Soutenance mémoire
La leucémie traduit un dysfonctionnement de l’hématopoïèse, qui elle-même traduit le renouvellement permanent des cellules circulant dans le sang. La leucémie prend une forme différente chez chaque patient, c’est la raison pour laquelle on cherche à constituer des groupes selon certains critères, comme la ou les lignée(s) cellulaire(s) concernées(s) par le dysfonctionnement et la rapidité d’évolution de la maladie. Nous allons nous focaliser ici sur les leucémies de type aiguës myéloïdes, et montrer comment on peut améliorer l’efficacité des traitements actuels de chimiothérapie en ciblant le métabolisme des cellules tumorales.
L’hématopoïèse normale
La moelle osseuse : siège de l’hématopoïèse
Le terme moelle osseuse désigne l’ensemble des cellules logées à l’intérieur des os et impliquées dans l’hématopoïèse. On distingue deux différentes formes de moelles. La première est la moelle jaune formant un tissu adipeux. La seconde forme est la moelle rouge. Cette dernière est constituée de l’ensemble des cellules engagées dans un processus de différenciation vers des cellules sanguines matures, qui iront renouveler de manière continue le stock de cellules circulant dans le sang. En effet, les cellules sanguines circulantes ont une durée de vie prédéfinie selon leur type cellulaire, ainsi environ 10¹² cellules sont produites par jour par la moelle osseuse d’un adulte humain pour supplanter les cellules mourant par le mécanisme d’apoptose. C’est l’ensemble des processus biologiques impliqués dans ce mécanisme de régulation qui est englobé sous le terme hématopoïèse. Au cours de la croissance, le nombre total de cellules sanguines augmente et la moelle osseuse occupe l’ensemble du squelette.
Les constituants de la moelle osseuse sont classés selon deux groupes : les cellules souches hématopoïétiques, parentes de la totalité des cellules sanguines, et le stroma médullaire constitué de tous les autres occupants (cellulaires ou non), qui en émettant des signaux chimiques, vont guider les cellules engagées dans la différenciation vers tel ou tel type de cellule sanguine.
Les cellules souches hématopoïétiques
La recherche portant sur les cellules souches hématopoïétiques (HSC) a commencé en 1956 suite à une expérience qui a montré qu’une souris irradiée à une dose létale est capable de survivre si l’irradiation est suivie d’une greffe de moelle osseuse [1]. Cela démontre que la moelle osseuse, contrairement au sang circulant, contient l’ensemble des éléments nécessaires au rétablissement d’une hématopoïèse normale.
Les HSC, contrairement aux cellules souches embryonnaires sont pré-engagées dans un processus de différenciation puisqu’elles seront exclusivement à l’origine de cellules sanguines [2]. Plutôt que d’être totipotentes, les HSC sont alors désignées comme multipotentes. Leur autre caractéristique majeure réside en leur capacité d’auto-renouvèlement, c’est-à-dire qu’elles sont susceptibles de donner naissance à un progéniteur qui perdra cette capacité, mais aussi à un clone tout à fait identique. Alors que certaines HSC sont actives, d’autres sont en état de dormance ou quiescence, un état entretenu par le stroma médullaire. On distingue les HSC des cellules souches mésenchymateuses (MSC), qui présentent les mêmes caractéristiques intrinsèques, mais qui vont quant à elles donner naissance à une grande variété de cellules impliquées indirectement dans l’hématopoïèse, telles que les cellules constituant les os, le cartilage, la graisse, les tendons, les muscles, donc ce qui forme les constituants cellulaires du stroma médullaire [3]. Les HSC évoluent en très forte minorité au sein de la moelle osseuse puisqu’elles représentent environ une cellule sur un million. Elles sont généralement identifiées par des techniques d’immunophénotypages consistant à adresser des anticorps à des marqueurs de surface pré-identifiés comme étant propres aux HSC tel que CD34 [4]. Par opposition, des cellules différentiées présentent à leur surface d’autres types de marqueurs tel que CD38 [5]. Ainsi lorsqu’anti-CD34 se fixe à une cellule et qu’anti-CD38 ne s’y fixe pas, on considère la cellule en question comme étant une cellule souche hématopoïétique, ou pour les plus prudents une cellule CD34+CD38- mais dans l’usage courant ces termes sont des synonymes. La technique de cytométrie en flux permet finalement, grâce au marquage par des anticorps, d’identifier et d’isoler les HSC à partir d’une population cellulaire hétérogène.
Le parcours de différenciation des cellules sanguines
Ce sont ainsi les HSC qui donnent naissance à des cellules s’engageant dans le processus de différenciation, pour graduellement passer du stade de progéniteur, à celui de précurseur . La cellule souche débute son parcours de différenciation en prenant la forme soit d’un progéniteur myéloïde, soit d’un progéniteur lymphoïde. Le progéniteur myéloïde va, par une cascade de différenciation, pouvoir donner naissance aux cellules matures que sont les globules rouges, les globules blancs, et les plaquettes, tandis que le progéniteur lymphoïde donnera naissance à des lymphocytes B ou T. Les globules rouges ont pour rôle de transporter l’oxygène, les plaquettes sont l’acteur principal du système de coagulation, les globules blancs et les lymphocytes vont quant à eux participer d’une manière ou d’une autre à l’action du système immunitaire. C’est au cours de leur migration depuis la moelle osseuse vers le sang que va se dérouler l’ensemble du processus de différenciation, autrement dit notre sang contient normalement exclusivement des cellules matures. L’hématopoïèse représente donc une mécanistique extrêmement complexe, où les processus de divisions cellulaires et de différenciation s’exécutent en parallèle.
Les leucémies aiguës myéloblastiques
Les différents types de leucémies
La leucémie traduit un dysfonctionnement de l’hématopoïèse, elle est classée dans la catégorie des hémopathies malignes, qui sont elles-mêmes englobées sous le terme « cancer du sang ». On distingue principalement quatre types de leucémies, d’abord en fonction de leur rapidité d’évolution par l’intermédiaire des termes aigu ou chronique, ensuite par le progéniteur commun identifié comme responsable du déficit de différenciation : il peut être myéloïde ou lymphoïde. Cette classification permet donc de définir les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL), les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC), les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), et les leucémie myéloïdes chroniques (LMC). Nous nous focaliserons par la suite sur les leucémies de type aiguë myéloïde. Celles-ci se traduisent par la prolifération incontrôlée de cellules immatures dans la moelle osseuse mais aussi dans le sang. En plus de ne pas parvenir au stade final de différenciation, ces cellules nommées alors blastes, connaissent un déficit de mort par apoptose. Les symptômes sont alors graves et tellement nombreux qu’il est difficile de tous les lister. Le déficit en globules rouges (anémie) va entrainer un manque d’oxygénation dans tout l’organisme, le déficit en globules blancs (neutropénie) va rendre inefficace le système immunitaire ce qui est à l’origine d’infections graves et répétées, alors que le déficit en plaquettes (thrombopénie) va favoriser l’apparition d’hémorragies et rendre la coagulation presque impossible. Enfin, l’accumulation à tendance exponentielle de cellules immatures dans les os, le sang, voire même dans certains organes, va provoquer des gonflements extrêmement douloureux.
Tous ces symptômes ne sont pas systématiques car la maladie prend une forme différente selon chaque patient. C’est pourquoi dès les années 1970, des chercheurs français, anglais et américains ont mis en place un système de sous-classification, la classification FAB [6], définissant sept sous-classes en fonction du degré d’indifférenciation observé et permettant donc, selon des critères morphologiques, d’adapter au mieux le traitement en fonction du patient concerné.
Depuis, ce système de classification n’a de cesse d’évoluer dans le but de toujours adapter au mieux le traitement au patient. L’organisation mondiale de la santé (OMS ou WHO) [7], a mis à jour la classification FAB en prenant en compte en plus des données morphologiques, des données immunologiques, cytogénétiques et cliniques, permettant de redéfinir sept sous-groupes :
1 – LAM avec des anomalies génétiques récurrentes,
2 – LAM avec dysplasies multilignées,
3 – LAM liées à des thérapies,
4 – LAM n’entrant pas dans les catégories précédentes,
5 – Sarcome myéloïde,
6 – Proliférations myéloïdes liées au syndrome de Down (ou trisomie 21),
7 – LAM de lignée ambiguë.
|
Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
ONCOMETABOLISME ET LEUCEMIES AIGUËS MYELOÏDES
Introduction
I L’hématopoïèse normale
I.1 La moelle osseuse : siège de l’hématopoïèse
I.2 Les cellules souches hématopoïétiques
I.3 Le parcours de différenciation des cellules sanguines
II Les leucémies aiguës myéloblastiques
II.1 Les différents types de leucémies
II.2 Les leucémies en chiffres
II.3 La prise en charge des patients atteints de LAM
III L’oncométabolisme dans les LAM
III.1 Introduction de la notion d’oncométabolisme
III.2 Relations entre le métabolisme des blastes leucémiques et la chimiorésistance
III.3 Agir sur le métabolisme pour sensibiliser aux traitements
IV La mitochondrie
IV.1 Son origine
IV.2 Ses caractéristiques morphologiques
IV.3 La phosphorylation oxydative
IV.4 La production d’espèces réactives oxygénées
IV.5 Hétérogénéité mitochondriale au sein de la cellule unique
Conclusion
Bibliographie
LES METHODES ACTUELLES D’ANALYSE DE LA FONCTION MITOCHONDRIALE
Introduction
I Les outils utilisés en routine dans les laboratoires de biologie : mesure de la consommation d’oxygène
I.1 L’électrode de Clark
I.2 L’Oroboros
I.3 Les Seahorse XF analyzers
I.4 Comparaison des différentes solutions
II Les outils utilisés en routine dans les laboratoires de biologie : mesure de la production d’espèces réactives oxygénées
II.1 Caractéristiques des principaux ROS étudiés
II.2 Liste des différentes approches
II.3 Description des méthodes de mesures optiques
II.4 Conclusion
III Etat de l’art des outils tendant vers l’analyse de la cellule unique par des méthodes électrochimiques
III.1 Ultramicroélectrodes insérées dans un capillaire en verre
III.2 Ultramicroélectrodes planaires
III.3 Micropuits instrumentés
III.4 Ultramicroélectrodes appliquées à la mesure d’espèces réactives oxygénées
Conclusion
Bibliographie
CONCEPTION DU MICRODISPOSITIF D’ANALYSE ÉLECTROCHIMIQUE
Introduction
I Les principes de l’électrochimie
I.1 La réaction électrochimique
I.2 Notions d’électrode et de potentiel d’électrode
I.3 Les modes de transport de la matière en solution
I.4 Régime stationnaire et régime transitoire
II La cellule électrochimique et l’ampérométrie aux ultramicroélectrodes
II.1 La cellule électrochimique
II.2 La chute ohmique et le montage à trois électrodes
II.3 Méthodes analytiques ampérométriques
II.4 Courants faradiques et capacitifs
II.5 La théorie des ultra-microélectrodes
III Théorie appliquée à la structure du micropuits sélectionnée
III.1 Choix de la configuration des micropuits instrumentés
III.2 Théorie de l’électrochimie appliquée aux UME intégrées dans un micropuits : le micro-disque encastré
III.3 Théorie de l’électrochimie appliquée aux UME intégrées dans un micropuits : le nano-anneau encastré
IV. Simulation
IV.1 Définition et validation du modèle de simulation
IV.2 Définition des paramètres géométriques de la structure pour l’optimisation du taux de collecte
IV.3 Mode générateur-collecteur
IV.4 Performances optimisées d’un réseau de micropuits instrumentés
Conclusion
Bibliographie
FABRICATION DES MICRODISPOSITIFS ÉLECTROCHIMIQUES ET DU SYSTEME ASSOCIE
Introduction : le système ElecWell de première génération
I Le système ElecWell de seconde génération
I.1 Adapter le microsystème à une solution commerciale
I.2 Définition de la nouvelle structure du micropuits
I.3 Matériaux isolants
I.4 Matériaux conducteurs
II Techniques de microfabrication associées
II.1 La photolithographie
II.2 Procédés additifs : dépôts de matériaux
II.3 Procédés soustractifs : la gravure et le « lift-off »
III Dessins des masques et réalisation technologique
III.1 Dépôts d’oxydes et métallisations
III.2 Passivation et ouverture des contacts des nanoélectrodes
III.3 Ouverture des contacts des microélectrodes et formation des micropuits
IV Etapes de fabrication hors salle blanche
IV.1 Assemblage
IV.2 Modification de la fluidique
IV.3 Validation du système complet
Conclusion
Bibliographie
CARACTERISATIONS ÉLECTROCHIMIQUES, MODIFICATIONS DES PROPRIETES DES SURFACES, ET APPLICATION A L’ANALYSE DU METABOLISME DE MITOCHONDRIES ISOLEES
Introduction
I Caractérisation des performances électrochimiques
I.1 Voltamogramme du platine
I.2 Détermination des surfaces actives
I.3 Influence de la distance centre-à-centre
I.4 Mode générateur-collecteur
II Modifications des propriétés des surfaces
II.1 Fabrication d’une UME de quasi-référence : électropolymérisation du pyrrole
II.2 Modification de l’électrode de travail : électrodépôt de noir de platine
II.3 Immobilisation d’anticorps
II.4 Couche anti-biofouling
III Application finale : analyse de l’activité métabolique de mitochondries isolées
III.1 Méthodes d’isolation
III.2 Remplissage des micropuits
III.3 Mesures optiques et électrochimiques
Conclusion
Bibliographie
CONCLUSION GENERALE
