Soutenance mémoire
Le système nerveux
Le système nerveux est un système biologique animal responsable de la coordination des actions avec l’environnement extérieur et de la communication rapide entre les différentes parties du corps (Simmons PJ, Young D, 1999). Anatomiquement, le système nerveux est composé de deux parties distinctes reliées entre elles :
Le système nerveux central (SNC), formé de l’encéphale et la moelle épinière. C’est le centre où sont traitées les informations et partent les influx nerveux de commande. C’est donc la partie qui perçoit et décide.
Le système nerveux périphérique (SNP) est fait des nerfs qui partent du SNC, se ramifient et le relient aux organes sensoriels, aux muscles et aux glandes. On distingue : les nerfs crâniens qui sont reliés à l’encéphale ; les nerfs rachidiens qui sont reliés à la moelle épinière. (Sanes DH et coll., 2006). Fonctionnellement, le système nerveux comporte deux parties :
Le système nerveux somatique qui, grâce à des nerfs efférents (qui partent du SNCvers les organes) commandent volontairement les muscles striés. C’est le système nerveux contrôlé par la volonté.
Le système nerveux autonome ou végétatif, qui échappe à la volonté et, grâce à des nerfs efférents, commandent les muscles lisses (muscles viscéraux), le muscle du cœur et les glandes. C’est le système nerveux involontaire. Comme le système nerveux autonome doit assurer l’homéostasie de l’organisme, c’est-à-dire la stabilité des conditions internes de notre corps en dépit des nombreuses perturbations, il est lui-même constitué de deux systèmes de commande antagonistes (Fig. 22) :
– le système nerveux (ortho)sympathique (dont les nerfs sont reliés par des synapses adrénergiques) qui gère les réactions d’urgence en le préparant à l’effort, au combat ou à la fuite (en accélérant le pouls, dilatant les pupilles, activant la sudation, stimulant la respiration et la circulation sanguine, libérant des sucres rapides à partir des réserves de glycogène du foie, etc.);
– le système nerveux parasympathique (dont les nerfs sont reliés par des synapses cholinergiques) qui permet la conservation de l’énergie et l’accomplissement normal des fonctions physiologiques (en ralentissant le pouls après l’effort, contractant les pupilles, calmant la respiration et la circulation sanguine ; il active aussi la digestion et l’excrétion en relâchant les sphincters et en activant les sécrétions digestives). Les viscères reçoivent des nerfs de ces deux systèmes, l’un stimulant l’activité de l’organe, l’autre l’inhibant.
Systèmes modulateurs diffus du cerveau
Ce système est constitué d’un petit ensemble de neurones (quelques milliers). Chaque neurone en influence beaucoup d’autres, car son axone très «branché» peut être en contact avec plus de 100000 neurones postsynaptiques distribués dans tout le cerveau. Les principaux systèmes modulateurs du cerveau sont associés aux neurotransmetteurs suivants : la noradrénaline (NA), la sérotonine (5-HT), la dopamine (DA), ou l’acétylcholine (ACh).
Neurones noradrénergiques du locus coeruleus : Le locus coeruleus est impliqué dans les processus attentionnels, l’éveil, et les cycles veille- sommeil, ainsi que dans l’apprentissage et la mémoire, l’anxiété, la douleur, l’humeur et le métabolisme du cerveau (Fig. 25).
Noyaux sérotoninergiques du raphé : Les groupes de neurones contenant de la sérotonine sont localisés dans les neuf noyaux du raphé (Fig. 26). Les plus postérieurs, au niveau bulbaire, sont connectés avec la moelle et modulent les messages sensoriels associés à la douleur. Les neurones sérotoninergiques du raphé jouent aussi un rôle dans la régulation de l’humeur et de certains types de comportements émotionnels comme dans le contrôle de l’agressivité.
Neurones dopaminergiques de la substance noire et du tegmentum mésencéphalique ventral. Deux groupes de neurones dopaminergiques présentent les caractéristiques des systèmes modulateurs diffus (Fig. 27). L’un a son origine dans la substance noire (substancia nigra dans le mésencéphale. Ces neurones se projettent sur le striatum (noyau caudé et putamen), où ils facilitent l’initiation des mouvements volontaires. La dégénérescence des neurones dopaminergiques de la substance noire est responsable de la maladie de Parkinson (Bunney BS, 1984). Le deuxième groupe vient du mésencéphale ; représenté par un groupe de cellules très proche de la substance noire, siégeant dans la partie ventrale du tegmentum mésencéphalique (aire tegmentale nigro-striatale). Il est impliqué dans un système de «récompense ».
Voies cholinergiques du cerveau antérieur basal et du tronc cérébral : Il existe dans le cerveau deux systèmes cholinergiques modulateurs diffus majeurs, dont l’un d’eux représente le complexe du cerveau antérieur basal. Ce complexe est impliqué dans la régulation de l’excitabilité du cerveau en général durant l’éveil cortical et les cycles veille- sommeil et pourrait aussi jouer un rôle particulier dans l’apprentissage et la mémorisation. Le second système cholinergique diffus porte le nom de complexe cholinergique pontomésencéphalotegmental, composé de cellules du pont et du tegmentum mésencéphalique utilisant l’acétylcholine comme neurotransmetteur. Ce système influence principalement le thalamus dorsal, où, avec les systèmes noradrénergique et sérotoninergique, il régule l’excitabilité des relais sensoriels spécifiques (Fig. 28).
Enquête ethnobotanique
Les enquêtes ethnobotaniques ont été effectuées dans le cadre du projet FADES. Nous avons demandé auprès des guérisseurs l’utilisation et la partie utilisée de Neobeguea mahafalensis dans leur médecine traditionnelle. Des collectes et des recoupements d’informations ont été effectués auprès de la population locale dans la partie sud de Madagascar et des herboristes de la capitale. Nous avons enquêté sur la plante la plus utilisée et la plus vendue pour traiter le dysfonctionnement érectile.
Fractionnement de R2C sur LiChroprep RP-18
L’extrait R2C pesant 190 mg a été dissout dans 15 ml d’acétonitrile et 35 ml d’eau distillée. Le mélange trouble obtenu a été ensuite passé sur une colonne préparative de verre de 33 mm de diamètre et 420 mm de hauteur, remplie de LiChroprep RP-18 (Merck Chemical Co., Germany) équilibré préalablement à 5°C dans acétonitrile/eau 30% et d’acide trifluoroacétique à 0,1%. La colonne a été éluée par étape avec un mélange eau-acétonitrile-acide trifluoroacétique, respectivement à 70/30/0,1 suivi de 60/40/0,1 ; 50/50/0,1 ; 40/60/0,1 à 1 L de chaque, et enfin avec 30/70/0,1 à 1,5 L. La température de fonctionnement a été fixée à 5°C. Pour ce faire, la colonne a été enveloppée dans une glace. Le débit a été fixé à 1,5 ml/min et les fractions éluées ont été collectées dans des tubes de verre à 12 ml de chaque, à partir de tube 1 jusqu’au tube 440. Toutes les 10ème de ces fractions collectées ont été analysées sur HPLC utilisant une colonne analytique LiChroprep RP-18 (2,1 x 100 mm) avec un gradient linéaire préparé d’acétonitrile/eau de 20 à 80% et de 5mM additif d’acétate d’ammonium pendant 60 min ; le débit a été de 0,2 ml/min et la détection à 220 et 260nm. Les profils chromatographiques ainsi obtenus ont été enregistrés pour une utilisation ultérieure. Les tubes ont été regroupés en trois fractions comprenant les tubes de 1 à 257, 258-350 et 351-440, respectivement, et les fractions ainsi regroupées étaient lyophilisées, formant respectivement les extraits RA, RB et RC. Les trois extraits ont été solubilisés chacun dans 100 ml de 50% d’acétonitrile pour RA et RB, et 70% d’acétonitrile pour RC puis lyophilisés.
Elucidation structurale des libiguins
Les pouvoirs rotatoires spécifiques ont été mesurés sur un polarimètre Perkin-Elmer 241 à 20°C et 589nm. Les spectres RMN ont été enregistrés dans CDCl3 à 25 °C sur un spectromètre Varian UNITY INOVA 600 MHz équipé d’une sonde cryogénique, avec du TMS comme étalon interne. Les déplacements chimiques ont été exprimés en ppm (partie par million) et calibrés par rapport au TMS. Les constantes de couplage sont exprimées en Hertz (Hz). La multiplicité des signaux est donnée par les abréviations suivantes : s (singulet), d (doublet), t (triplet), m (multiplet), q (quadruplet), et br pour large. L’attribution des signaux des protons et des carbones a été effectuée à partir des expériences monodimensionnelles 1D (1H, 13C et DEPT- 135) et bidimensionnelle 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) en utilisant le logiciel TopSpinTM et MeshtrenovaTM. Les spectres de masses en haute résolution ont été réalisés sur les spectrométries de masse Q- Tof2 et Perkin Elmer PE SCIEX API 150EX simple quadrupole. Les spectres UV sont enregistrés dans le MeOH sur un spectrophotomètre Waters system 2690 équipé de photodiodes détecteurs 996 rayons.
Prélèvement et montage de l’organe
Le rat a été anesthésié puis sacrifié par section des carotides. L’aorte thoracique a été rapidement isolée, délicatement nettoyée et débitée transversalement en anneaux de 2 à 3mm de longueur. Chaque anneau a été placé dans une cuve à organe isolé de 20ml remplie de liquide physiologique de Krebs et Henseleit aéré par du carbogène (O2 95% et CO2 5%), avec un pH de 7,4 à 37°C, dont la composition est la suivante (en mM) : NaCl 118,5 ; NaHCO3 25; KCL 4,75; MgSO4 1,2; CaCl2 1,36; KH2PO4 1,2 et Glucose 11,1 L’anneau a été tendu une première fois à 2 g sous une tension isométrique, puis laissé se stabiliser pendant deux heures pendant laquelle le contenu de la cuve en solution de Krebs et Henseleit a été renouvelé toutes les 30 minutes. L’anneau a été de nouveau tendu à 2 g et stabilisé pendant 30 min. Chaque anneau a été sensibilisé par ajout de solution de Krebs enrichie en KCl à 100mM dans le bain. Sur les aortes, la présence d’endothélium fonctionnel est mise en évidence par l’effet relaxant de l’Acétylcholine à 10-6M.
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Table des matières
REMERCIEMENTS
LISTE DES PUBLICATIONS, BREVETS, COMMUNICATIONS ORALES, POSTERS, PARTICIPATION A DES COLLOQUES ET PRIX.
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABREVIATIONS
Introduction
Chapitre I : CONTEXE, HISTORIQUE ET DEVELOPPEMENT DE L’ETUDE
I.1. CONTEXTE
I.1.1 Institut Malgache de Recherches Appliquées
I.1.2 Laboratoire Biothérapeutique
I.2. HISTORIQUE
I.2.1. Le projet FADES (Fonds d’Appui pour le Développement de l’Enseignement Supérieur)
I.2.2 Rencontre en Afrique du Sud
I.2. VISITES, RECRUTEMENT ET STAGE
I.2.1. Visite du Professeur Jarl Wikberg à Madagascar
I.2.2. Recrutement de Solofoniaina Razafimahefa au Laboratoire de Biothérapeutique
I.2.3. 2ème Visite du Pr Wikberg à Madagascar
I.2.3. Visite du Professeur Rasoanaivo à l’université d’Uppsala, Suède
I.2.4 3ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar
I.2.5 4ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar
I.2.6 5ème visite du Pr Jarl Wikberg à Madagascar
I.2.3. Stage de Solofoniaina Razafimahefa à l’université d’Uppsala
I.3. RECHERCHE DE FINANCEMENT (FUND RAISING)
I.4. RESEAUTAGE (NETWORKING)
I.5. CONTACT AVEC L’INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE
Chapitre II : GÉNÉRALITÉS SUR LA PHARMACOLOGIE ET LA CHIMIE RELATIVES À L’ÉTUDE
II.1. CERVEAU ET COMPORTEMENT
II.2.1. Le système nerveux
II.2.2. Système nerveux et comportement
a- L’hypothalamus
b- Le système nerveux autonome
c- Systèmes modulateurs diffus du cerveau
II.2.3. Définition et concept du comportement
II.2.2. Biogénèse des limonoïdes
II.2.3. Structure et classification des limonoïdes orthoesters
Chapitre III : MATERIELS ET METHODES
III. 1. DÉCOUVERTE ET HÉMISYNTHÈSE DES LIBIGUINS
III.1.1. Enquête ethnobotanique
III.1.2. Collecte de Neobeguea mahafalensis
III.1.3. Extraction aqueuse
III.1.4. Fractionnement bioguidé et isolement de libiguins
a- Fractionnement de R2C sur LiChroprep RP-18
b- Isolement des libiguins R306 et R310
III.1.5. Elucidation structurale des libiguins
III.1.6. Hemisynthèse de libiguins et ses dérivés
a- Hemisynthèse de Libiguin E à partir de phragmaline
b- Hemisynthèse des Libiguins A, C et D à partir de phragmaline
III.1.7. Tests pharmacologiques
a- Animaux
b- Test de toxicité aigue
c- Test sur organe isolé
d- Test de comportement sexuel
III.1.9. Pharmacocinétique et étude préliminaire du mécanisme d’action de libiguin C (SAE5)
a- Etude pharmacocinétique de la libiguin C administré à dose unique par voie intra-veineuse chez les rats
b- Etude cinétique in vivo de la libiguin C chez les rats
c- Etude de la biodistribution de la libiguin C chez les rats
d- Etude in vitro de la liaison libiguin-récepteur
III.2. DECOUVERTE FORTUITE DE DODOGUIN
III.2.1. Extraction au dichlorométhane des écorces de racines de Neobeguea mahafalensis
III.2.2. Fractionnement chromatographique de l’extrait DCM
III.2.3. Isolement de dodoguin
III.2.4. Elucidation de la structure de dodoguin
a- Analyse de dodoguin sur HPLC
b- Analyse par CL/SM et détermination de la masse du dodoguin
III.2.5. Test d’effet inducteur du sommeil de dodoguin
III.3. DECOUVERTE FORTUITE DE GIDRAGUIN
III.4. ANALYSE DES RESULTATS
Chapitre IV : RESULTATS
IV.1. ETHNOBOTANIQUE
IV.2. BOTANIQUE
IV.3. PHYTOCHIMIE DES LIBIGUINS
IV.3.1. Extraction aqueuse
IV.3.2. Extraction chloroformique
IV.3.3. Isolement et purification des libiguins
a- Fractionnement de R2C
b- Isolement des Libiguins
IV.3.4. Elucidation des structures des libiguins
IV.4. PHYTOCHIMIE DE DODOGUIN
IV.4.1. Extraction dichlorométhane
IV.4.2.Fractionnement de l’extrait DCM
IV.4.3. Isolement et purification de Dodoguin A
IV.4.4. Détermination structurale de Dodoguin A
IV.6.1. Effet sur organe isolé
IV.6.2. Toxicite aiguë
IV.6.3 Effet sur le comportement
a- Effet de l’extrait aqueux RW sur le comportement sexuel des rats mâles
b- Effet des fractions issues de RW sur le comportement sexuel des rats mâles
c- Effet de RW sur le comportement sexuel des souris mâles
d- Effet de R2C administré par voie orale et sous-cutané à des doses croissantes sur le comportement sexuel des souris mâles
e- Test de comportement sexuel sur les fractions issues de R2C
f- Effet de R3004 à 4 mg/kg administré par voie orale et sous-cutanée
g- Effet de R306 cristallisé au 4, 7, 14 et 21ème jour du traitement à des doses croissantes de 0,004 à 0,4 mg/kg
h- Effet d’un produit hémisynthétique SAE5 ou libiguin C sur l’activité sexuelle des rats mâles
i- Effet inducteur du sommeil de la dodoguin sur les souris
j- Effet d’un produit intermédiaire de synthèse LG1725 ou GIDRAGUIN sur le comportement des souris
IV.7. PHARMACOCINETIQUE ET PHARMACODYNAMIE DE LIBIGUIN C
Chapitre V : DISCUSSION
V.1. PHYTOCHIMIE
V.2. DECOUVERTES PAR SERENDIPITE
V.3. ESSAIS PHENOTYPIQUES versus ESSAIS BASES SUR LES MECANISMES D’ACTION
V.4. PHARMACOLOGIE
V.4.1. Comportement sexuel
V.4.2. Comportement agressif
V.4.3.Effet inducteur du sommeil
V.4.4.Mécanisme d’action et relation structure activité
V.6. BREVETER OU PUBLIER
V.7. DEVELOPPEMENT ET PRODUCTION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES
ANNEXE
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