OPTIMISATION DE LA METHODE DE DOSAGE DE LA FB1

OPTIMISATION DE LA METHODE DE DOSAGE DE LA FB1

Dosage de la FB1
Extraction et purification à partir du plasma.

L’extraction est la première étape pour la récupération de fumonisine dans les matrices. Pour les échantillons liquides (plasma, urine ou milieu de culture liquide) seule une étape d’homogénéisation dans un solvant est nécessaire. Les fumonisines sont hydrosolubles et les solvants le plus souvent utilisés sont des mélanges eau-acétonitrile (1-1) ou méthanol-eau .L’étape de purification a pour but d’éliminer les molécules de configuration proche des fumonisines et qui pourraient interférer lors du dosage. Ce sont principalement des lipides et des protides. Différents procédés ont été validés pour la purification d’échantillons provenant de matrice végétale. Les méthodes les plus utilisées nécessitent un passage sur phase solide, comme des colonnes échangeuses d’ions, des colonnes greffées C18 ou des colonnes d’immuno-affinité. Pour la purification du plasma ce sont les colonnes échangeuses d’ions qui sont le plus souvent utilisées avec quelques modifications méthodologiques par rapport à leur emploi lors de la purification de matrice végétale [35]. La méthode utilisant la colonne de silice greffée [36] est beaucoup moins utilisée car elle entraîne une moins bonne séparation de la FB1. Les colonnes d’immuno-affinité sont également peu utilisées : elles donnent de très bons résultats mais elles sont plus coûteuse [37]. Les travaux présentés ci-après ont porté sur l’étude des méthodes d’extraction
suivantes :
– extraction sans délipidation au chloroforme,
– extraction avec délipidation préalable au chloroforme,
– extraction avec passage sur colonnes échangeuses d’ions,
– extraction avec passage sur colonnes d’immuno-affinité.
La meilleure de ces méthodes sera sélectionnée pour purifier les plasmas de
canards.

Extraction sans délipidation au chloroforme

500µl de plasma sont prélevés, auxquels sont ajoutés 1ml de la solution de tampon borate de pH= 5,8 et 1,5ml d’acétonitrile. Le mélange obtenu est agité pendant 30 minutes puis centrifugé pendant 40 minutes à 4000 tours par minute (rpm). Le surnageant est récupéré et évaporé à sec sous azote à une température comprise entre 55°C et 65°C. Le résidu sec est récupéré dans 500 µl de mélange eau et acétonitrile de proportion 1-1 puis filtré à l’aide de filtres à seringue à pores de 0,45 µm. La solution obtenue est dérivatisée et injectée au système HPLC. Cette méthode fut utilisée lors d’études précédentes au laboratoire. Cette méthode est appelée méthode «
Témoin » Elle est présentée dans la figure n°2. Une autre méthode très similaire à la précédente est testée. Elle est identique à la « méthode témoin » excepté le fait que le plasma est dilué trois fois dans de l’eau lors du mélange initial. Cette méthode est appelée méthode « Dilution ».

Extraction avec délipidation préalable au chloroforme

Plusieurs méthodes utilisant une étape préalable de délipidation au chloroforme ont été testées. Cette étape a pour but de purifier l’échantillon solubilisant les lipides
dans le chloroforme afin de les éliminer.
Cinq méthodes reposant sur ce principe ont été utilisées :
– utilisation du chloroforme seul : 500 µl de plasma sont prélevés et mélangés à 500 µl de chloroforme. Cette méthode est appelée méthode « Chloroforme neutre »,
– ajout de 10 µl d’acide chlorhydrique 1M au mélange initial. Cette méthode est appelée méthode «Chloroforme HCl »,
– ajout de 50 µl d’acide trichloracétique à 99,5% au mélange initial. Cette méthode est appelée méthode « Chloroforme TCA »,
– ajout de 10 µl d’hydroxyde de sodium 1M au mélange initial. Cette méthode est appelée méthode «Chloroforme NaOH ».
Quelle que soit la composition du mélange, il est agité pendant 20 minutes et centrifugé 30 minutes à 4000 rpm. .
Seule la phase aqueuse est récupérée et 1,5 ml d’acétonitrile et 1 ml de tampon borate de pH 5,8 y sont ajoutés. Le tout est agité pendant 30 minutes, centrifugé 40 minutes à 4000 rpm. Le surnageant est récupéré, évaporé à sec et repris dans 500 µl de mélange eau/acétonitrile de proportion 1-1. La solution obtenue est filtrée sur des filtres à
seringue, dérivatisée et injectée au système HPLC.

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Table des matières

TABLE DES ILLUSTRATIONS
I. INTRODUCTION
II. MATERIEL ET METHODES
1. MATERIEL
2. REACTIFS
3. ANIMAUX
4. DOSAGE DE LA FB1
4.1. Extraction et purification à partir du plasma
4.1.1. Extraction sans délipidation au chloroforme
4.1.2. Extraction avec délipidation préalable au chloroforme
4.1.3. Extraction avec solubilisation des fumonisines dans la phase chloroformique
4.1.4 .Extraction avec passage sur colonnes échangeuses d’ions
4.1.5. Extraction avec passage sur colonnes d’immuno-affinité
4.2. Détection et quantification
III. RESULTATS ET DISCUSSION
1. OPTIMISATION DE LA METHODE DE DOSAGE
1.1. Optimisation de la dérivatisation
1.1.1. Sélection de la meilleure méthode de dérivatisation
1.1.2. Validation de la méthode de dérivatisation.
1.2. Optimisation de l’extraction – purification
1.2.1. Résultats obtenus avec des plasmas non supplémentés
1.2.2. Résultats obtenus avec des plasmas supplémentés en FB1
1.2.3. Comparaison des méthodes « Témoin » et « SAX »
2. TRAITEMENT DES ECHANTILLONS.
2.1. Calcul du coefficient d’extraction (CE).
2.2. Variation des teneurs en fumonisine B1 dans le plasma suite à différentes administrations orales
2.2.1. Limites de détection
2.2.2. Analyse statistique des résultats obtenus
2.3. Utilisation des colonnes d’immuno-affinité
IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES.
BIBLIOGRAPHIE