Optimisation physico-chimique de films fonctionnalisés pour des applications cardio-vasculaires

Contexte physiopathologique des maladies cardiovasculaires ischémiques et rôle physiologique du NO

  Dans le monde, en 2019, d’après l’organisation mondiale de la santé (OMS), la première cause de mortalité était représentée par les maladies cardiovasculaires ischémiques, responsables de 16 % des décès dans le monde . Depuis 2000, c’est cette pathologie qui a connu la plus forte augmentation du nombre de décès, avec une hausse de plus de 2 millions pour atteindre 8,9 millions de décès en 2019. Chaque année en France, 300 000 personnes souffrent d’ischémies (obstruction partielle ou totale d’un vaisseau, soit au niveau cérébral, soit au niveau du myocarde) ce qui entraine l’utilisation d’un dispositif médical implantable (DMI) dédié. Parmi ces patients, environ 200 000 subissent une intervention chirurgicale afin de leur implanter un stent (endoprothèse vasculaire de forme tubulaire) visant à rétablir la circulation sanguine . Malgré cela, près de 20 % des patients recevant le DMI décèdent des suites de l’ischémie et/ou de ses conséquences dans les minutes, heures ou jours qui vont suivre . De plus, les ischémies cardiaques ou cérébrales en plus des conséquences et du coût directe, ont des répercussions importantes sur la qualité de vie : dépendance vis-à-vis d’un tiers, handicap physique ce qui entraine un surcoût indirect pour la société . Même s’il existe un gain en termes de survie pour les patients après l’implantation d’un stent, des phénomènes de thrombose et/ou de resténose apparaissent dans 16 % à 42 % des cas au niveau du site d’implantation du DM impliquant le recours à un nouveau geste chirurgical . Des paramètres interconnectés jouent un rôle important dans le développement de la thrombose et de la resténose au niveau du site d’implantation du DMI. Si on prend l’exemple des complications liées à l’implantation de stents, on peut observer :
• des dommages de l’endothélium
• une adsorption protéique initiant un phénomène de coagulation
• une activation plaquettaire suivie d’une agrégation
• une activation leucocytaire
• une hyperprolifération des cellules musculaires lisses.
Ces phénomènes entrainent une thrombose et une resténose dont le mécanisme d’apparition est représenté par la figure 2. Pour éviter cela, des innovations récentes de ces DMI ont été développées :
• modification de leur surface : utilisation de nouveaux alliages, utilisation de polymères innovants ou de matériaux biodégradables ,
• développement de dispositifs libérant des principes actifs (molécules antiprolifératives comme le paclitaxel, le sirolimus ou l’évérolimus pour les DMI déjà commercialisés et des protéines ou des acides nucléiques pour ceux en cours de développement 17) Toutefois, ces matériaux ou revêtements ne sont pas tous commercialisés et/ou ne résolvent pas tous les problèmes : les lésions endothéliales et les troubles sanguins sont encore présents car la seule cible thérapeutique des molécules associées aux DMI est l’inhibition de l’hyperprolifération des cellules musculaires lisses. Le monoxyde d’azote, NO, dans cette indication semble être le meilleur candidat puisqu’il induit :
• une vasodilatation basale ;
• une prévention du phénomène de thrombose ;
• une inhibition de l’activation et de l’agrégation plaquettaire ;
• une inhibition de l’activation des leucocytes ;
• un contrôle de la prolifération des cellules musculaires lisses ;
•une ré-endothélialisation via une prolifération des cellules endothéliales. Ces actions bénéfiques sont possibles si NO est libéré de manière prolongée dans le temps (> 6 semaines) à une concentration correspondant à celle produite lors de sa biosynthèse par la Nitric Oxide Synthase endothéliale (eNOS) (concentration nM) . En raison de sa structure chimique (NO est une espère radicalaire) sa demi-vie est très courte (inférieure à 1 s) . En conséquence, afin d’atteindre cet objectif, un revêtement adapté doit être développé : ceci constitue l’objectif de ce projet. Dansla littérature, plusieurstravaux traitent du développement d’une surface capable de générer ou libérer du NO. Cela va être développé dans ce chapitre par le biais d’une revue de la littérature (article 1 en préparation : Nitric oxide delivering surfaces: An overview of functionalization strategies and efficiency progress)

Film multicouches

   Les films multicouches sont des revêtements présentant un grand intérêt dans le domaine des dispositifs médicaux. Ils sont composés d’assemblage de couches successives de polyélectrolytes de charges opposées auto-assemblés par des liaisons électrostatiques. Ils sont construits par une méthode de dépôts successifs en couche par couche décrite par Decher et al . La surface à revêtir est immergée de façon successive dans une solution de polyélectrolytes cationiques puis anioniques, entre chaque dépôt de polymère le substrat est rincé dans un tampon salin. Lors de chaque dépôt une quantité de polymère est adsorbée sur la surface en induisant une inversion de la charge totale de la surface. L’étape de rinçage par le tampon permet d’éliminer l’excédent de polyélectrolytes présents en solution et les chaînes faiblement adsorbées en surface. Cette méthode permet la construction contrôlée de films dont l’épaisseur peut varier de quelques Ångström à plusieurs micromètres sur une large variété de substrat. Dans le domaine biomédical, ces films permettent de conférer à une surface des propriétés nouvelles telles qu’une activité antibactérienne (limitation de la prolifération bactérienne) , une résistance à l’adsorption protéique 23,24 ou à l’inverse promouvoir l’adhésion cellulaire . Plus récemment, les films multicouches ont été utilisés en tant que réservoir via l’inclusion de principes actifs. Cependant, ces films présentent certaines limites en termes de capacité de stockage et de libération de médicaments à long terme . Pour surmonter ce problème, deux méthodes peuvent être appliquées ou même couplées. La première correspond à une modification de l’organisation des films par l’optimisation des conditions d’assemblage (facteurs externes : pH, température, concentration en sel…) ou en ajustant leur composition par l’ajout de couches polymériques barrières permettant une libération progressive du médicament . La seconde méthode est réalisée par l’enrichissement des films avec des nanoparticules représentant des plateformes pour augmenter la capacité de ce réservoir en médicaments. Ceux-ci seront greffés sur la surface des nanoparticules avant le chargement de celles-ci dans les films. En plus de la fonction d’élution de principe actif, l’inclusion de nanoparticules dans des films multicouches a également été utilisée pour conférer aux films au moins une partie des propriétés de ces objets :
• une activité antibactérienne par l’ajout de nanoparticules d’argent
• une modification des propriétés mécaniques du film
• des propriétés magnétiques grâce à des particules ferromagnétiques formant des plateformes de théranostiques
• une activité antioxydante portée par un film immobilisant des nanoparticules d’or , (article 4, en annexe issus de mes travaux de Master 2 : Long-lasting and controlled antioxidant property of immobilized gold nanoparticles for intelligent packaging paru dans le journal Colloids and Surfaces B : Biointerfaces ). Dans le cadre de ce projet, les AuNP ont aussi été piégées à l’intérieur de films polyélectrolytes multicouches (Figure 3) pour le développement d’un  matériau biocompatible . Ces particules ont été choisies pour leur grande capacité à être greffées avec des principes pharmaceutiques actifs , ce qui permettrait la formation d’un réservoir d’une forte dose de médicaments.

NO releasing surfaces functionalized by covalently bound S-nitrosothiols

   Materials functionalized by covalently bound S-nitrosothiols might be considered as a promising source since these species represent the physiological storage form of NO. A few research groups have recently worked on the development of this type of surfaces. The functionalization relies on a two-step process. First, it needs the addition of a reduced thiol precursor to the surface that can be nitrosated. By following thisstrategy, Goudie and coworkers created a polydimethylsiloxane substrate grafted with SNAP. Their optimal construction reached a NO load of 4.3 µmol. cm-2 released in 25 days and showed a significant anti-bacterial activity. Surfaces functionalized with covalently bonded RSNO present significant advantages. In contrast to materials designed by liquid impregnation a wide variety of substrate can be functionalized. Unlike materials bearing NONOate, RSNO functionalized surfaces mimic an endogenous source of NO and therefore do not present a toxicity risk. Lastly, in physiological conditions, only NO is released by this type of surfaces without the need of a specific triggers. However, covalently bound RSNO approach faces a major limitation in term of quantities of NO loaded. This phenomenon could be explained by the construction process of these materials. After addition of reduced thiols, they rapidly tend to the formation of disulfides thus reducing the number of functions available for nitrosation.

Biocompatibilité sanguine

   Un stent est défini comme étant un DMI de classe III d’aprèsla directive européenne 93/42/CEE. Il est donc considéré comme étant un dispositif à risque élevé ce qui impose lors de son développement une étude détaillée de son interaction avec le compartiment sanguin. Les systèmes protéiques de la coagulation (voie intrinsèque et extrinsèque de la cascade de la coagulation) et de l’immunité (système du complément) vont interagir avec les surfaces des matériaux implantés, considérés comme étrangers 41 à l’organisme. La surface du matériau interagira également avec les cellules circulantes (érythrocytes, thrombocytes et leucocytes) et les cellules de la paroi vasculaire (cellules endothéliales). Au niveau moléculaire, la voie intrinsèque est la plus directement impliquée dans la coagulation déclenchée par une surface étrangère . Il en résulte une cascade d’amplification de réaction enzymatique, conduisant à l’activation de la thrombine (à partir de sa forme inactive la prothrombine) qui convertit le fibrinogène en fibrine formant le caillot en surface du matériau. D’autre part, l’adsorption protéique sur le dispositif et en particulier le fibrinogène peut conduire à l’adhésion puis à l’activation plaquettaire . Dans ce contexte, les plaquettes activées subissent, entre autres, une modification morphologique conduisant à l’exposition de phospholipides accélérant la conversion de la prothrombine en thrombine . Sur le plan immunitaire, le système du complément est l’acteur principal du système immunitaire inné de l’organisme conduisant à la lyse directe du corps étranger ou au recrutement de leucocytes . Ce système peut s’activer selon 3 voies : la voie classique, la voie des lectines ou la voie alterne. Cette dernière, la voie alterne d’activation du complément est souvent la plus stimulée en réponse à la présence d’une surface étrangère, phénomène principalement médié par l’adsorption du complexe protéique C3b sur celle-ci . Ainsi le développement d’un dispositif médical doit intégrer l’étude des interactions précédemment décrites. Cela correspond à la biocompatibilité du dispositif qui s’appuie sur la norme ISO-10993-1 : 2018 « évaluation biologique des dispositifs médicaux ». Elle stipule que la biocompatibilité est « la capacité d’un dispositif médical ou d’un matériau à fonctionner avec une réponse appropriée de l’hôte dans une application spécifique ». Le challenge à relever pour créer une surface hémocompatible repose sur la création d’un matériau pouvant limiter ou inhiber les interactions à la fois aux échelles protéiques et cellulaires. Dans ce contexte, l’hémocompatibilité peut être atteinte selon deux moyens . Le premier correspond à la passivation de la surface pour empêcher ou minimiser son interaction avec les constituants sanguins. Cet aspect repose sur la création d’une surface rendue furtive via sa composition et/ou son organisation. La stratégie la plus communément mise en œuvre repose sur la création d’une surface, via l’ajout d’une couche polymérique , présentant une activité d’antifouling (résistance à l’adsorption) protéique. Les caractéristiques d’une telle surface ont été explicitées par Ostuni et al . Ces travaux proposent que lessurfacesrésistantesrépondent à quatre critères : elles doivent être hydrophiles, incorporer des accepteurs de liaisons hydrogène, ne pas inclure de donneurs de liaison hydrogène, et être électriquement neutres. L’efficacité de ces surfaces repose sur la création d’une couche d’hydratation formant une barrière à l’adsorption protéique. L’organisation de la surface joue aussi un rôle important, l’encombrement stérique qu’elle peut offrir participe également à cet effet barrière . Parmi les polymères hydrophiles offrant une résistance protéique, le PEG est considéré comme étant une référence . A travers ce manuscrit l’expression « pégylation de surface » se réfèrera à cet ajout de PEG en surface d’un matériau. Le second moyen favorisant la biocompatibilité repose sur l’action pharmacologique de principes actifs incorporés dans la surface. Le matériau est rendu actif par son aptitude à inhiber les interactions délétères par l’utilisation de molécules biologiquement actives. Par exemple,l’immobilisation d’héparine, un anticoagulant inhibant la formation de thrombine, a été envisagée dès 1960 . De nos jours, cette stratégie représente encore une stratégie participant à l’amélioration de la biocompatibilité de biomatériaux . La biocompatibilité active peut également être atteinte par une libération de NO régulée et selon un flux d’ordre physiologique (nM). Ce composé impliqué dans l’homéostasie vasculaire 55 présente des effets pléitropiques pouvant favoriser l’hémocompatibilité d’une surface. En effet, le NO participe à la régulation de l’adhésion et l’activation des thrombocytes 56 et leucocytes . Ainsi dans le cadre de ce projet, la combinaison de la pégylation de surface et de la libération de NO participe donc à la création d’une surface biocompatible vis-à-vis du compartiment sanguin aux échelles protéiques et cellulaires.

Développent d’une stratégie analytique pour la caractérisation de films multicouches immobilisant des AuNP

  Les films multicouches sont des structures reconnues pour conférer à la surface d’un matériau des propriétés nouvelles . Ils sont formés avec des polyélectrolytes positifs et négatifs en alternant les couches de charges opposées . Ici, nous avons fait le choix de créer des films multicouches intégrant un troisième partenaire, les nanoparticules d’or, selon la technique du « dip coating » (enduction par trempage) dont le principe est détaillé dans la Figure 5. Avant même d’envisager l’ajout d’un principe actif au sein du film multicouche, il convient d’étudier la formation de celui-ci. Le film multicouche développé doit offrir le meilleur compromis pour deux exigences. En effet, il doit permettre l’immobilisation d’un maximum d’AuNP afin de créer un réservoir riche en NO. Aussi, il doit présenter une stabilité suffisante pour qu’aucun de ses constituants ne soit dessorbé trop rapidement en condition physiologique. L’immobilisation des AuNP de charge négative au sein du film est assurée par le biais d’interactions électrostatiques avec le polyélectrolyte positif composant la dernière couche déposée sur le film. Nous avons donc émis l’hypothèse que le polycation est le constituant du film influençant le plus le chargement des AuNP. Ainsi, la combinaison de quatre méthodes analytiques complémentaires (Figure 5) a permis de tester la quantité d’AuNP immobilisées et la stabilité pour différentes conditions de construction des films multicouches. Premièrement, par spectrophotométrie, nous avons étudié le spectre d’absorption des films dans le domaine du visible. Sous leur forme colloïdales (en suspension) les nanoparticules d‘or possèdent des propriétés optiques se traduisant par une interaction avec la lumière visible. La bande de résonance plasmonique, mesurable par spectrophotométrie, correspond à la longueur d’absorption maximale des AuNP. Ce paramètre physico-chimique dépend de la taille, de la forme et de l’environnement (solvant, distance inter-particulaire…) des nanoparticules. Après immobilisation dans un film, il est intéressant de vérifier la persistance de ce paramètre et d’étudier l’allure du spectre obtenu . En effet, cela permet de confirmer qu’après leur immobilisation, les AuNP restentsousforme de nanoparticulessphériques individualisées(sans agrégats). Cette information est importante puisque les AuNP doivent servir de plateformes portant le NO, ceci étant envisageable seulement avec des particules non dénaturées. Puis, une méthode de quantification de l’or, précédemment développée au laboratoire , a permis de mesurer la quantité d’or totale présente dans les films multicouches. L’oxydation des AuNP d’un degré d’oxydation nul (Au 0) en ions Au3+ puis leur complexation par des ions chlorure permet de former une paire d’ions entre le complexe HAuCl4- et un chromophore, la rhodamine B. Cet appariement de charge globale neutre devient alors séparable par chromatographie de partage apolaire et détectable par spectrophotométrie ou fluorimétrie. En déterminant la quantité totale d’or dans les films, il est possible d’en déduire le nombre d’AuNP immobilisées. Cette méthode permet d’étudier l’influence des conditions de construction des films sur la densité d’immobilisation des particules (AuNP/cm2). Il est ainsi possible de déterminer les conditions offrant la plus grande quantité d’AuNP qui pourront à terme former un réservoir en principe actif.

Reagents and AuNP synthesis

  Poly(allylamine hydrochloride) powder (PAH) with an average molecular mass of 17,500, 35wt% poly(acrylate, sodium salt) (PAA) solution with an average molecular mass of 15,000 in water and 50 wt% branched poly(ethylene imine) (PEI) solution with an average molecular mass of 800,000 in water were purchased from Sigma Aldrich. Solutions of 1.0 M HCl obtained from Fluka were used for pH adjustment. Sodium dodecyl sulfate (SDS) was supplied by Eurobio. Phosphate buffered saline solution (148 mM PBS) was prepared as follows: [Na2HPO4] = 6.48 mM, [KH2PO4] = 1.47 mM, [NaCl] = 138 mM and [KCl] = 2.68 mM. The final pH was adjusted to 7.4 with 1.0 M NaOH. Tris solution (148 mM) was prepared from Trizma® base (Sigma Aldrich), and the final pH was adjusted to 7.4 with 1.0 M HCl. Tris-NaCl buffer was prepared by adding 150 mM NaCl to 10 mM Trizma® base, and the final pH was adjusted to 7.4 with 1.0 M HCl. All other reagents were supplied by Sigma Aldrich and were of analytical grade. Ultrapure deionized water (>18.2 MΩ.cm) was used to prepare all the solutions. Citrate-stabilized AuNPs were synthetized according to previous works.(Tournebize et al. 2012) Briefly, 1 mL of AuCl4- aqueous solution (10 mg/mL) was added into 90 mL of water containing 2 mL of 55 mM sodium citrate. The solution was stirred for 1 min (250 rpm), 1 mL of NaBH4 (19.5 mM) was added, and the solution was stirred for 5 min under nitrogen. AuNPs with a gold core diameter of 3 ± 1 nm, 514 ± 1 nm specific plasmon band and a negative zeta potential of – 32 ± 1 mV were obtained in accordance with previous results.(Pallotta et al. 2016; Tournebize et al. 2012) The resulting suspension was immediately stored in the dark at 4 °C for a maximum of 20 days

Table des matières

Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Introduction générale
Chapitre 1 : Etat de l’art
1.1 Contexte physiopathologique des maladies cardiovasculaires ischémiques et rôle physiologique du NO
1.2 Film multicouches
1.3 Nanoparticules d’or
1.4 Article 1: Nitric oxide delivering surfaces: An overview of functionalization strategies and efficiency progress
1.5 Biocompatibilité sanguine
Chapitre 2 : Optimisation et caractérisation d’un revêtement formant un réservoir en monoxyde d’azote
2.1 Développent d’une stratégie analytique pour la caractérisation de films multicouches immobilisant des AuNP
Article 2: Analytical strategy for studying the formation and stability of multilayered films containing gold nanoparticles
Conclusions de l’article 2
2.2. Fonctionnalisation par NO
2.2.1 Fonctionnalisation des nanoparticules avant leur immobilisation
2.2.2 Conclusions et perspectives
Chapitre 3 : Biocompatibilité des AuNP et des films multicouches immobilisant des AuNP
3.1 Etude de l’hémocompatibilité d’un panel de nanoparticules d’or selon leur ligand de surface
Article 3 : Design of surface ligands for blood compatible gold nanoparticles: effect of charge and binding energy
Conclusion de l’article 3
3.2 Biocompatibilité des films multicouches immobilisant des AuNP
3.2.1 Introduction
3.2.2 Matériel & Méthode
3.2.2.1 Préparation des films multicouches
3.2.2.2 Caractérisation des films multicouches et étude de l’adsorption protéique par Microbalance à Cristal de Quartz (QCM)
3.2.2.3 Hémolyse induite
3.2.2.5 Etude de l’activité métabolique de fibroblastes murins au contact des surfaces
3.2.2.6 Quantification de l’or libéré par les films multicouches immobilisant des AuNP
3.2.2.7 Culture et étude de la viabilité des cellules endothéliales HUVEC
3.2.3 Résultats et discussion
3.2.3.1 Caractérisation des surfaces pégylées
3.2.3.2 Hémolyse
3.2.3.3 Cytotoxicité
3.2.3.4 Quantification de l’or
3.2.3.5 Coagulation
3.2.3.6 Viabilité des cellules endothéliales au contact des surfaces
3.2.4 Conclusion et perspectives
Conclusion générale et perspectives
Bibliographie
Annexes
Annexe 1 : Article 4 : Long-lasting and controlled antioxidant property of immobilized gold nanoparticles for intelligent packaging

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