Optimisation de la méthode de spéciation du mercure dans les produits de la pêche par DID et GC-ICP-MS 

Réactivité du mercure dans l’environnement

Les différents processus impliqués dans la réactivité du Hg sont soit biotique soit abiotique ou une synergie des deux dans le cas où des produits biogéniques interviendraient (produits pouvant être synthétisés et excrétés par les micro-organismes puis réagir dans l’environnement). Les processus biotiques sont des réactions intra- ou extracellulaires avec des organismes vivants (micro organismes). Les processus abiotiques sont purement chimiques (réactions chimiques, réactions photochimiques) et sont liés à la présence de certains composés dont les produits biogéniques.

Oxydation et réduction

Dans l’atmosphère : L’espèce Hg dominante dans l’atmosphère est le Hg°. Peu soluble et très volatil, il peut parcourir de longues distances sur une durée moyenne de 1 à 2 ans. Le MeHg est peu présent dans l’atmosphère car il est principalement issu de réactions de méthylation dans les sédiments, l’eau et les organismes aquatiques. Les échanges mercuriels entre l’atmosphère et l’eau sont des phénomènes de déposition atmosphérique et volatilisation. Des dépôts de Hg dans l’eau et sur les continents se font par voie sèche (vent) ou humide (pluie, neige) et sont dépendants des conditions météorologiques (forces et direction des vents, saisons, températures, etc.). Elles sont principalement constituées de mercure inorganique (iHg) qui peut être issu de l’oxydation du Hg° par l’oxone ou la présence de radicaux libres OH (Hines et Brezonik, 2004, Calvert et Lindgerb, 2005, Sommar et al, 2010). En milieu aquatique, la réaction de réduction du iHg en Hg° la plus mentionnée est la photo-réduction, principalement en milieu humide et sous l’action de rayonnements lumineux de longueurs d’onde allant de 280 à 320 nm (UVB) (Muresan et al., 2008). Le Hg° est ensuite facilement transféré de l’eau vers l’atmosphère.
Dans le système aquatique : Le Hg° et le iHg subissent dans le système aquatique de nombreuses réactions d’oxydoréduction. Le Hg° va principalement être volatilisé dans l’atmosphère tandis que le iHg est transféré de l’eau vers les sédiments et vice-versa par des phénomènes de sédimentation et de remobilisation. Dans les eaux de surface, les réactions sont principalement de type photo réductrice et photochimique tandis qu’au niveau des eaux profondes ont lieu des réactions liées à l’activité biologique (bactéries, phytoplancton) (Monperrus et al., 2007a, Whalin et al., 2007). Ces phénomènes sont régulés par les conditions météorologiques et hydrodynamiques telles que la houle, les marées, courants, vents, etc.

Méthylation et déméthylation

Le méthylmercure (MeHg) est une espèce présente essentiellement dans le système aquatique, dans les sols saturés en eau et dans les êtres vivants. Les teneurs en MeHg de ces différents compartiments sont induites par les processus de méthylation (liaison avec un groupement méthyle CH3) et de déméthylation (dissociation de ce même groupement) du Hg.
Après sédimentation, 25% du iHg piégé est remobilisé dans le milieu aquatique principalement par diffusion passive, bioturbation ou hydrodynamisme et 24% du Hg libéré est présent sous forme méthylée (Covelli et al., 1999). Les 75% de iHg restant dans les sédiments se complexent avec des composés comme les sulfures, les oxydes de fer ou le manganèse pour former des composés inorganiques tels que le HgS et le HgS2²- ou se complexent avec des matières organiques en décomposition, des acides fulviques ou humiques (acide acétique, acide salicylique, EDTA, cystéine) pour former des composés organiques tels que le MeHg (Covelli et al., 1999, Falter, 1999, Horvat et al., 1999, Gabriel et Williamson, 2004). Le MeHg formé est ensuite soit déméthylé par réactions biotiques ou abiotiques et redevient du iHg, soit absorbé par les micro-organismes (phytoplancton, zooplancton) puis bioaccumulé et bioamplifié dans la chaîne alimentaire. Dans l’eau, les organomercures peuvent être transférés de la phase particulaire à la phase dissoute par des processus réversibles d’adsorption et désorption sur des particules minérales, organiques ou biogéniques (Gabriel et Williamson, 2004, Ogrinc et al., 2007, Bengtsson et Picado, 2008). La concentration en MeHg dans le système aquatique et les sédiments est dépendante des réactions de méthylation et déméthylation (M et D), oxydation-réduction et sorption-désorption. Le pourcentage de MeHg dans le HgT des sédiments ne dépasse généralement pas les 2%. Dans les océans, le MeHg vient principalement de trois sources : les sédiments estuariens et les plateaux océaniques, les sédiments au niveau des eaux profondes des océans et les colonnes d’eau océaniques (Whalin et al., 2007).

La spéciation du mercure dans l’environnement

Le Hg est présent dans l’ensemble des compartiments de l’environnement et possède de nombreuses formes physico-chimiques. La distribution du mercure dans l’environnement s’organise principalement autour de trois espèces, le Hg°, le mercure inorganique (iHg) et le MeHg, qui subissent toutes sortes de transferts et processus physico-chimiques et régissent la spéciation du Hg. Le Hg émis par voie naturelle ou anthropique, est principalement rejeté dans l’atmosphère où il est distribué selon les conditions climatiques. Il peut par exemple être oxydé en iHg et se déposer dans les sols et l’eau. Dans les milieux aquatiques et plus particulièrement au niveau des eaux de surfaces, le iHg est réduit en Hg° qui de nouveau se volatilise dans l’air. Sinon, le iHg peut être méthylé par des processus biotiques ou abiotiques ou être sédimenté. Des réactions inverses peuvent également être observées avec la déméthylation biotique ou abiotique du MeHg formé. Dans les sédiments, des processus de méthylation-déméthylation, de réduction-oxydation et d’adsorption-désorption sont constatés. Le MeHg va diffuser vers le milieu aquatique et par absorption va entrer dans la chaîne alimentaire où il sera bioaccumulé et bioamplifié. Certaines des réactions engagées dans le cycle biogéochimique du Hg sont bien connues mais la plupart restent encore peu ou pas définies. Les principaux facteurs influençant la spéciation du Hg sont les apports naturels et anthropiques de Hg, les paramètres environnementaux (pH, paramètres physicochimiques régulant la réactivité et la mobilité des contaminants) et les activités biologiques des organismes et micro-organismes aquatiques.

Toxicité du mercure

La toxicité de Hg dépend de sa forme. Le contact avec le Hg° liquide est cutané et donc accidentel (thermomètre cassé). Le Hg° gazeux est incolore, inodore et plus toxique car le contact se fait par inhalation (absorption pulmonaire comprise entre 75 et 85%), il est alors rapidement absorbé par les poumons et transporté dans les vaisseaux sanguins (PNUE 2005, INERIS 2006).
L’exposition au iHg est faite par voie orale (accident, suicide) et le taux d’absorption par l’organisme est compris entre 7 et 15% (PNUE 2005, INERIS 2006). Cette espèce peut être à la base d’insuffisances rénales et de lésions gastro-intestinales. Le MeHg est la forme la plus toxique du Hg. L’exposition à ce composé se fait principalement par voie orale. Il est facilement absorbé (taux d’absorption = 95%) et difficilement excrété (70 à 80 jours de résidence dans l’organisme) par l’organisme vivant. De plus, il est facilement bioaccumulé et bioamplifié. Les principales cibles du MeHg sont le cerveau et le fœtus (PNUE 2005, INERIS 2006). La source majeure d’exposition au MeHg pour l’homme est la consommation de poisson et plus particulièrement de poissons piscivores. Les autres sources alimentaires contenant du Hg présentent essentiellement cet élément sous forme de iHg et à des teneurs beaucoup plus faibles (AFSSA 2002, Millour et al.,2011).

Devenir du méthylmercure dans l’organisme humain

L’absorption par voie orale est la principale voie d’exposition au MeHg (95% absorbé par l’organisme). Il est ingéré et absorbé par l’estomac et le tractus gastro-intestinal. Le MeHg peut alors se lier aux groupements thiols de certains ligands comme la cystéine ou l’albumine. Le complexe MeHg-cystéine mime la méthionine, un acide aminé présent dans l’organisme, ce qui permet au Hg d’entrer dans les cellules et d’être distribué dans l’ensemble de l’organisme via le système sanguin. Il est ensuite excrété par la bile sous la forme d’un complexe MeHg-glutathionne, redistribuée par le système sanguin ou déméthylé et éliminé dans les fèces (Clarkson et al., 2007). Le Hg peut également se lier aux molécules constituant la cellule vivante (acide nucléique, protéines, etc.) modifiant ainsi leur structure et/ou inhibant leurs activités biologiques. Le MeHg se fixe préférentiellement aux cellules nerveuses et provoque par le biais de réactions d’oxydation leur dégénérescence. Par le biais de transporteurs, le MeHg peut également franchir la barrière hémato-encéphalique et s’accumuler dans le cerveau ou la barrière foeto-placentaire et inhiber l’activité des enzymes responsables de la croissance des neurones lors du développement du cerveau, provoquant des malformations et des retards dans le développement de l’enfant (Kerper et al., 1996, Morel et al., 1998, Budtz-Jorgensen et al., 2004, Clarkson et al., 2007, Grandjean et Perez, 2008, Bensefa-Colas et al., 2010).

Exposition chronique

L’organe cible de l’exposition au MeHg est le cerveau mais la vue, l’ouïe et les zones du cerveau impliquées dans la coordination motrice peuvent également être affectées. Des effets portant sur le système cardio-vasculaire et immunitaire ont été décrits (NRC 2000, Mozaffarian, 2009, Gardner et al., 2010) mais sont moins étudiés que les effets neurotoxiques. Des études sur une éventuelle relation entre une exposition au MeHg et une réponse cancérogène ont également été menées mais aucune corrélation n’a été démontrée (Crespo-Lopez et al., 2009, Wilson et al., 2009).
Les premiers symptômes induits par l’exposition par voie orale au MeHg sont le plus souvent d’ordre neurologique : sensations de fourmillement au niveau des extrémités des membres, réduction du champ de vision, perte du goût, de l’odorat et de l’ouïe, irritabilité, perte de mémoire, difficulté à s’endormir et dépression. L’exposition est essentiellement chronique, le plus souvent après une consommation importante de nourriture contaminée en MeHg. Dans le cas le plus extrême, une contamination au MeHg peut entraîner la mort.

Spéciation du mercure dans les produits de la pêche 

Au cours des dernières décennies, de nombreuses revues de synthèse abordant la spéciation du Hg ont été publiées (Cano-Pavon et al, 1999, Carro et Mejuto, 2000, Harrington, 2000, Bouyssiere et al., 2002, Siepak et Boszke, 2004, Leermakers et al., 2005, Stoichev et al., 2006, Bjorn et al., 2007). Les méthodes analytiques développées font intervenir toutes sortes de techniques de préparation d‟échantillon (solide-liquide (SLE), extraction assistée par micro-ondes (MAE), micro-extraction sur phase solide (SPME), etc.) (Sparr Eskilsson et Bjorklund, 2000, Gomez-Ariza et al., 2001, Diez et Bayona, 2008, Issaro et al., 2009), de séparation (chromatographie en phase gazeuse (GC), chromatographie en phase liquide (HPLC), etc.) (Carro et Mejuto, 2000, Harrington, 2000) et de détection (spectrophotométriques, spectroscopies atomiques, spectrométrie de masse (MS), etc.) (Lobinski et Adams, 1997, Bjorn et al., 2007). L’apparition de la spectrométrie de masse couplée à un plasma induit (ICP-MS) dans les années 90 a permis d’améliorer considérablement les performances analytiques et la qualité des mesures. La lecture de l’ensemble de ces travaux montre que l’utilisation d’une séparation par GC et d’une détection par ICP-MS est le couplage le plus répandu, en raison de ses capacités multi-élémentaires, de sa large gamme dynamique et de sa capacité à mener des analyses en dilution isotopique (ID) (Lobinski et Adams, 1997, Bouyssiere et al 2002, Wuilloud et al., 2004, Bjorn et al., 2007, Popp et al., 2010). La mise en œuvre d’une technique d’analyse des espèces organomercurielles requiert des procédures qui comportent typiquement les étapes suivantes : extraction et/ou enrichissement de la matrice, dérivation, nettoyage (si nécessaire), séparation chromatographique et détection sélective. Chaque étape reste critique pour la justesse et la comparabilité des résultats finaux (Leermakers et al 2005). Les exigences requises pour déterminer la spéciation du Hg dans les matrices environnementales et biologiques sont très rigoureuses, nécessitant des limites de quantification (LQ) de l‟ordre du ng L-1 ou du µg kg-1, une spécificité importante pour éviter les interférences de la matrice tout en permettant la détermination simultanée des différentes espèces d’intérêt, une excellente justesse et fidélité (répétabilité et reproductibilité).
Il convient de noter qu’il n’existe, à notre connaissance, aucune méthode de spéciation du Hg normalisée ou validée en inter- et intra-laboratoire(s) en France et que par conséquent, il existe un réel besoin concernant le développement d’une méthode validée voire normalisée au niveau international, pour la production de données fiables des teneurs en MeHg dans les aliments. Il existe une méthode normalisée américaine nommée « EPA Method 6800: elemental and speciated isotope dilution mass spectrometry » mais celle-ci n’est pas spécifique au mercure (EPA 6800).

Table des matières

Introduction générale 
Partie I : Problématique du mercure 
I. Généralités 
I.1 Propriétés
II. Le cycle biogéochimique du mercure 
II.1 Sources d’émissions
II.1.1 Sources naturelles
II.1.2 Sources anthropiques
II.2 La spéciation du mercure dans l’environnement
II.3 Réactivité du mercure dans l’environnement
II.3.1 Oxydation et réduction
II.3.2 Méthylation et déméthylation
II.3.3 Bioamplification et bioaccumulation
III. Toxicité du mercure 
III.1 Devenir du méthylmercure dans l’organisme humain
III.2 Exposition chronique
III.3 Indicateurs d’exposition au méthylmercure
III.4 Données cliniques
III.4.1 Intoxications de Minamata et Niigata au Japon
III.4.2 Intoxication en Iraq
III.5 Données épidémiologiques
III.6 Valeurs toxicologiques de référence
III.7 Valeurs réglementaires
III.8 Evaluation de l’exposition humaine au mercure
IV. Conclusion 
Partie II : Optimisation de la méthode de spéciation du mercure dans les produits de la pêche par DID et GC-ICP-MS 
I. Introduction 
II. Spéciation du mercure dans les produits de la pêche : état de l’art 
II.1 Méthode de préparation d’échantillon
II.1.1 Extractions solide/liquide (SLE)
II.1.2 Extractions assistée par sonication (SAE)
II.1.3 Extractions assistée par micro-ondes (MAE)
II.1.4 Méthode alternative
II.1.5 Conclusion
II.2 Méthode de séparation et de détection
II.2.1 Séparation par chromatographie liquide haute performance
II.2.2 Les détecteurs de spectrométrie atomique couplés à l’HPLC
II.2.3 Les détecteurs de spectrométrie de masse couplés à l’HPLC
II.2.4 Séparation par chromatographie en phase gazeuse
II.2.5 Les détecteurs de spectrométrie atomique couplés à la GC
II.2.6 Les détecteurs de spectrométrie de masse couplés à la GC
II.2.7 Conclusion
II.3 La dilution isotopique
II.3.1 Principe
II.3.2 Modes de calcul
II.3.3 Avantages et inconvénient
II.3.4 Conclusion
III. Bilan sur l’état de l’art (REVUE I) 
IV. Mise en place du couplage 
IV.1 Préambule
IV.2 Le couplage GC-ICP-MS
IV.2.1 Séparation par GC
IV.2.2 Interface entre le GC et l’ICP-MS
IV.2.3 Détection par ICP-MS
V. Conditions expérimentales 
V.1 Instrumentation
V.2 Echantillons et matériaux de référence certifiés
V.3 Préparation des échantillons avant analyse
V.3.1 Préparation physique des échantillons
V.3.2 Préparation chimique des échantillons
V.4 Quantification des espèces mercurielles
VI. Résultats et discussion 
VI.1 Optimisation de l’étape de marquage isotopique
VI.2 Optimisation de l’étape d’extraction
VI.3 Optimisation de l’étape de dérivation
VI.4 Evaluation des différentes techniques de calcul par dilution isotopique
VI.4.1 Quantification des taux de méthylation et déméthylation
VI.4.2 Vérification de la fiabilité des feuilles de calculs par IPD
VI.4.3 Analyse statistique des sources d’erreur
VII Validation interne de la méthode d’analyse 
VII.1 Mise en place de la procédure de validation de la méthode
VII.1.1 Espèces analysées et matériaux utilisés
VII.1.2 Qualification de l’appareil
VII.1.3 Paramètres de mesure
VII.2 Limites de détection et de quantification
VII.3 Répétabilité
VII.4 Fidélité intermédiaire de reproductibilité
VII.5 Justesse
VII.6 Profil d’exactitude
VII.7 Conclusion sur la validation de méthode
VIII. Conclusions et perspectives 
Partie III : Applications de la méthode à des études sur la spéciation du mercure dans des matrices biologiques
I. Introduction
II. Contrôles qualités internes (CQI) mis en place 
III. Contrôles qualités externes (CQE) effectués 
IV. Applications 
IV.1 Étude des échantillons lyophilisés d’anguilles et de civelles
IV.1.1 Contexte de l’étude
IV.1.2 Résultats expérimentaux (ARTICLE I)
IV.1.3 Discussion
IV.1.4 Conclusion
IV.2 Impact de la lyophilisation sur la spéciation du Hg
IV.2.1 Contexte de l’étude
IV.2.2 Résultats expérimentaux et discussion
IV.2.3 Conclusion
IV.3 Étude des échantillons lyophilisés de l’EAT 2
IV.3.1 Contexte de l’étude
IV.3.2 Résultats expérimentaux (ARTICLE II)
IV.3.3 Résultats complémentaires et discussion
IV.3.4 Conclusion
V. Conclusion et perspectives de la partie III 
Partie IV : qualité en recherche 
Conclusions générales et perspectives 
Bibliographie

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