Soutenance mémoire
Nature et signification du repliement des protéines
Préambule
Pourquoi est-il important de comprendre et de prédire le processus de repliement des protéines ?
La connaissance des principes physico-chimiques dirigeant l’apparition de l’état natif selon un processus spontané d’auto-assemblage complétera notre compréhension des processus inscrits dans le dogme central de la biologie moléculaire et cellulaire qui décrit le passage de l’ADN vers la protéine et sa fonction, en passant par la transcription de l’ADN et la traduction de l’ARN. Caractériser les forces qui stabilisent une protéine au cours de son repliement permettra de mieux décrire et comprendre ces processus fondamentaux. D’autre part, mieux comprendre les mécanismes du repliement d’une protéine permettrait de prédire la structure 3D à partir de la seule séquence en acides aminés. Cela réduirait grandement le processus souvent laborieux de détermination de la structure à partir de cristaux ou par RMN. La résolution du « problème du repliement » ouvrirait également la porte à de nombreuses applications biotechnologiques et biomédicales: conception ab-initio de « protéines médicaments », bio-senseurs, compréhension et découverte de solutions pour les maladies associées à un mauvais repliement en améliorant et réparant des protéines non fonctionnelles (la mucovisidose ((Hagmann 1999)), la maladie des os de verre (Baum and Brodsky 1999), divers cancers ((Bullock, Henckel et al. 1997)), les amyloïdoses (maladie d’Alzheimer, maladie de Creutzfeld-Jakob, diabète de type II, maladie de Parkinson…((Baum and Brodsky 1999)) (voir également ((Dobson 2004)). Le code décrivant l’information génétique étant maintenant connu, un autre grand pas dans la compréhension du monde vivant serait le décryptage du code du repliement, codé dans la séquence en acides aminés.
Le problème du repliement des protéines
Un polypeptide néo-synthétisé doit être capable de trouver rapidement le chemin vers sa structure tridimensionelle finale parmi de nombreuses voies alternatives. Découvrir comment cela s’effectue est un grand challenge de la biologie structurale moderne.
Quelle problématique ?
Les protéines sont impliquées virtuellement dans tous les processus biologiques des systèmes vivants et ont la nécessité d’être repliées « vite et bien ». Elles sont synthétisées par les ribosomes sous la forme de chaînes linéaires comportant typiquement des centaines d’acides aminés placés dans un ordre qui est défini par la séquence codante de l’ADN génomique. Le séquençage du génome humain à permis d’évaluer un catalogue des gènes humains codent pour environ 40 000 séquences de protéines différentes (Science, Vol 291 2001, J. Craig Venter). Pour devenir fonctionnelles, chacune de ces protéines doit se replier dans une structure tridimensionnelle unique et spécifique qui détermine sa fonction dans l’organisme. Chacune d’elles acquiert une structure qui peut être classée parmi environ un millier de familles de structure différentes ((Chothia 1992), (Holm and Sander 1996)). En plus d’être spécifique, un tel processus doit également être rapide, c’est-à-dire conforme aux nécessités de l’organisme en terme de vitesse de synthèse et de biodisponibilité. Aussi, chez Escherichia coli (E.coli) la vitesse de synthèse in vivo peut être aussi rapide que 20 résidus par seconde et les cellules bactériennes peuvent se diviser en moins de 30 minutes. La problématique du repliement des protéines est donc de déterminer quels sont les facteurs permettant à une protéine de se replier « vite et bien ».
Et in vivo ?
Les chaperonnes et d’autres molécules (isomérases, …) sont associées aux évènements de repliement intracellulaire mais sont aussi associées aux processus de localisation et de contrôle de fonctionnalité permettant à une protéine donnée de fonctionner correctement au bon moment et au bon endroit ((Pelham 1999)).
A l’échelle de la cellule, le repliement d’une protéine prend place dans un environnement complexe, largement encombré par de nombreuses molécules. Dans le cytoplasme des bactéries, par exemple, la concentration macromoléculaire avoisine les 350 mg/mL (Ellis 1997). Pour comparaison, c’est l’ordre de grandeur de la concentration en protéine dans un cristal préparé pour la résolution de sa structure par diffraction des rayons X. Pour permettre au repliement de s’effectuer dans de telles conditions cellulaires, un grand nombre de protéines ont pour fonction d’accompagner le repliement d’autres protéines ((Goodsell 1991)). Ces protéines d’accompagnement ont pour fonction d’éviter l’agrégation de la protéine en cours de son repliement ou encore d’accélérer certaines étapes de ce processus qui serait plus lent dans le milieu cellulaire. On peut citer parmi ces protéines « catalyseurs » du repliement, les isomérases de prolines qui catalysent l’isomérisation cis/trans des prolines ou les isomérases de ponts disulfures qui accélérent la formation et le réarrangement des ponts disulfures.
Un principe d’autoassemblage à partir de la seule séquence en acides aminés
L’information fondamentale de la structure d’une protéine est comprise dans la séquence en acides aminés de cette protéine : c’est « le principe d’auto assemblage spontané » du repliement des protéines.
Malgré le nombre de molécules connues pour être impliquées dans le processus de repliement in vivo, beaucoup de protéines dénaturées en laboratoire se replient spontanément, dans leur forme native, lorsque les conditions dénaturantes sont éliminées et cela sans l’addition d’aucune autre espèce moléculaire additionnelle ((Anfinsen 1973)). La molécule de ribonucléase A, formée de 124 résidus d’acides aminés, se prête facilement à une étude structurale. Anfinsen et ses collaborateurs ont montré l’importance de la séquence en acides aminés dans la détermination de la conformation native de la ribonucléase. Ainsi le traitement de la ribonucléase native avec de l’urée en présence de β-mercaptoéthanol, provoque un dépliement complet de la molécule. Dans ce processus de dénaturation, les quatre ponts disulfures formés par les 8 cystéines de la ribonucléase A sont réduits. Ce dépliement et le clivage des liaisons S-S provoquent une perte complète de l’activité enzymatique. En revanche, quand l’urée et l’agent réducteur sont lentement éliminés de la solution, l’activité de la ribonucléase réapparaît progressivement, ce qui indique que, même après dénaturation, la chaîne polypeptidique de la ribonucléase contient encore l’information nécessaire pour revenir à la structure tertiaire catalytiquement active.
Ainsi, dès 1962, la preuve était faite que la séquence des résidus, déterminée par le code génétique détermine à son tour la structure des protéines. Les huit cystéines (S-H) se réoxydent grâce à l’oxygène atmosphérique et rétablissent ainsi les quatre ponts disulfures initiaux. Bien qu’un calcul de probabilités montre que les huit cystéines d’une seule chaîne polypeptidique peuvent former 105 combinaisons différentes, seule la combinaison présente dans la molécule de ribonucléase A native est formée. Ces expériences de renaturation ont par la suite été étendues à d’autres protéines, et il est maintenant généralement accepté que la séquence en acides aminés détermine la structure tertiaire spécifique des protéines. Dans un certain nombre de cas, il existe une compétition, comme cela peut être le cas dans la cellule, entre l’agrégation intermoléculaire est le repliement intramoléculaire. Toutefois, les expériences d’Anfinsen démontrent que la structure finale et le mécanisme de repliement des protéines sont dictés par la seule séquence en acides aminés. Les chaperonnes, qui sont nécessaires pour le bon repliement de certaines protéines, ont un rôle facilitateur mais ne dirigent pas la réaction de repliement.
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Table des matières
CHAPITRE 1. INTRODUCTION GENERALE
1.1 NATURE ET SIGNIFICATION DU REPLIEMENT DES PROTEINES
1.1.0 PREAMBULE
1.1.1 LE PROBLEME DU REPLIEMENT DES PROTEINES
QUELLE PROBLEMATIQUE ?
ET IN VIVO ?
UN PRINCIPE D’AUTOASSEMBLAGE A PARTIR DE LA SEULE SEQUENCE EN ACIDES AMINES
LEVINTHAL ET SON PARADOXE
1.1.2 COMMENT MODELISER LE PROBLEME ET TENTER DE LE RESOUDRE?
DES MODELES POUR RESOUDRE LE PARADOXE DE LEVINTHAL
LES VUES CLASSIQUE ET MODERNE
1.1.3 LES PROPRIETES DE LA CHAINE POLYPEPTIDIQUE AU COUR DE LA REACTION DE
REPLIEMENT
1.1.3.0 PREAMBULE
1.1.3.1 PROPRIETES DE L’ETAT DEPLIE « PELOTE STATISTIQUE »
1.1.3.2 PROPRIETES DE L’ETAT PARTIELLEMENT DEPLIE
1.1.3.3 PROPRIETES DE L’ETAT NATIF
1.1.3.4 L’ETAT DE TRANSITION
1.1.4 LE MOLTEN GLOBULE SUR LE CHEMIN DU REPLIEMENT
1.1.4.1 L’ETAT MOLTEN GLOBULE
1.1.4.2 « MOLTEN GLOBULE » A L’EQUILIBRE
1.1.4.3 OBSERVATION DE L’ETAT MG A L’EQUILIBRE
1.1.4.4 L’ETAT « MOLTEN GLOBULE » COMME INTERMEDIAIRE CINETIQUE
1.1.4.5 STRUCTURE DE L’ETAT « MOLTEN GLOBULE » CINETIQUE ET A L’EQUILIBRE DE PROTEINES GLOBULAIRES
1.1.4.6 ROLE DE L’ETAT « MOLTEN GLOBULE » DANS LE REPLIEMENT DES PROTEINES
1.1.4.7 LE REPLIEMENT, UN PROCESSUS EN DEUX ETAPES
1.1.4.8 ROLES BIOLOGIQUES DES ETATS INTERMEDIAIRES
CHAPERONNE
AMYLOÏDOGENESE
ETATS NON NATIFS PROCHES DE MEMBRANES BIOLOGIQUES
1.1.5 EVENEMENTS INITIAUX DU REPLIEMENT DES PROTEINES
1.1.5.1 INTRODUCTION
1.1.5.2 OBTENTION DES ETATS DENATURES
1.1.5.3 TECHNIQUES BIOPHYSIQUES UTILISEES POUR ETUDIER LE REPLIEMENT DES PROTEINES
1.1.5.4 LES METHODES DE MELANGE RAPIDE
METHODES DE CONTINUOUS FLOW
METHODES DE STOPPED-FLOW
METHODES DE QUENCHED FLOW
1.1.5.5 SIGNIFICATION DES EVENEMENTS PRECOCES DE REPLIEMENT
LA « BURST PHASE »
EVENEMENTS PRECOCES
LIMITES
1.1.6 STRATEGIES DE STABILISATION DES PROTEINES : OSMOLYTES, ENCOMBREMENT MOLECULAIRE
1.1.6.1 L’EFFET OSMOPHOBIQUE : UNE FORCE THERMODYNAMIQUE POUR LE REPLIEMENT DES PROTEINES (BOLEN AND BASKAKOV 2001), (BOLEN 2004)
1.1.6.2 STRATEGIES « ENTROPIQUES » POUR LA STABILISATION DES PROTEINES
1.1.6.3 UNE STRATEGIE ENTROPIQUE : L’ENCOMBREMENT MOLECULAIRE
1.2 LE PROCESSUS DE REPLIEMENT DE L’APOMYOGLOBINE
1.2.1 INTRODUCTION
1.2.2 LA FORME NATIVE DE L’APOMB
1.2.3 LA FORME DEPLIEE DE L’APOMB
1.2.4 LE PROCESSUS DE REPLIEMENT DE L’APOMB
FORMATION DE I DANS DES CONDITIONS NATIVES
L’INTERMEDIAIRE A PH 4 COMME MODELE DE I
LES INTERMEDIAIRES IA ET IB
INTERMEDIAIRES SUR OU EN DEHORS DU CHEMIN ?
FORMATION DE N
1.2.5 LE PROCESSUS DE DEPLIEMENT DE L’APOMB
CHAPITRE 2. RESULTATS & DISCUSSION
2.1. DEVELOPPEMENT METHODOLOGIQUE D’APPAREIL DE MELANGE ULTRA RAPIDE
2.1.1 PREAMBULE
2.1.2 RESULTATS PRELIMINAIRES DE FREEZE QUENCHING
2.1.2.1MATERIEL ET METHODES
MATERIEL BIOLOGIQUE
CONGELATION ET SPECTROSCOPIE RPE
SPECTROSCOPIE D’ABSORBANCE ET STOPPED-FLOW
ANALYSE DES RESULTATS
2.1.2.2 LA REACTION DE LIAISON DE L’AZIDE SUR LA MYOGLOBINE COMME REACTION MODELES
POUR TESTER LE TEMPS MORT
INTRODUCTION
RESULTAT ET DISCUSSION
CHOIX DES CONDITIONS POUR LA REACTION TEMOIN DE FIXATION DE L’AZIDE A LA MYOGLOBINE
STRATEGIES POUR OPTIMISER LA RESOLUTION EN TEMPS DU PROCESSUS DE FREEZE QUENCHING
RESULTATS DE « FREEZE QUENCHING » DE LA REACTION DE LA METMYOGLOBINE AVEC L’AZIDE
PARAMETRES A MAITRISER POUR OPTIMISER L’APPAREIL DE FREEZE QUENCHING
2.1.2.3 CYTO C, UN MODELE POUR SUIVRE LE REPLIEMENT D’UNE PROTEINE : MISE AU POINT INITIALE (PAR FREEZE-QUENCH & RPE)
DESCRIPTION DU MODELE
RESULTATS PRELIMINAIRES
2.1.3 RESULTATS DE STOPPED-FLOW ULTRA-RAPIDE
MISE AU POINT ET CARACTERISATION DU TEMPS MORT
MATERIEL ET METHODES
RESULTATS ET DISCUSSION
1- DETERMINATION DES CONDITIONS LIMITES D’UTILISATION DE LA MICROCUVE
2-DETERMINATION DU TEMPS MORT DU NOUVEAU MELANGEUR CONÇU AVEC DES VOLUMES REDUITS
3 -MISE AU POINT DES MESURES CINETIQUES PAR DICHROÏSME CIRCULAIRE ET TESTS
2.2 UTILISATION D’APPAREIL DE MELANGE ULTRA RAPIDE
POUR L’ETUDE DES CINETIQUES DE REPLIEMENT DE
L’INTERMEDIAIRE DE L’APOMB
CINETIQUES SUBMILLISECONDES COOPERATIVES DE L’INTERMEDIAIRE A PH 4 DE L’APOMYOGLOBINE
2.2.1RÉSUMÉ
2.2.2 INTRODUCTION
2.2.3 MATERIALS AND METHODS
PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION
CIRCULAR DICHROISM SPECTROSCOPY
STOPPED-FLOW MEASUREMENTS
FIT TO A TWO-STATE MODEL
MODELING THE PH DEPENDENCE OF THE RATE CONSTANTS
2.2.4 RESULTS
A SUBMILLISECOND STOPPED-FLOW APPARATUS
FOLDING AND UNFOLDING KINETICS OF IA AT PH 4.2
FOLDING AND UNFOLDING KINETICS OF IA AT PH 4.2
PROTEIN CONCENTRATION DEPENDENCE OF THE FOLDING KINETICS OF IA
TEMPERATURE DEPENDENCE OF THE FOLDING KINETICS OF IA
FOLDING OF N UNDER NATIVE CONDITIONS
2.2.4 DISCUSSION
FOLDING PATHWAY OF APOMB
COOPERATIVITY IN APOMB FOLDING PROCESS
WHY IS THE FORMATION OF IA SO SLOW AT PH 4 ?
2.2.6 REFERENCES
2.3 OSMOLYTES ET ENCOMBRANTS MOLECULAIRES. EFFETS
SUR LES EQUILIBRES ET LES CINETIQUES DE REPLIEMENT DE L’APOMYOGLOBIN ET DU CYTOCHROME C
MATERIEL ET METHODES
2.3.1 INFLUENCE D’OSMOLYTE SUR L’APOMYOGLOBINE DE CHEVAL ET DE CACHALOT
INTRODUCTION
RESULTATS
DISCUSSION
2.3.2 EFFET DE L’ENCOMBREMENT MOLECULAIRE SUR LE REPLIEMENT DU CYT C
INTRODUCTION
RESULTAT
DISCUSSION
2.3.3 CONCLUSION : CROWDING AND OSMOLYTES
DU CODE GENETIQUE AU CODE « PROTEIQUE » : AUX LIMITES DE L’EVOLUTION MOLECULAIRE
ET IN VIVO?
DETERMINISME DU REPLIEMENT, OU IL EST QUESTION DE L’UTILITE DE SE DEPLIER
UN DEFI : DECRYPTER LE CODE DE REPLIEMENT ET COMPRENDRE SON EVOLUTION
CHAPITRE 3. CONCLUSIONS ET PERPECTIVES
CHAPITRE 4. BIBLIOGRAPHIE
