Soutenance mémoire
La thérapie Photodynamique
Historique Au cours du siècle dernier la thérapie photodynamique (PDT) a été introduite comme modalité de traitement des petites tumeurs accessibles à la lumière (FIG. 1.1). La PDT est basée sur l’administration d’une molécule, appelée photosensibilisateur (PS), ayant une localisation tumorale préférentielle qui augmente la sensibilité des tissus lors d’une irradiation lumineuse dans le visible. A la suite de cette irradiation, le photosensibilisateur (PS) va produire des espèces réactives de l’oxygène (ERO) capables d’endommager les substrats biologiques et d’induire la mort cellulaire [1].Connue depuis de nombreuses années, la PDT s’est développée à partir des années 1960 à la suite de la découverte de l’hématoporphyrine dérivée (HpD) [2]. Ce dérivé servit de fluorophore pour la détection tumorale [3], tout en étant administré à des concentrations bien plus faibles que l’hématoporphyrine (Hp). L’HpD est alors apparu comme un outil prometteur pour le diagnostic. Les applications cliniques de la PDT ont débuté dans les années 1970, principalement grâce aux efforts considérables du Pr. Thomas Dougherty et de ses collaborateurs de l’Institut du Cancer Roswell Park (Université de Buffalo, USA). Leurs études ont montré l’efficacité à long terme d’un traitement PDT à base d’HpD sur des modèles animaux ainsi que sur l’homme [4]. Par la suite, l’isolation par chromatographie d’exclusion de l’HpD a conduit au développement du photosensibilisateur : le Photofrin. Le Photofrin a été approuvé pour la première fois au Canada en 1993 pour le traitement du papillome de la vessie. Par la suite son utilisation s’est diffusée aux Etats-Unis, en Europe et au Japon pour le traitement des tumeurs des voies aérodigestives supérieures [5]. Le nombre croissant d’études portant sur la PDT a conduit à une meilleure compréhension des différents facteurs qui régissent cette thérapie. Les applications actuelles de la PDT s’étendent du traitement des lésions cancéreuses ou précancéreuses à des activités antimicrobiennes, en passant par le traitement de la dégénérescence maculaire [6]. Les recherches actuelles se concentrent sur le développement et la vectorisation de nouveaux photosensibilisateurs, sur la mise au point de sources lumineuses et sur l’optimisation des protocoles de traitement, afin d’améliorer l’efficacité de la PDT. En particulier, les propriétés photophysiques, le mode d’administration, les systèmes de délivrance des PSs ainsi que l’administration, les caractéristiques de la source lumineuse et l’intervalle drogue – lumière, doivent être optimisés en fonction des caractéristiques morphologiques spécifiques des tumeurs.
Les réactions photochimiques
L’absorption de photons par le PS est l’étape préliminaire à toute photoréaction. Comme l’illustre le diagramme de Jablonski (FIG. 1.2), l’énergie quantique absorbée permet le passage du PS de son état électronique fondamental à un état excité. A température ambiante, la majorité des PSs sont dans un état fondamental, qui est l’état électronique de plus faible niveau d’énergie associé à une configuration où tous les électrons sont disposés en orbitale appariée. Durant la transition électronique, l’un des électrons est transféré à partir d’une orbitale initiale occupée vers l’orbitale suivante nonoccupée de plus forte énergie. Par conséquent, l’état excité S1 présente une distribution électronique différente de celle de l’état fondamental S0 et est énergiquement moins stable que S0. La désexcitation de cet état doit alors prendre place pour permettre le relargage du surplus d’énergie accumulé. Diverses voies physiques conduisant à la dissipation d’énergie existent. Elles sont toutes associées à une probabilité d’occurrence, et sont représentées sur le diagramme de Jablonski présenté en FIG. 1.2.
VR : relaxation vibrationnelle, IC : conversion interne et ISC : conversion inter-système Une molécule avec un fort niveau vibrationnel d’un état excité Sn (n étant dépendant du PS et de la longueur d’onde utilisée) peut rapidement retourner à un niveau vibrationnel inférieur de cet état, par un processus nommé relaxation vibrationnelle. De plus, une molécule dans un état excité élevé Sn peut finalement retourner à un premier état excité S1 par conversion interne. Pendant cette conversion interne, l’excès d’énergie de l’état singulet est libéré sous forme de chaleur qui se dissipera dans le milieu environnant. Par la suite, l’état singulet (S1) peut rapidement retourner à son état fondamental S0 par deux mécanismes : un processus radiatif (fluorescence) ou un processus non-radiatif (conversion interne). Du fait que l’énergie du photon émis, lors du processus radiatif, est égale à l’écart d’énergie entre l’état S0 et S1, cela implique que la fluorescence émise ne dépend pas de la longueur d’onde d’excitation. La détection par fluorescence utilisée dans des applications de diagnostic s’appuie sur les propriétés d’émission de fluorescence du PS. Le rendement quantique de fluorescence d’un PS peut être calculé, mettant ainsi en évidence sa capacité à émettre de la fluorescence en fonction des photons absorbés lors de l’irradiation. En effet, il est défini par le rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons absorbés par la molécule (Equation 1).
Destruction directe des cellules tumorales
La PDT peut induire la mort cellulaire principalement selon trois voies principales : l’apoptose, la nécrose et l’autophagie [9]. Le type de mort cellulaire photoinduite est étroitement lié à la localisation subcellulaire du PS en raison de l’action localisée de l’oxygène singulet (§1.2.2.2). L’apoptose est la voie de mort cellulaire prédominante lors d’un traitement PDT. Elle se caractérise morphologiquement par des bourgeonnements de la membrane plasmique, une fragmentation de l’ADN internucléosomal, une condensation de lachromatine et la formation de corps apoptotiques (formation de vésicules). Trois voies d’induction de l’apoptose par la PDT ont été décrites [15]. Les deux premières voies, la voie intrinsèque faisant intervenir des récepteurs membranaires de la superfamille des TNFR (Tumor Necrosis Factor Receptor) et la voie indépendante des caspases, ont un impact mineur par rapport à la voie intrinsèque où intervient la mitochondrie. En effet, étant donné l’importance du stress oxydant produit au niveau des organites cellulaires, la voie intrinsèque de l’apoptose (caspase-dépendante) est majoritaire en PDT. La voie intrinsèque de l’apoptose se caractérise principalement par la libération rapide du cytochrome c mitochondrial vers le cytosol [16], [17] qui conduira à l’activation de la cascade des caspases, principalement des caspases effectrices 3, 6 et 7 qui sont les éléments centraux dans le processus de mort cellulaire programmée [17], [18]. Cette réponse apoptotique intrinsèque induite lors d’un traitement photodynamique s’explique, en outre, par le fait que de nombreux PS ont une localisation mitochondriale préférentielle [19], [20]. De plus, certains PSs se localisant dans d’autres organites tels que les lysosomes, le réticulum endoplasmique ou l’appareil de Golgi [21]–[23] peuvent induire une apoptose cellulaire par l’intermédiaire de signaux qui convergeront vers la mitochondrie. Celle-ci joue donc un rôle central dans le processus apoptotique. Cependant, il faut noter qu’une localisation du PS au sein des lysosomes ou des membranes plasmiques conduira généralement à une mort cellulaire de type nécrose [13]. La nécrose est traditionnellement considérée comme une forme de mort cellulaire passive et non régulée. Les réactions de photo-oxydation vont engendrer une perte de l’intégrité membranaire et de l’homéostasie ionique de la cellule, qui vont se caractériser par un gonflement et une vacuolisation du cytoplasme. La rupture de la membrane cytoplasmique qui s’en suit, conduit à la libération dans le milieu extérieur du contenu cytoplasmique qui déclenchera généralement une réaction inflammatoire. Classiquement, la nécrose est le résultat d’un accident traumatique à la suite de certaines pathologies ou de déficits métaboliques. Elle se caractérise essentiellement par l’absence d’activation de la voie des caspases, de libération du cytochrome c et de fragmentation de l’ADN [9]. L’autophagie se caractérise par une vacuolisation massive du cytoplasme, qui nécessite la formation de structures vacuolaires délimitées par une double membrane appelées autophagosome. La fusion de ces autophagosomes avec les lysosomes entrainent la dégradation du contenu cytoplasmique. L’autophagie peut avoir un effet cytoprotecteur ou promoteur de la mort cellulaire [24]. En PDT, il a été démontré que l’autophagie est un mécanisme de préservation de la viabilité cellulaire à la suite de dommage photoinduit [25]. Une localisation lysosomale des PSs peut compromettre le procédé d’autophagie et favoriser la phototoxicité sur des cellules sensibles à l’apoptose [25]. Pour conclure, il est important de noter que le noyau n’est pas un organite cible des PSs, ce qui dans un contexte clinique, se révèle d’une importance capitale pour éviter la formation de dommages au niveau de l’ADN potentiellement carcinogène. La PDT se révele être par conséquent un traitement faiblement mutagène.
Activation du système immunitaire
De nombreuses études précliniques sur divers modèles animaux suggèrent que en plus de son effet cellulaire direct et de son effet vasculaire, la PDT a des effets proinflammatoires capables d’induire une réponse immunitaire anti-tumorale [27]–[29]. Des résultats suggèrent que l’occlusion des vaisseaux, l’ischémie et la destruction directe des cellules tumorales induits à la suite d’un traitement PDT, génèrent une importante réaction inflammatoire locale [28], [30]. Cette forte réaction inflammatoire caractérisée par un œdème au niveau des tissus cibles, résultant d’un fort stress oxydant, est souvent observée à la suite d’un traitement PDT [1]. La PDT est reconnu par l’hôte comme un trauma, et la réponse immunitaire est le principal processus de protection des tissus mis en place dans ce contexte. Les dommages induits par la PDT, engendrent la libération de nombreux signaux d’alarmes (médiateurs de l’inflammation) qui seront détectés par l’immunité innée [31]. Parmi ces signaux, on retrouve lors de la dégradation photo-oxydative des membranes lipidiques, la libération des métabolites de l’acide arachidonique (constituant des membranes cellulaires), médiateurs importants de l’inflammation [32]. Cette libération combinée à la production d’histamine et de sérotonine par les vaisseaux endommagés, provoque l’infiltration de la tumeur par diverses populations de cellules immunitaires (neutrophile, mastocytes et macrophages) dans le but d’éliminer les débris cellulaires [28]. Les cellules immunitaires activées vont également produire une grande diversité de médiateurs de l’inflammation qui permettront le recrutement massif des cellules immunitaires[28], [30]. Les antigènes tumoraux libérés à la suite des dommages cellulaires induits par la PDT pouront être phagocytés par les cellules présentatrices d’antigènes, telles que les macrophages ou les cellules dendritiques, et seront ensuite présentés aux autres cellules immunitaires afin de mettre en place une immunité adaptative [9], [30]. Il apparait que l’effet de la PDT sur le système immunitaire dépend à la fois de la zone traitée, de la nature du PS utilisé [33] et de l’induction de la réponse immunitaire anti-tumorale. Ainsi malgré une efficacité PDT similaire à court terme, la réponse tumorale à long terme est diminuée ou même absente sur un modèle de souris immunodéficientes [32], [34]. La réponse immunitaire est requise pour éradiquer les cellules tumorales survivantes [34].
Les générations de photosensibilisateur
Afin de respecter les critères du PS idéal présentées précédemment, de nouveaux PS dits de deuxième génération ont été élaborés. Ce sont des molécules synthétiques et parfaitement définies. La plupart absorbent dans les longueurs d’onde rouges du spectre et possèdent un rendement quantique en oxygène singulet élevé. Ces PS possèdent des structures chimiques variées incluant notamment la Chlorine e6, PS utilisé dans notre étude. Néanmoins de nombreux PS de deuxième génération souffrent de leur hydrophobicité, qui rend dans un premier temps leur administration difficile. Par la suite, ces PSs ont tendance à s’agréger dans la circulation sanguine, ce qui diminue leur efficacité PDT in vivo et conduit à une pauvre sélectivité tumorale. Ces limitations ont conduit à l’élaboration de PS de troisième génération. Les PSs de 3 ème génération sont des PSs de 2ème génération modifiés pour favoriser leur accumulation préférentielle dans les tissus tumoraux. Ces modifications apportées sont une addition de divers groupements chimiques (acides aminés, sucres, protéines, polymère, hydrates de carbone), un couplage à des anticorps spécifiques ou une inclusion (covalent ou non) dans des vecteurs de taille nanométrique, appelés nanoparticules (liposome, micelle, dendrimère,…) [36].
Biodistribution des photosensibilisateurs
A la suite de son injection intraveineuse le devenir du PS dépend de ses caractéristiques intrinsèques. Dans un premier temps, le PS va être distribué entre les différents constituants du sang. Cela implique la désagrégation ou la dissociation du PS à partir du système de vectorisation, sa fixation aux protéines plasmatiques et son association aux cellules sanguines. Ensuite, le PS va se lier aux parois vasculaires. Cette étape est gouvernée par les caractéristiques des vaisseaux sanguins qui sont différentes selon les organes. Le PS peut alors s’extravaser et diffuser au sein du milieu extracellulaire du tissu ou de l’organe considéré. A ce moment le PS peut être incorporé par les cellules tumorales. Cette interaction PS-cellule et la localisation subcellulaire du PS qui s’ensuit sont gouvernées par différents facteurs, incluant la balance hydrophobicité / hydrophilicité, la charge et l’asymétrie de la structure. Les PSs relativement hydrophiles, présentant des sites chargés ou polaires, sont trop polaires pour diffuser dans les membranes biologiques et sont internalisés par endocytose. Par contraste, les composés hydrophobes comportant peu ou pas de groupements polaires, peuvent diffuser à travers les membranes et vont se distribuer librement dans les membranes des différents organites [22]. Finalement, le PS sera éliminé via le drainage lymphatique et/ou par les organes de rétention et de clairance. Les études de pharmacocinétique recensées rapportent une variabilité temporelle de ces évènements dépendante du type de PS utilisé. Additionné à cela, il semble que la structure du PS influence sa rétention tumorale et les voies d’élimination mises en jeu [37]. L’accumulation tissulaire des PSs dépend des propriétés de prolifération des tissus. Au sein des tissus en prolifération, la catalyse du cholestérol est augmentée, et conduit à la surexpression des récepteurs aux lipoprotéines de faible densité (« Low density lipoprotein » LDL). Par conséquent, les PSs qui dans la circulation sanguine sont liés aux LDL peuvent s’accumuler de manière spécifique dans les tissus tumoraux, tissus en prolifération [38]. Le second paramètre tissulaire qui favorise l’accumulation tumorale des PSs est la diminution du pH dans le microenvironnement tumoral [39]. Ce pH légèrement acide, peut modifier les propriétés physico-chimiques des PSs et ainsi faciliter leur incorporation cellulaire [40]. En effet, le lien existant entre l’accumulation tumorale des PSs et leur structure, tout particulièrement leur caractère lipophile et la distribution des groupements polaires et hydrophobes autour du macrocycle, a précédemment été établi [41]. Dans le plasma, la répartition des PSs entre l’albumine et les LDL est dépendante du pH et joue un rôle dans la sélectivité et la rétention tumorale des PSs [22]. Il a d’ailleurs été suggéré qu’un environnement tumoral acide favoriserait la formation de complexe PS-LDL, propice à la sélectivité et à l’accumulation tumorale du PS.
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Table des matières
Table des figures
Liste des tableaux
Liste des acronymes
Introduction
1 Contexte de l’étude et problématique scientifique
1.1 La thérapie Photodynamique
1.1.1. Historique
1.1.2. Principes de la thérapie photodynamique
1.1.2.1. Les réactions photochimiques
1.1.2.2. Mécanismes d’éradication tumorale médiés par la thérapie photodynamique
1.1.3. Les photosensibilisateurs
1.1.3.1. Les générations de photosensibilisateur
1.1.3.2. Les photosensibilisateurs approuvés en clinique
1.1.3.3. Biodistribution des photosensibilisateurs
1.1.4. La Chlorine e6
1.1.4.1. Généralités
1.1.4.2. Propriétés physicochimiques et leurs impacts sur le comportement en milieu biologique de la Chlorine e6
1.2 L’oxygène moléculaire singulet
1.2.1. Généralités
1.2.2. L’oxygène moléculaire singulet
1.2.2.1. Structure électronique
1.2.2.2. Stabilité et relaxation
1.2.3. Génération de l’oxygène singulet
1.2.4. Détection de l’oxygène singulet
1.2.4.1. Détection indirecte
1.2.4.2. Détection directe
1.3 La vectorisation
1.3.1. Généralités
1.3.2. Rationnel du développement de nanoparticules en cancérologie
1.3.3. Objectifs de la vectorisation
1.3.4. Voies de ciblage tumorales
1.3.4.1. Le ciblage passif
1.3.4.2. Le ciblage actif
1.3.5. Incorporation cellulaire des nanoparticules
1.3.5.1. Les différentes voies d’endocytose
1.3.5.2. Les méthodes d’études des voies d’internalisation des NPs
1.3.6. Vectorisation de la Chlorine e6 en PDT
1.3.6.1. Généralités
1.3.6.2. Nanoparticules reposant sur le ciblage passif ou actif
1.3.6.3. Nanoparticules multimodales
1.3.6.4. Conclusion
1.4 Les dendrimères
1.4.1. Historique
1.4.2. Architecture et composition
1.4.3. Méthodes de synthèse des dendrimères
1.4.3.1. La méthode divergente
1.4.3.2. La méthode convergente
1.4.4. Dendrimères : un excellent candidat pour des applications en biologie
1.4.4.1. Propriétés biologiques des dendrimères in vitro : la cytotoxicité
1.4.4.2. Evaluation des propriétés in vivo
1.4.5. Les dendrimères comme vecteur anticancéreux
1.4.5.1. Ciblage passif
1.4.5.2. Ciblage actif
1.4.6. Les dendrimères en PDT : Etat de l’art
1.4.6.1. L’encapsulation du photosensibilisateur
1.4.6.2. Le greffage covalent du photosensibilisateur
2 Objectifs du travail
3 Optimisation de la composition des nanoparticules photoactivables à base de dendrimère
3.1 Introduction
3.2 Matériels et méthodes
3.2.1.1. Synthèse des nanoparticules
3.2.2. Caractérisation
3.2.3. Etudes in vitro
3.3 Résultats et discussion
3.4 Conclusion
4 Caractérisation photobiologique des nanoparticules G4.5-Ce6+/-PEG
4.1. Potentialisation de l’efficacité photodynamique de la Chlorine e6 via sa conjugaison aux dendrimères PAMAM
4.1.1. Résumé
4.1.2. Publication
4.2 Etude du tumorotropisme des G4.5-Ce6+/-PEG par imagerie de fluorescence
4.2.1. Introduction
4.2.2. Matériels et méthodes
4.2.2.1. Matériels
4.2.2.2. Spectres de fluorescence
4.2.2.3. Etude du tumorotropisme des nanoparticules
4.2.3. Résultats et Discussion
4.3 Conclusion
5 Nanoparticules clivables à base de dendrimère PAMAM et de Chlorine e6
5.1 Introduction
5.2 Matériels et méthodes
5.2.1. Synthèse des nanoparticules clivables
5.2.2. Caractérisation
5.2.3. Clivage de la Chlorine e6 par augmentation du pH
5.2.4. Etude du tumorotropisme des nanoparticules
5.3 Résultats et discussion
5.4 Conclusion
Discussion générale
Conclusions et perspectives
Production scientifique
Bibliographie
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