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Méthode d’étude cellulaire conventionnelle
En raison de la très petite taille et la complexité des cellules, la biologie cellulaire et moléculaire est de plus en plus dépendante des développements de nouveaux instruments ainsi que des technologies associées. En conséquence, il est impératif pour tout biologiste cellulaire de connaître et maîtriser les technologies nécessaires à la collecte de données biologiques [18]. Après plus de 150 ans de développements, les techniques traditionnelles et l’instrumentation d’étude cellulaire sont matures et très bien établies dans les laboratoires de biologie. Parmi eux, la microscopie et la cytométrie en flux sont les deux techniques les plus couramment utilisées dans le domaine de la biologie cellulaire.
L’observation des structures biologiques est difficile parce que les cellules sont généralement trop petites et transparentes à la lumière visible. La mise au point de nouveaux instruments est l’objet d’un effort constant dans le but d’arriver à une meilleure définition des structures cellulaires.
Microscopie
Principe de la microscopie
La microscopie correspond à l’exploitation de techniques d’imagerie optiques pour l’observation d’échantillons (cellules) fixés ou non à travers un microscope. L’image obtenue nous permet d’analyser la morphologie de la cellule, ou encore d’étudier leurs
organites intracellulaires par coloration via des composants biochimiques.
Le développement et le raffinement de la microscopie permettent d’approfondir les connaissances concernant la structure cellulaire, non seulement dans la cellule tuée par fixation mais aussi dans la cellule à l’état vivant. Un certain nombre de microscopes ont été mis au point pour permettre l’observation des cellules. Parmi ces microscopes, nous distinguons principalement deux familles :
– les microscopes optiques, y compris : Microscope à contraste de phase, Microscopie en fluorescence, Microscope Confocal et Microscope à lumière polarisée, etc.,
– les microscopes électriques, y compris : Microscope à transmission et Microscope à balayage, etc.
Une comparaison entre les deux familles de microscopes est donnée au Tableau I.
1, en résumé [18] :
– en microscopie optique, les cellules vivantes peuvent être étudiées directement. Mais seulement quelques constituants cellulaires sont visible tels que le noyau, les mitochondries et les chromosomes,
– en microscopie électrique, la structure cellulaire complète peut être étudiée. Mais les cellules sont mortes, elles doivent traitées par les méthodes dite fixation pour être analysées.
Défies pour les techniques microscopiques
Les microscopes et leur système d’enregistrement continuent d’évoluer [21]. Les améliorations s’articulent autour d’une meilleure spécificité (par exemple pour visualiser seulement les protéines d’intérêt), d’un perfectionnement de la résolution, et du suivi des cellules dans les conditions les plus proches de celles de l’organisme d’origine.
Cytométrie en flux
Les microscopes ont toujours un rôle très important pour l’étude de cellules, cependant, des essais à l’échelle de cellule unique sont difficiles à réaliser. Cependant, depuis le milieu du XXe siècle, les scientifiques et les ingénieurs ont commencé à accorder un grand intérêt pour les techniques de manipulation des particules biologiques individuelles, non seulement dans l’observation de cellules fixées. En 1934, le premier appareil permettant de réaliser des numérations cellulaires1 est conçu par Andrew Moldovan [22]. L’appareil fait défiler les cellules dans un tube capillaire où les cellules étaient vues par un capteur photo-électrique. Ce travail mérite d’être reconnu pour la première description de la cytométrie en flux.
La cytométrie en flux décrit une technique de caractérisation quantitative et qualitative de particules (cellules, bactéries, parasites, billes…) en suspension, à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. La caractérisation individuelle est basée sur l’étude de la lumière réémise (par diffusion ou fluorescence) des particules à analyser.
Cette technique a été en développement durant de nombreuses années. Elle couvre un large champ d’application dans des disciplines très variées telles que la biologie médicale, la pharmacologie, l’hématologie, l’immunologie, la microbiologie et l’océanologie, etc. Cette technique particulièrement intéressante en biologie cellulaire est, pour l’instant, le seul moyen pour effectuer des analyses quantitatives d’expression sur chaque cellule individuelle en suspension : l’état d’activation, de maturation, de prolifération, ou de mort.
Principe de fonctionnement d’un cytomètre en flux
La représentation schématique d’un cytomètre den flux est montrée à la Figure I. 8
L’instrument est généralement composé du :
– système fluidique : qui permet d’introduire et positionner les cellules à analyser,
– système optique : qui permet de produire et recueillir des signaux lumineux,
– système électronique et informatique : qui permet de convertir des signaux optiques en signaux électroniques et numérisation pour analyse informatique.
FACS – Le tri des cellules
Fluorescence – activated cell sorting (FACS) est un type spécial de la cytométrie en flux. Le FACS fournit une méthode de séparation physique d’une suspension hétérogène de cellules biologiques dans deux ou plusieurs récipients, une cellule à la fois. Le procédé de tri est basé sur la diffusion de lumière spécifique et des caractéristiques de fluorescence de chaque cellule. Le principe consiste à marquer spécifiquement les cellules à sélectionner dans la population grâce à un colorant fluorescent. Par exemple, cela peut être un anticorps dirigé contre une protéine cellulaire de surface et lié à une substance fluorescente qui ira se fixer aux cellules portant cette protéine à leur surface. Parmi des milliers de cellule, le FACS est donc capable de sélectionner la cellule portant un marqueur déterminé.
Limites
En réalisant une analyse quantitative multiparamétrique, à l’échelle de la cellule individuelle ou de sous-populations au sein d’échantillons hétérogènes, la cytométrie en flux est ainsi devenue une méthode de référence dans la recherche sur le cancer
[24]. La cytométrie en flux permet de réaliser des études dose-réponse rapidement et très précisément en analysant plusieurs marqueurs de façon simultanée. Il est ainsi possible en une seule expérience de tester l’efficacité d’un composé sur la viabilité, les mécanismes de mort cellulaire, le potentiel mitochondrial, les dommages à l’ADN ou encore la prolifération, et de croiser ces paramètres avec la détection de marqueurs moléculaires membranaires, véritables signatures de sous-types cellulaires, ou de molécules intracellulaires (voies de signalisation impliquées, effecteurs…) [24]–[26].
Cependant, cette technique a ses points faibles :
– l’étape de prétraitement de l’échantillon, qui allonge le temps d’analyse et les manipulations,
– la nécessité d’un nombre de cellules assez important, de quelques centaines de milliers au minimum, qui est contraignante pour l’étude des cellules primaires,
– les équipements sont chers (à l’ordre de 10 k€ à 100 K€), complexes et qui demandent des coûts de fonctionnement (entretien, marqueurs fluorescents).
Discussions
Dans ce chapitre, nous avons montré les deux méthodes traditionnelles d’analyse cellulaire en biologie. Ces méthodes matures et évoluées depuis plusieurs décennies, permettent d’étudier la morphologie de la cellule, leur caractérisation biologique, la composition et le contenu cellulaire. Elles sont largement utilisées dans les laboratoires et cliniques pour étudier et analyser des cellules telles que les cellules cancéreuses et des cellules de différentes pathologies grâce au traitement d’image (la microscopie) et grâce à la capture et à l’analyse des données (cytométrie en flux). Cependant, face à leur puissance d’analyse exceptionnelle, les méthodes traditionnelles ont un inconvénient majeur induit par la préparation préliminaire des cellules, l’étape de marquage des cellules, soit par coloration en cas de microscopie, soit par marqueur fluorescent. Ce marquage peut modifier l’intégrité physiologique de la cellule et poser des problèmes lorsque celle-ci doit être transplantée dans un nouvel organisme par la suite. De plus, il s’agit de manipulations complexes, longues et coûteuses.
Les nouveaux développements reposent donc sur des techniques d’analyse des paramètres cellulaires qui sont à la fois rapides et non-invasives, qui permettent de conserver la cellule dans des conditions d’intégrité maximales.
Méthode d’étude cellulaire microtechnique
La convergence entre objets technologiques et naturels à l’échelle du micro et du nanomètre est soulignée depuis longtemps, comme indiqué sur la Figure I. 10, y compris par Stanley Field [27] dont la déclaration est devenue célèbre :
« Because technology provides the tools and biology the problems, the two should enjoy a happy marriage ».
Biocapteur : de nouveaux outils pour la biologie cellulaire
La biologie moderne et en particulier l’analyse génétique recourent de plus en plus à des moyens d’analyse sophistiqués. On cherche à obtenir de plus en plus d’informations ce qui nécessite de plus en plus de réactifs souvent coûteux et donc on cherche à réduire la taille des échantillons pour réduire les coûts. Parallèlement, le milieu de réaction lui-même doit souvent être le plus proche possible du milieu réel que l’on étudie (souvent la cellule).
La miniaturisation des dispositifs d’analyse est un des objectifs à l’heure actuelle du domaine de la biologie. Un enjeu majeur consiste à développer des biocapteurs qui permettent de travailler à l’échelle de la cellule unique.
Plusieurs études récentes montrent l’hétérogénéité cellulaire ou distributions multimodales dans une population de cellules [29], [30]. Les cellules uniques d’un même type présentent une variété de comportements. Cette variation d’expression est due en partie à la nature discrète des évènements moléculaires et cellulaires. Elle implique de nombreuses conséquences sur les mécanismes de différenciation cellulaire et entraîne des hétérogénéités dans une population de cellules.
Or, jusqu’à maintenant, de nombreuses études cellulaires s’appuient sur la réponse moyenne des cellules en population. Et ces résultats moyennés sont utilisés pour prédire les paramètres biophysiques et biochimiques de la cellule. Toutefois, cette méthode peut conduire à une interprétation erronée et laisser passer l’information essentielle dans la cellule. Il y a donc un enjeu important à étudier la réponse cellulaire à l’échelle individuelle dans les domaines de recherche de biologie cellulaire et biomédicale [31], [32].
La réalisation de petits dispositifs adaptant à l’étude de la cellule unique, est devenue possible grâce au développement des nano-micro technologies.
Généralité sur les biocapteurs
BioMEMS et Biocapteur
Le BioMEMS désigne, comme son nom l’indique, un microsystème électromécanique, ou MEMS (Micro Electro Mechanical System), et par extension tout système obtenu par les techniques de fabrication des micro-nanotechnologies et de micro-usinages. Il est utilisé pour des applications biologiques et médicales telles que le diagnostic, la thérapeutique, l’administration de médicaments ou la surveillance en temps réel [33]–[35].
Issus des techniques de la micro-électronique, le MEMS a été conçu pour fabriquer des structures complexes à l’échelle micrométrique. Les MEMS sont généralement composés de microréservoirs, microvannes, micropompes, micromélangeurs et microréacteurs [36]. Depuis sa naissance dans les années 1970, la technologie MEMS a suscité un intérêt considérable dans des domaines variés, accompagné d’un succès commercial. Par exemple, presque tous les Smartphones sont munis d’accéléromètres et gyromètres MEMS, qui détermine l’orientation de l’écran.
L’intégration de la gestion des flux de volumes microscopiques, la microfluidique, aux composants et des dispositifs de base du MEMS, aboutit à divers nouveaux capteurs et plates-formes de détection aux applications biologiques et chimiques : les BioMEMS [37]. Ils sont souvent considérés comme synonyme de « laboratoires sur puces» (Lab-on-a-Chip, LOC) 2 et microTAS (micro Total Analysis Systems, microsystèmes d’analyse totale) 3 . Ainsi, en permettant la mise en commun d’un nombre important de données, les BioMEMS représentent une avancée technique fondamentale pour la recherche biomédicale. Leur utilité est en effet scientifiquement incontestable car il devient alors possible, outre l’étude de cellules très ciblées, d’étudier de manière indépendante, des mécanismes biologiques particuliers indispensables aujourd’hui à la compréhension de nombreux phénomènes biologiques. On peut citer comme exemple le développement des cancers, l’apoptose cellulaire, ou encore l’identification de nouveaux traitements et la mise au point de nouveaux outils de diagnostic [35], [40].
En outre, les BioMEMS apportent de nombreux avantages par rapport aux méthodes classiques (section II) :
– la diminution des volumes des réactifs et des échantillons biologiques, du microlitre jusqu’au pico litre. Cela limite l’utilisation de réactifs peu disponibles ou coûteux, avec donc une réduction du coût des expériences,
– la réduction des coûts de fabrication avec une production en masse,
– l’augmentation de vitesse du diagnostic, les dispositifs miniatures autorisent la réalisation d’un grand nombre de tests en parallèle, accélérant la production de résultats.
Les champs de recherches et d’applications des BioMEMS sont donc très vastes [41]. Parmi eux, notre travail se focalise sur les applications de diagnostic et pronostic à long terme, au travers du développement de micro biocapteurs pour l’analyse cellulaire.
Méthode de détection optique
Détection par fluorescence
La majorité des biocapteurs optiques sont basés sur la détection de fluorescence. Ces techniques utilisent des techniques de marquage des éléments biologiques par des molécules fluorescentes pour obtenir une sensibilité et spécificité de détection suffisante. Par exemple, le biocapteur indiqué dans la référence[45]présente une détection sur puce de bactéries E.Coli en utilisant des anticorps marqués par fluorescence. L’inconvénient majeur de ces techniques est l’utilisation du marqueur spécifique qui rend la manipulation plus longue (préparations des échantillons), plus complexe et plus coûteuse.
En outre, quelques travaux récents démontrent la possibilité de détection sans marqueur, telles que l’exploite de la bio-chimioluminescence (technique optique sans marquage)[46] et la découverte de la protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein – GFP, Figure I. 14). Cette dernière est un marqueur naturel, qui permet de visualiser l’expression des gènes dans les cellules [47].
Détection par interaction avec les ondes optiques
Cette approche consiste à utiliser les ondes du domaine optique pour sonder les éléments biologiques. Par exemple, il est possible de détecter une cellule unique par son indice de réfraction optique (RI) [49]–[51]. Une cellule vivante est composée des organites et les molécules biologiques (protéines, lipides, etc.) d’indice de réfractions optiques différente. Par exemple, l’indice de réfraction de l’eau est égal à 1,33, et celle des membranes sont à l’ordre de 1,46. La composition change entre les cellules vivantes, mortes et cancéreuses. Par conséquent, la détection, ainsi la différenciation des cellules peuvent être effectuées [51] (Figure I. 15).
Cette méthode basée sur la mesure de l’indice de réfraction est intéressante : elle fournit la détection et la distinction de cellules vivantes uniques avec une bonne précision, et sans nécessité d’utilisation du marqueur spécifique par rapport aux méthodes d’optique classique. L’affranchissement de l’utilisation de marqueurs spécifiques passe par l’utilisation de méthodes de détection sensibles aux phénomènes d’interaction ondes/matières biologiques et ouvre des perspectives de développement des outils pour la spectroscopie cellulaire.
Méthode de détection électronique
Les techniques de détection électrique sont basées sur la transduction des signaux biologiques en signaux électriques. Les principaux avantages de ces techniques incluent la facilité de mise en œuvre, la faible consommation et la grande flexibilité de la dimension des capteurs et des paramètres de sensibilité. Elle est favorable à la portabilité et la miniaturisation du système, en comparaison aux autres méthodes de transduction.
Il existe plusieurs techniques : ampérométrie, potentiométrie, conductimétries et impédancemétrie [35] :
– les biocapteurs ampérométriques impliquent un courant électrique associé à un déplacement d’électrons,
– les biocapteurs potentiométriques mesurent un changement de potentiel entre deux électrodes dus aux ions ou aux réactions chimiques sur une électrode (telle qu’un FET sensible aux ions),
– les biocapteurs conductimétriques mesurent des changements de conductivité liés aux changements du milieu ionique global entre les deux électrodes,
– les biocapteurs électromagnétiques mesurent des changements d’impédance
Beaucoup de moyens de transduction utilisent des méthodes de mesure basées sur l’interaction d’un champ électromagnétique avec la matière biologique. Ces techniques sont non invasives et s’appuient sur la variation d’un comportement diélectrique cellulaire en fonction de la fréquence.
Bio-impédancemétrie
Le principe de la détection repose sur la variation d’impédance causée par la présence des échantillons biologiques placés entre des électrodes métalliques, techniques dites de bio-impédance. Cette technique consiste à faire passer un faible courant alternatif (AC) à travers un échantillon biologique et à déterminer sa réponse en impédance en fonction de la fréquence. Les données d’impédancemétrie reflètent la taille de la cellule, la capacité de la membrane et la résistance du cytoplasme [52]. Comme exemple, les travaux de Senez et al. [53] présentent un microsystème constitué de deux électrodes et d’un microcanal, qui permet de localiser les cellules sur les électrodes. Le système est montré sur la Figure I. 16 ci-dessous.
La méthode d’impédancemétrie montre la possibilité de détecter des cellules uniques sans marqueurs, basée sur l’étude de l’interaction ondes électriques/cellule. Or cette technique est généralement appliquée aux basses fréquences inférieures à 100 MHz. En effet, dans la gamme du MHz, les mesures effectuées traduisent une modification globale des propriétés diélectriques de la membrane (dispersion β). De plus, les mesures nécessitent toutefois un contact physique entre les électrodes et les cellules à étudier.
Détection aux Térahertz
En complémentarité, de nouvelles investigations ont cours dans le domaine du térahertz (100 GHz à 30 THz). Les travaux de l’IEMN (Institut d’Electronique de Microélectronique et de Nanotechnologie) [54], [55] portent sur l’élaboration de différents biocapteurs dédiés à la caractérisation diélectrique de biomolécules. Nous pouvons voir sur la Figure I. 17, le système de détection est basé sur l’utilisation de lignes métalliques nanométriques dites lignes de Goubau qui s’appuient sur la génération d’impulsions ultracourtes pour sonder le milieu biologique. Les modifications d’impédance électriques observées traduisent une modification de la fonctionnalité de surface cellulaire et de la structure macromoléculaire de la cellule, survenant par exemple lors de l’internalisation4 ou l’interaction d’un ligand avec son récepteur.
Potentialités de la technique de détection de cellule dans la gamme des hyperfréquences
En intermédiaire entre les basses fréquences utilisées par l’impédancemétrie et la gamme THz (Figure I. 18), se situent les ondes hyperfréquences. Les hyperfréquences (appelé également Micro-ondes) sont des ondes électromagnétiques dont la fréquence est comprise entre 0,3 GHz et 100 GHz.
Durant ces trente dernières années, en raison de l’apparition de nouvelles technologies, les sources électromagnétiques se sont multipliées et l’exposition quotidienne de l’homme à ces champs s’est d’autant plus accrue. Les applications exploitant les ondes électromagnétiques dans les domaines de la biologie et de la médecine sont nombreuses. Nous pouvons citer par exemple, l’application thérapeutique par micro-ondes hyperthermie [57], micro-onde ablation [58] ainsi d’autres applications telles que la radiométrie et télémétrie [59]. Les premières utilisations médicales des ondes électromagnétiques ont été conduites par l’institut de cancérologie et on s’en sert largement aujourd’hui, non pour combattre le cancer directement, mais pour aider l’organisme à résister aux radiations et à la chimiothérapie.
L’utilisation des ondes électromagnétiques pour caractériser et étudier les propriétés diélectriques de substances biologiques telles que des tissus ou des fluides biologiques (sang) est bien établie notamment grâce au travail du Pr. Schwan [6]. La détection hyperfréquence consiste à mesurer les propriétés diélectriques des milieux biologiques avec et sans changement physiologique et morphologique. Cette technique est non-invasive et non destructive. Dans les travaux de Gabriel et al. [12], [61], un grand nombre des milieux biologiques sont caractérisés aux fréquences des micro-ondes jusqu’à 20 GHz. Ils ont montré que la permittivité et la conductivité varient entre les différents milieux biologiques. D’autres travaux [62], [63] démontrent qu’il existe un contraste important entre les paramètres diélectriques de tissus sains et de tissus cancéreux sur une large gamme de fréquence au-delà du gigahertz. Cependant, ces études ont été menées aux échelles des organes (foie par exemple) ou des tissus (échantillons centimétrique d’organe ou de peau).
Les investigations à l’échelle de cellule unique dans le domaine des hyperfréquences sont apparues très récemment. Dans cette gamme de fréquence (dispersion γ), la membrane plasmique est électriquement transparente, ce qui fait que les ondes hyperfréquences pénètrent à l’intérieur de la cellule. La technique de détection hyperfréquence est avantageuse, car non-invasive et non destructive. Les mesures sont sans marqueur et sans contact, ce qui permet de mesurer les cellules directement dans leur état naturel. Les mesures permettent de différencier les cellules vivantes et mortes et d’identifier le type cellulaire. La détection électrique hyperfréquence est effectuée en mesurant les coefficients de réflexion et de transmission de la cellule, à l’aide d’un système physique qui sert à guider les ondes électromagnétiques dit guide d’onde. Tout changement de comportement physiologique peut être exprimé en utilisant les paramètres S.
Les premiers travaux de détection de cellule unique dans la gamme hyperfréquence ont été initiés par l’équipe MH2F du LAAS via les travaux de thèse de Tong Chen et al. [64]. La détection large-bande (de 40 MHz à 40 GHz) des cellules uniques vivantes de lymphome B est effectuée directement dans leur milieu de culture (Figure I. 19). Le biocapteur hyperfréquence comporte un guide d’onde coplanaire avec une coupure capacitive au centre, ainsi qu’un canal microfluidique placé perpendiculairement au-dessus, et inclut un piège mécanique en son centre. détection RF, (b) Spectres des deux cellules uniques vivantes (reproduit de [64])
Les travaux [65] présentent un interféromètre de 1,6 GHz basé sur l’utilisation d’une ligne de transmission pour la détection de la cellule unique (Figure I. 21). Les cellules de levures sont suspendues dans de l’eau salée. Un potentiel d’actionnement est appliqué aux électrodes qui génèrent alors une force diélectrophorétique (DEP, voir III.5) translatant la cellule sur les électrodes. Le dépassement de la cellule sur une paire d’électrodes interdigitées provoque une variation de capacité (ΔC).
Dans les travaux de Ning et al. [66], qui ont suivi, la détection de cellules vivantes de Jurkat en fonction de leur nombre est effectuée sur une plage de fréquence de 1 GHz à 5 GHz. Le microsystème est composé d’une ligne de transmission coplanaire et d’un canal microfluidique. Les cellules de Jurkat sont en suspension dans une solution de saccharose, et sont immobilisées entre les deux électrodes de la ligne de transmission par la méthode de diélectrophorèse.
Figure I. 21 (a) Schématique de la transmission coplanaire et le canal microfluidique et deux cellules de Jurkat vivantes piégées entre les lignes coplanaires, après l’application de la force DEP,(a) Coefficient de transmission S21 en mesure et simulation de 1, 2, 9, 12, et 15 cellules (reproduit de [66])
D’autre part, J. Leroy et al. [67]présente un biocapteur microfluidique basé sur une architecture de filtre passe-bande (5,6 GHz à 6 GHz) faite d’électrodes pour caractériser les propriétés diélectriques de cellules uniques. Les cellules suspendues dans une solution de saccharose circulant dans le canal microfluidique(Figure I. 22). L’immobilisation des cellules est également effectuée avec l’application d’une force DEP, ce qui impose l’utilisation d’un milieu hôte des cellules faiblement conductif.
Parmi ces études à l’échelle de la cellule unique, le système de blocage de cellule unique apparaît très important car il impose des contraintes sur le milieu hôte de caractérisation des cellules. Lorsqu’une technique de DEP est utilisée, le milieu doit être appauvri vis à vis de sa conductivité. Nous avons donc étudié les possibles techniques de blocage de cellules individuelles.
Techniques de manipulation cellulaire
L’une des difficultés en microsystème est de pouvoir placer les cellules en suspension sur les zones de mesures. Pour cela, plusieurs méthodes « microfluidique-compatibles » existent, et sont classées suivant le type de force utilisée pour la manipulation. Certaines méthodes appliquées de l’extérieur sont des méthodes dites actives, nous pouvons citer les méthodes magnétique, mécanique, optiques, électriques [68]. Il existe également des méthodes qui exploitent uniquement la force hydrodynamique, sans faire appel à des champs externes. En voici quelques exemples brièvement introduits.
Techniques actives
Magnétiques Les manipulations sont basées sur l’utilisation des champs magnétiques et de micro particules magnétiques. Ces dernières ont typiquement un noyau magnétique et un revêtement non magnétique qui peut être adapté pour se lier à des anticorps spécifiques [69].
Mécaniques L’application principale de la manipulation mécanique est la séparation de cellules. Les cellules peuvent être aspirées dans des micropuits, puis être analysées ou cultivées individuellement [70] (Figure I. 23). Les cellules peuvent également être capturées puis déplacées par le système dit de micropince (microgripper en anglais) [71] (Figure I. 24). Néanmoins, la complexité des dispositifs mécaniques rend leur intégration difficile dans les biocapteurs.
Optiques Ces méthodes utilisent la force résultant de la réfraction d’un faisceau laser en milieu transparent, pour maintenir et déplacer physiquement des cellules. Elles permettent par exemple de séparer en flux les particules selon leur taille, forme et indice de réfraction et de générer des matrices de pièges optiques [73].
Les systèmes optiques présentent un intérêt majeur pour l’immobilisation et le déplacement de cellules uniques avec grande précision. Néanmoins, une manipulation prolongée dans un piège optique pourrait causer l’endommagement des cellules par la chaleur générée par l’énergie du laser.
Électroniques Ces méthodes reposent sur l’application d’un champ électrique pour engendrer une manipulation de particules ou cellules. Le phénomène de diélectrophorèse (DEP) implique le mouvement d’un corps dans un champ électrique non-uniforme, causé par la polarisabilité du corps (particule, cellule…). Un champ alternatif (AC) peut être utilisé pour polariser les objets non chargés. Une cellule possédant une permittivité plus élevée que celle du milieu se dirigera alors vers les régions de forte intensité du champ (et réciproquement).
Dans le travail de Voldman et al. [74] la force DEP a été utilisée pour confiner des cellules et les maintenir contre la perturbation des flux de fluide. Le réseau cellulaire est composé d’électrodes extrudées à géométrie asymétrique quadripolaire et électriquement adressable (Figure I. 25).
Les méthodes employant la force DEP présentent quelques inconvénients. Elles peuvent causer un réchauffement des cellules dans le cas d’une manipulation prolongée. De plus, la DEP semble endommager les cellules piégées, ce qui affecte la prolifération cellulaire. D’autre part, elles exigent généralement que le milieu hôte de la suspension cellulaire soit appauvri en ions, ce qui n’est pas compatible avec les milieux traditionnels de culture de cellules [75], riches en ions et nutriments variés.
Les méthodes de manipulation cellulaire actives reposent donc sur différentes approches et présentent toutes un certain nombre d’avantages et d’inconvénients. Certaines de ces méthodes sont relativement complexes et onéreuses tant pour l’équipement nécessaire à leur mise en œuvre, que pour les consommables utiles à leur réalisation.
Sans faire appel à des champs externes, il est également possible de manipuler des cellules en fonction de leur taille, forme, et propriétés mécaniques et chimiques. Ces techniques dites passives exploitent uniquement des propriétés d’hydrodynamique et sont d’autant plus efficaces et simples à intégrer.
Hydrodynamiques
Hydrodynamiques Ces méthodes utilisent généralement des microstructures et des valves spécifiques dans le canal microfluidique pour contrôler l’écoulement de fluide de manière à recueillir des cellules individuelles. Elles sont d’autant plus efficaces et simples à intégrer. Un bel exemple est proposé par Tan et Takeuchi [76]: leur système utilise les forces hydrodynamiques pour le transport et l’immobilisation d’un grand nombre de particules simultanément, et des forces optiques créant des micro-bulles pour la libération des particules individuelles (Figure I. 26). Or, la libération des particules basée sur le technique laser rend la manipulation complexe.
La libération des cellules exploitant uniquement les forces hydrodynamiques est présentée par Huebner et al. [77]. Leur système est composé d’un réseau de pièges mécaniques basés sur le travail de Di Carlo [78], qui permet d’immobiliser efficacement une centaine des particules individuellement. Puis la libération de particules piégées est effectuée en inversant le sens du flux dans le micro canal (Figure I. 27).
Cette technique de manipulation cellulaire est particulièrement intéressante, sans besoin d’exploiter des forces externes, et donc sans ajout de dispositifs, ce qui rend la manipulation, la fabrication et l’intégration de tel dispositif considérablement plus simple à un biocapteur.
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Table des matières
NTRODUCTION GENERALE
CHAPITREI : METHODE D’ETUDE EN BIOLOGIE CELLULAIRE
I CELLULE BIOLOGIQUE ET SON MODELE ELECTRIQUE
I.1 Propriété biologique de la cellule
I.2 Propriété diélectrique de la cellule
I.2.1 Cas de la membrane plasmique comme diélectrique
I.2.2 Dispersion diélectrique de cellules
I.2.3 Circuit électrique équivalent d’une cellule biologique
I.2.3.a Modèle de Fricke
I.2.3.b Modèle de Debye
II METHODE D’ETUDE CELLULAIRE CONVENTIONNELLE
II.1 Microscopie
II.1.1 Principe de la microscopie
II.1.2 Défies pour les techniques microscopiques
II.2 Cytométrie en flux
II.2.1 Principe de fonctionnement d’un cytomètre en flux
II.2.2 FACS – Le tri des cellules
II.2.3 Limites
II.3 Discussions
III METHODED’ETUDE CELLULAIRE MICROTECHNIQUE
III.1 Biocapteur : de nouveaux outils pour la biologie cellulaire
III.2 Généralité sur les biocapteurs
III.2.1 BioMEMS et Biocapteur
III.2.2 Définition et principe de fonctionnement du biocapteur
III.2.3 La classification des biocapteurs
III.3 Détection et caractérisation cellulaire
III.3.1 Méthode de détection mécanique
III.3.2 Méthode de détection optique
III.3.2.a Détection par fluorescence
III.3.2.b Détection par interaction avec les ondes optiques
III.3.2.c Méthode de détection électronique
III.4 Potentialités de la technique de détection de cellule dans la gamme des hyperfréquences
III.5.1 Techniques actives
III.5.2 Hydrodynamiques
III.6 Discussion
IV OBJECTIF DE NOTRE TRAVAIL ET CONCLUSIONS
CHAPITRE II : OPTIMISATION DU BIOCAPTEUR DEDIE A L’ANALYSE PAR SPECTROSCOPIE DIELECTRIQUE MICRO-ONDE DE CELLULE INDIVIDUELLE
I DESCRIPTION DU SYSTEME DE SPECTROSCOPIE DIELECTRIQUE
I.1 Concept du biocapteur micro-onde initial à cellule unique
I.2 Matériels et méthodes
I.2.1 Méthode de mesure
I.2.2 Banc de test
I.2.3 Extraction des paramètres diélectriques
II AUTOMATISATION DU BANC DE TEST
II.1 Interface Homme-Machine
II.2 Validation
III OPTIMISATION DE LA FABRICATION DES MICROCANAUX FLUIDIQUES
III.1 Canaux microfluidiques réalisés à partir du matériau PDMS
III.2 Canaux microfluidiques réalisés à partir de matériaux photosensibles
III.2.1 Le polymère SU–8
III.2.2 Film sec – Dry Film (DF)
IV OPTIMISATION DE L’EFFICACITE DE PIEGEAGE
IV.1 Description des trois configurations de pièges mécaniques
IV.2 Étude de l’efficacité de piégeage de particules et de cellules
V OPTIMISATIONS PARAMETRIQUES DU BIOCAPTEUR
V.1 Impact du diamètre de la particule
V.2 Impact de la permittivité relative de la particule
V.3 Impact de la largeur du gap capacitif
V.4 Impact de l’épaisseur de métallisation
VII CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
DE CELLULES UNIQUES
I EXPERIMENTATIONS STATIQUES
I.1 Étude de répétitivitéet répétabilité des mesures
I.1.1 Protocole de préparationdes solutions de particules/cellules
I.1.2 Répétitivité des mesures
I.1.2.a Mesures de billes de polystyrène dans le milieu RPMI
I.1.2.b Mesures de cellules dans le milieu RPMI
I.1.2.c Comparaison des mesures de cellules avec la technologie SU8 et Film Sec
I.1.3 Répétabilité des mesuresde cellules dans le milieu RPMI
I.2 Discrimination de cellules vivante, morte et traitée
I.2.1 Cellule morte par appauvrissement du milieu de culture à température ambiante
I.2.2 Cellule vivante soumise à un traitement thermique
I.2.3 Cellule vivante soumise à un traitement chimique
Conclusions et perspectives
II EXPERIMENTATIONS DYNAMIQUE EN TEMPS REEL
II.1 Interface Homme-Machine
II.1.1 Fonctions d’acquisition
II.1.2 Validation
II.1.2.a Mesures en temps réel de l’évaporation d’éthanol
II.1.2.b Étude de la répétitivité du suivi en temps réel
II.2 Suivi en temps réel de cellules THP1
II.2.1 Cellule vivante
II.2.2 Cellule vivante soumise à un stimuli chimique
II.2.2.a 1ère expérience – Suivi avec une résolution temporelle del’ordre de la minute
II.2.2.b 2ème expérience – Suivi avec une résolution temporelle de l’ordre de la seconde
III CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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