Neurotoxicité céllulaire au plomb

Neurotoxicité céllulaire au plomb

Matériels et Méthodes

Préparation de l’extrait de la plante et la répartition des animaux

Préparation de l’extrait aqueux de la plante

La plante Artemisia absinthium L. est récoltée dans la région de Bousfer (Oran) au mois de juin. Elle a été identifiée à partir de l’herbier du laboratoire de botanique à l’Université Ahmed Ben Bella, Oran 1. L’extrait aqueux d’Artemisia absinthium L. est préparée par addition de 5g de plante sèche entière dans 500 ml d’eau distillée par la méthode d’extraction thermique. Le mélange est porté à une température de 65° C pendant 60min, ce procédé a été répété plusieurs fois afin d’obtenir la quantité suffisante pour notre protocole expérimental, le filtrat a été lyophilisé puis stocké à -20°C jusqu’au moment de son utilisation (Kharoubi et al., 2008)

Etude phytochimique de la plante Artemisia absinthium L. (A. ab)

Extraction des huiles essentielles de la plante

Les plantes sont séchées à l’ombre pendant une semaine. La poudre de la plante est utilisée pour le procédé d’hydrodistillation (Mohammedi, 2004).

L’hydro distillation : cette technique fait intervenir quatre étapes :

➢ Entraînement à la vapeur d’eau Ce procédé se fait à l’aide d’un montage à distillation simple. Dans un ballon environ 50 g de matière végétale (à l’état sec ou broyé) sont mélangés à 750 ml d’eau distillée. L’eau est portée à ébullition, en prenant garde de ne pas chauffer jusqu’à sec pendant 2 h 30 min à 3 heures. La vapeur d’eau entraîne les produits organiques volatils qui se condensent dans le réfrigérant et qui sont recueillis à l’autre bout du montage. Le volume de distillat est d’environ 150ml.
➢ Décantation La décantation se réalise dans une ampoule à décanter de 250 ml dans laquelle le mélange précédent (le distillat) se sépare en deux phases non miscibles, par l’ajout d’un volume suffisant d’éther de pétrole ou éther diéthylique. L’ampoule est agitée fortement en prenant bien soin d’ouvrir régulièrement la valve afin de rétablir la pression à l’intérieur de celle-ci. Laisser reposer et décanter jusqu’à la séparation nette de deux phases. En général, la phase aqueuse, l’eau, plus dense, se situe dans la partie inférieure et la phase organique, de densité plus faible et contenant l’huile essentielle se situe au-dessus dans l’ampoule à décantation. La phase organique est recupérée dans un Erlen Mayer après l’élimination de la phase aqueuse.
➢ Séchage et filtration Dans l’Erlen Mayer de la phase organique un déshydratant est ajouté, environ 10 g de sulfate de magnésium anhydre ou sulfate de sodium (Na2SO4), est employé afin d’éliminer le peu d’eau susceptible d’avoir été retenue dans la phase organique. C’est l’opération de séchage. Une filtration par un papier filtre est ensuite effectuée pour ne recueillir que la phase organique exempte d’eau absorbé par la substance déshydratante. Recueillir le filtrat dans un ballon de 250 ml dans le but de procéder à l’étape suivante.
➢ Élimination du solvant organique Le solvant organique présent dans le filtrat, est enlevé à l’aide d’un évaporateur rotatif afin de récupérer les huiles essentielles. Il est important de régler le bain de l’évaporateur rotatif à la température d’évaporation de solvant utilisée puisque les huiles essentielles sont volatiles à des températures élevées. L’huile a été séchée dans la solution du chlorure de calcium anhydre et stockée dans une bouteille de verre brune ou bouteille en verre couverte d’aluminium de 50 ml avant analyse chromatographique. Le rendement en huile essentielle est le rapport entre le poids en huile essentielle extraite par l’entraînement à la vapeur et le poids entier de la plante. Le poids d’huile est la différence entre le poids de la fiole utilisé en évaporateur rotatif à l’état sec et leur poids après l’élimination de solvant. Le rendement exprimé en pourcentage est calculé par la formule.

Extraction liquide-liquide les substances bioactives de la plante

Après séchage de la plante entière dans un endroit sec et aéré, à l’abri de la lumière du soleil, la plante est broyée entièrement, puis pesée (m = 50 g). Une quantité de 30 g de poudre végétale est macérée dans 100 ml de méthanol pendant 72 h. Après filtration, le méthanol est évaporé par un évaporateur rotatif à une température de 60 °C sous vide. Le résidu sec obtenu est traité par 50 ml d’eau tiède pour l’obtention d’un extrait aqueux. Nous avons mis en œuvre une série d’extraction liquide-liquide dans des ampoules à décanter par des solvants non miscibles à l’extrait aqueux. Cette opération permet la séparation d’un ou de plusieurs constituants par l’utilisation de leur distribution inégale dans deux liquides pratiquement non miscibles. Elle consiste en l’addition de 30 ml de l’éther de pétrole pour éliminer la fraction lipidique dans l’extrait aqueux. On additionne avec l’extrait aqueux 3×30 ml de chloroforme pour élimine la chlorophylle et les lipides. Ensuite, l’addition de 3×30 ml d’acétate d’éthyle permet d’éliminer les monoside et entraîne la majorité des hétérosides flavoniques.
Au cours de ces différentes étapes, nous récupérons la phase aqueuse. Au cours de la dernière phase aqueuse, nous ajoutons 3×30 ml d’hexane pour récupérer la phase alcoolique. Cette dernière phase contenant les flavonoïdes est récupérée dans un ballon Préalablement pesé. Elle est ensuite soumise à une évaporation du butanol sous vide à 55°C pour l’obtention du résidu sec (Feknous et al., 2013).

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Chapitre 1 Revue Bibliographique
1. Généralité sur le plomb 
1.1. Les propriétés physico-chimiques du plomb et se disponibilité
1 .2. Les principales sources d’exposition au plomb
1.2.1. Sources professionnelles
1.2.2. Sources non professionnelles
1.3. Toxicocinétique du plomb
1.3.1. Absorption
1.3.1.1. Absorption cutané
1.3.1.2. Absorption pulmonaire
1.3.1.3. Absorption digestive
1.3.1.4. Les facteurs favorisant l’absorption du plomb
1.3.2. Distribution
1.3.2.1. Tissus mous
1.3.2.2. Tissus durs
1.3.3. Elimination
1.3.3.1. Urines
1.3.3.2. Autres voies
1.4. Toxicité cellulaire de plomb
1.4.1. Effet du plomb sur le système hématopoïétique
1.4.2. Effets du plomb sur le système rénal
1.4.3. Effets sur le système cardiovasculaire
1.4.4. Système nerveux
1.5. Neurotoxicité céllulaire au plomb
1.5 .1. Effets sur les concentrations en calcium intracellulaire
1.5.2. Effet sur les canaux calciques voltage-dépendants
1.5.3. Effet sur les récepteurs glutaminergiques
1.5.4. Le plomb et la neurotransmission sérotoninergique
1.5.5. Le plomb et la transmission dopaminergique
1.5.6. Autres systèmes de neurotransmission
1.6. Effet du plomb sur status redox
1.7. Composition et interet thérapeutique d’Artemisia absinthiumL
1.7.1. La plante ; Artemisia absinthium L
1.7.1.1.2. Description botanique de la plante
1.7.1.1.2.1. Caractéristiques morphologiques
1.7.1.1.2.2. Origine et distribution
1.7.1.1.3. Utilisation
1.7.1.1 .4. Principaux constituant d’Artemisia absinthium..L
1.7.1.1.4.1. Les composés phénoliques
1.7.1.1.4.2. Les terpènes
1.7.1.1.4.3. Les Huile essentielles
1.8. Etude In Silico des molécules en toxicologie
1.8.1. Importance des logiciels utilisés
1.8.2. Méthodes de calcules accessibles sur Gaussian
Chapitre2 Matériels et Méthodes
2. Préparation de l’extrait de plante et la répartition des animaux 
2.1. Préparation de l’extrait de plante
2.2. Etude phytochimique de la plante Artemisia Absinthium L. (A. ab)
2.2.1. Extraction des huiles essentielles de la plante
2.2.1.1. L’hydro distillation
2.2.2. Extraction liquide-liquide les substances bioactives de la plante
2.2.3. Analyse des composés phénoliques par HPLC/DAD
2.2.3.1. Mode opératoire
2.3. Répartition des animaux d’expériences
2.4. Etude comportementale des animaux
2.5. Prélèvement du cerveau et du sang
2.5.1. L’évolution du poids corporel et le poids relatif du cerveau
2.5.2. Extraction des lipides membranaires cérébraux
2.5.3. Préparation des homogénats cérébrales
2.6. Analyses biochimiques
2.6.1. Teneurs tissulaires en protéines totales, transaminases (TGO et TGP), LDH et PAL
2.6.2. Détermination des lipides tissulaire
2.6.3. Analyse des marqueurs de l’oxydation des lipides et des protéines (TBARS et dérivés
Carbonylé)
2.6.4. Analyse de l’activité des enzymes antioxydants tissulaires
2.6.4.1. Catalase (CAT, EC 1.11.1.6)
2.6.4.2. Superoxyde dismutase (SOD, EC 1.15.1.1)
2.6.4.3. Glutathion peroxydase (GSH-Px, EC 1.11.1.9)
2.6.4.4. Glutathion réductase (GRed, EC 1.6.4.2)
2.6.4.5. Les Thiols protéique totaux
2.6.5. Le dosage du plomb au niveau cérébral
2.6.6. Effet de l’acétate du plomb au niveau érythrocytes (Test d’hémolyse)
2.6.7. Evaluation des marqueurs de la fonction hépatique et rénale
2.6.7.1. Exploration de la fonction hépatique
2.6.7.1.1. Teneur sérique en protéines totales
2.6.7.1.2. Les transaminases
2.6.7.1.3. Phosphatase alcaline (PAL)
2.6.7.1.4. Gamma glutamyl transférase (γGT)
2.6.7.1.5. Dosage de l’albumine et la bilirubine
2.6.7.1.6. Le fer sérique
2.6.7.2. Exploration de la fonction rénale au niveau sérique
2.6.7. 2. 1. La créatinine
2.6.7. 2. 2. L’urée
2.6.7. 2. 3. Acide urique
2.6.8. Analyse des teneurs en lipides au niveau sérique
2.6.8.1. Teneur en cholestérol
2.6.8. 2.Teneur en Triglycérides
2.6.9. Analyse des teneurs de glucose et de calcium au niveau sérique
2.6.9.1. Dosage de la glycémie
2.6.9.2. Calcium sérique
2.7. Etude théorique de la molécule de la thuyone (In Silico)
2.7.1. Utilisation du logiciel
2.7.2. Méthodes de calcules accessibles sur Gaussian
2.7.2.1. La méthode de Hartree-Fock
2.7.3. Différentes bases gaussiennes
2.7.3.1. Méthode de la fonctionnelle de la densité
2.7.3.2. Théorie des orbitales moléculaires frontières FMO
2.7.3.3. Principales hypothèses de la théorie FMO
2. 8. Analyse statistique
Chapitre 3 Résultats et Discussion
3.1. Etude phytochimique de la plante Artemisia absinthium L. (A .ab)
3.1.1. Analyse qualitative par la chromatographie en phase liquide a haute performance (HPLC /DAD)
3.1.2. Profil chimique de l’huile essentielle d’A.absinthiumL
3.1.2.1. La composition chimique de l’huile essentielle d’A . absinthium L
3.2. Effet du plomb sur le comportement cognitif chez le rat
3.2.1. Comportement stéréotypé et l’activité locomotrice
3.2.2. Evaluation de degré de dépression
3.2.3. Evaluation de degré d’anxiété
3.2.4. Evaluation de degré de curiosité et d’apprentissage et de la mémorisation
3.3. Effet du Pb sur la croissance pondérale, le poids relatif et la prise hydrique
3.4. Analyse biochimiques
3.4.1. Teneur tissulaires en protéines totales, transaminases (GPT, GOT), LDH et PAL
3.4.2. Effet du plomb sur la teneur en lipides
3.4.3. Evaluation les marqueurs de l’oxydation des lipides et des protéines (dosage des TBARS et les dérivés Carbonylés)
3.4.4. Analyse de l’activité des enzymes antioxydants
3.4.5. Teneur cérébral au plomb
3.4.6. Effet de l’acétate du plomb sur les érythrocytes
3.4.6.1. L’Hémolyse
3.4.7 Evaluation des marqueurs du fonctionnement hépatique et rénal au niveau sérique
3.4.7.1. Au niveau hépatique
3.4.7. 2. Evaluation de la fonction rénale
3.4.8. Effet du plomb sur les constants hématologiques
3.5. Etude in silico de la thuyone
3.5.1. Etude géométrique de la structure des énantiomères (-) α, (+) α, (-) β et (+) β thuyone
3.5.1.1. Optimisation de la géometrie
3.5.2. Etude électroniques ( Energies minimales
3.5.3. Etude des orbitales moléculaires
3.5.4. Etude de la liaison structurale de thuyone avec le récepteur sérotonine 5HT
3.5.5. Etude énergétique de la liaison de (-) α et (-) β thuyone avec le récepteur sérotonine 5HT3
3.5.5.1. Les propriétés nodale
3.5.5.2. Le diagramme orbitalaire et l’écart énergétique des complexes (-) α thuyone 5HT3 et (-) β
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 
RÉFÉRENCE
ANNEXE

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