherchent par crible génétique des gènes impliqués dans la partition des chromosomes chez la bactérie E. coli. Ils mettent en évidence le gène mukB (du japonais « mukaku » pour « sans noyau », (Hiraga et al., 1989)), codant pour une protéine composée de longues répétitions coiled-coil séparées par un domaine central, et de domaines terminaux capables de lier l’ATP (Niki et al., 1991). L’année suivante cette protéine est visualisée par MET (Niki et al., 1992). Les auteurs décrivent deux conformations pour la protéine : une étirée en forme de bâtonnet (ou de I) ou une repliée en forme de V. Ils concluent que la protéine MukB est capable d’homodimérisation, avec un alignement parallèle des coiled coil (i.e. les extrémités N-terminales et C-terminales des deux protéines seraient situées de part et d’autre du domaine charnière, voir Figure 15a). Sur la base de sa séquence primaire, il apparaît que la protéine Smc1 de levure possède la même architecture que MukB, composée de répétitions coiled-coils et de domaines terminaux liant l’ATP (Strunnikov et al., 1993). Cette protéine est essentielle pour la ségrégation des chromosomes et son absence provoque un arrêt des cellules en mitose (Strunnikov et al., 1993). En 1994, Hirano et al. identifient sur les chromosomes mitotiques de xénope des protéines homologues à Smc1/MukB (Hirano and Mitchison, 1994). Leur déplétion engendre la désorganisation massive des chromosomes qui n’apparaissent plus en microscopie à fluorescence comme des fibres distinctes mais forment des amas diffus appelés « puffs ». Les auteurs décrivent alors ces protéines comme impliquées dans la « condensation » des chromosomes. La même année, des protéines homologues aux Smc sont également identifiées chez la levure à fission S. pombe (Saka et al., 1994) et chez le poulet (Saitoh et al., 1994). Dans cette dernière étude, les auteurs mettent en évidence que les sites de liaison et d’hydrolyse d’ATP sont chacun situés dans les deux domaines terminaux des protéines Smc. Afin de permettre la reconstitution d’un site fonctionnel, ils proposent que les coiled-coils s’associent de manière antiparallèle (i.e. qu’un domaine C-terminal soit juxtaposé à un domaine N-terminal, (Saitoh et al., 1994), Figure 15b). Puis sur la base d’alignements de séquences entre le gène SMC1 et les séquences annotées du génome alors disponibles, un second gène codant pour une protéine Smc est identifié chez la levure S. cerevisiae, SMC2 (Strunnikov et al., 1995). Cette protéine, également requise pour la ségrégation des chromosomes, est décrite pour son rôle dans la condensation des chromosomes. Alors que la déplétion de Smc1 n’a que peu d’effets sur la condensation des chromosomes, les auteurs ont proposé l’existence, au sein des protéines Smc, de « sous familles aux fonctions biologiques différentes, même si leur similarité structurale suggère des activités biochimiques primaires communes » (Strunnikov et al., 1995). L’acronyme SMC est alors redéfini « Structural Maintenance of Chromosomes » (Strunnikov et al., 1995). Les années suivantes, de plus amples investigations permettent une meilleure caractérisation des deux complexes cohésines et condensines. Les condensines sont décrites chez le xénope par Hirano et ses collaborateurs comme un complexe multi protéique composé de deux protéines Smc et de trois protéines auxiliaires. Les auteurs confirment leur rôle par des expériences ex vivo de condensation des chromosomes incubés avec des condensines purifiées (Hirano et al., 1997). Les sous-unités des cohésines sont identifiées dans des cribles génétiques recherchant des facteurs impliqués dans la séparation précoce des chromatides sœurs (Guacci et al., 1997; Michaelis et al., 1997). Cependant, ce n’est qu’en 1998 que Losada et al. caractérisent chez le xénope deux complexes Smc aux propriétés distinctes : les condensines qui condensent le génome lors de la mitose et les cohésines qui sont requises dans des étapes plus précoces du cycle cellulaire afin de maintenir la cohésion des chromatides sœurs (Losada et al., 1998). De manière concomitante, des études de MET confirment l’association antiparallèle des coiled-coils dans les hétérodimères de protéines Smc (Melby et al., 1998). Cependant, il est suggéré que les deux sous-unités interagissent entre elles sur toute leur longueur (Figure 15b). Il faut attendre 2002 et les études cristallographiques de Haering et al. sur les cohésines pour prouver que le repliement des Smc est intramoléculaire et que les deux sous-unités interagissent seulement via leur domaine charnière ((Haering et al., 2002), Figure 15c). Cette étude en association avec celle de Gruber et al. menée in vivo permet une découverte majeure dans le domaine des SMC : la cohésine forme un anneau composé d’un hétérodimère de Smc et d’une troisième sous-unité associée aux deux têtes ATPasiques ((Gruber et al., 2003; Haering et al., 2002), Figure 15c). Un nom générique est alors attribué à la troisième sous-unité des complexes SMC, celui de « kleisin » (du grec « fermé ») (Schleiffer et al., 2003). Une protéine kleisin est définie comme composée de deux domaines N et C terminaux globulaires qui interagissent avec les protéines Smc et séparés entre eux par un « linker » moins structuré (Gruber et al., 2003; Schleiffer et al., 2003). Dès 1999, Uhlmann et al. ont montré que la séparation des chromatides sœurs lors de l’anaphase nécessitait le clivage de la sous-unité kleisin des cohésines (Uhlmann et al., 1999). Puis, dans une seconde étude Uhlmann et al. ont induit le clivage artificiel de la kleisin par la protéase du virus du tabac (TEV) (Uhlmann et al., 2000). Le fait que cela induise la perte de cohésion des chromatides sœurs suggérait que cette dernière était établie par l’embrassement topologique de l’ADN à l’intérieur de l’anneau (Uhlmann et al., 2000). Cette hypothèse d’embrassement topologique a été confirmée par Ivanov et al. en 2005 puis par Haering et al. en 2008 ((Haering et al., 2008; Ivanov and Nasmyth, 2005), Figure 15d). Enfin, en 2014 Gligoris et al. mettent en évidence que la dissociation de l’interface entre la kleisin est Smc3 est nécessaire pour la sortie de l’ADN hors de l’anneau (Gligoris et al., 2014). Le mécanisme de maintenance de la cohésion par les cohésines est alors dévoilé.
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE I : ARCHITECTURE DU CHROMOSOME
A. La double hélice d’ADN
B. Les histones
a. Le nucléosome
b. Les modifications post-traductionnelles d’histones
c. Les variants d’histones
d. L’histone H1
C. La fibre de 10 nm
D. De la fibre de 10 nm et vers au-delà
a. Arrangement supra-nucléosomaux
b. Boucles de chromatine
c. Euchromatine et hétérochromatine
i. Chez les mammifères
ii. Chez la drosophile D. melanogaster
iii. Chez la levure S. cerevisiae
CHAPITRE II : LE CYCLE CELLULAIRE
A. Préambule
B. Généralités chez les métazoaires
a. L’interphase
b. La mitose
c. La régulation du cycle cellulaire
i. Les cyclines
ii. Les points de contrôle (« checkpoints »)
C. Le cycle cellulaire chez la levure S. cerevisiae
a. Les différences avec le cycle cellulaire des métazoaires
b. Détail des méthodes de synchronisation utilisées dans l’étude
i. Synchronisation en G1
ii. Synchronisation en G1/S
iii. Synchronisation en mitose, sans réplication
iv. Synchronisations en mitose
CHAPITRE III : UN COMPLEXE DE LA FAMILLE DES SMCS : LA COHESINE
A. Préambule
B. La découverte des SMCs
C. Les cohésines
a. Un complexe multiprotéique
i. L’anneau tripartite
ii. Les protéines auxiliaires
iii. Différents modèles de conformation de l’anneau
b. L’association des cohésines à l’ADN
c. Un anneau avec une porte d’entrée
d. Un anneau avec deux portes de sortie
D. Les rôles des cohésines
a. La cohésion
i. Chez la levure S. cerevisiae
ii. Chez les mammifères
b. L’organisation du génome
c. Cohésion vs. organisation du génome
CHAPITRE IV : L’ARCHITECTURE NUCLEAIRE
A. Préambule
B. Les méthodes d’analyse des repliements de la chromatine
a. FISH, FROS et ANCH-OR
b. Les C-techniques
c. Le SPRITE
d. Le GAM
C. Les repliements de la chromatine chez les métazoaires
a. Les TADs
i. Un TAD, qu’es aquò ?
ii. Les séquences insulatrices
iii. Les modèles de formation des TADs
Par extrusion de boucles par les cohésines
Par la transcription
iv. Quelle fonction pour les TADs établis par les cohésines et CTCF ?
v. Les TADs chez D. melanogaster
vi. Visualisation des TADs en cellules uniques
b. Les compartiments chromatiniens A et B
c. Compétition entre les TADs et les compartiments
d. Les chromosomes mitotiques
e. Les territoires chromosomiques
D. Chez la levure
a. La conformation « Rabl-like » des chromosomes
i. Les centromères
ii. Les télomères
iii. Le nucléole
iv. L’enveloppe et les pores nucléaires
b. Les repliements intra-chromosomiques
i. Chez S. cerevisiae
ii. Chez S. pombe
c. L’ADN ribosomique
i. Aperçu de la biogénèse des ribosomes
ii. Architecture de l’ADNr
iii. Organisation au cours du cycle cellulaire par les SMCs
RESULTATS
CHAPITRE I : LA COHESINE ORGANISE LES CHROMOSOMES
A. Préambule
B. Publication : Regulation of cohesin-mediated mitotic chromosome folding by Eco1 and other partners
C. Résultats supplémentaires
CHAPITRE II : LA COHESINE ORGANISE L’ADNR
A. Une analyse d’image dédiée pour sonder l’organisation 3D de l’ADNr
a. Préambule
b. Publication : Quantification of the dynamic behaviour of ribosomal DNA genes and nucleolus during yeast Saccharomyces cerevisiae cell cycle
c. Discussion
B. Un rôle additionnel de Pds5 dans l’organisation de l’ADNr
a. Préambule
b. Résultats supplémentaires
c. Discussion
DISCUSSION
ÉLUCIDER LE MECANISME D’ACTION D’ECO1 DANS L’ORGANISATION DU GENOME
A. Eco1 organise-t-elle le génome indépendamment de la réplication ?
B. Eco1 organise-t-elle le génome en mitose ?
C. Le rôle d’Eco1 dans l’organisation du génome nécessite-t-il son activité acétyl-transferase ?
a. Hypothèse 1 : L’activité acétyl-transférase d’Eco1 est requise pour l’organisation du génome
i. Eco1 acétyle Pds5
ii. Eco1 acétyle les histones
b. Hypothèse 2 : L’activité acétyl-transférase d’Eco1 n’est pas requise pour l’organisation du génome
i. Eco1 déstabilise l’interface Smc3-Scc1
L’ORGANISATION DE L’ADNR PAR LES COMPLEXES SMCS
A. Réciprocité entre cohésines et condensines à l’ADNr
a. Les cohésines bloquent la progression des condensines sur l’ADN
b. Les cohésines sont dérégulées dans le double mutant wpl1∆, eco1-AID
B. L’ADNr comme modèle de l’organisation du génome ?
ANNEXES
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