Mycotoxines en alimentation humaine et animale

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LES HABITUDES ALIMENTAIRES DES TOGOLAIS

Le maïs est l’une des céréales alimentaires de base des Togolais. Il se cultive dans toutes les régions du Togo sur environs 48% des surfaces cultivées. L’utilisation du maïs dans l’alimentation humaine se fait en transformant les grains frais comme secs de manière tradi-tionnelle. Après séchage dans les champs, les grains sont enlevés séchés puis sont prêts pour d’autres transformations donnant comme produits finis (Annexe 2) (Icard-Vernière et al., 2010) :
• la pâte fermentée obtenue à partir du tamisage humide sur toile fine du maïs fermentée moulu (« Akpan ») ;
• la bouillie fermentée comportant des grumeaux obtenue à partir d’ »Akpan » (« Akassan ») ;
• la pâte fermentée de maïs cuite à la vapeur (« Khom ») ;
• la farine fermentée de maïs dépelliculé (« Ema ») ;
• la bouillie fermentée comportant des granules obtenue à partir d’ »Ema » (« Aklui ») ;
• une bière sans alcool à base de maïs (« Liha »).
Le sorgho est la deuxième céréale la plus cultivée après le maïs. Elle est consommée sous la même forme que le maïs. Plus de 70% des récoltes entrent dans la préparation des bières locales traditionnelles, tchakpalo et tchoukoutchou (Balogou et al., 2011 ; Dossou et al., 2011).
Le Manioc (Manihot esculenta Crantz) est couramment consommé. Il est très péris-sable, donc nécessaire de le transformer le plus rapidement possible pour limiter les pertes. On obtient alors la cosette de manioc qui est sa forme séchée et la farine fermentée (« Agbeli-ma ») (Kouakou et al., 2015).

MYCOTOXINES

Le terme mycotoxine vient du grec «mycos» et du latin «toxicum» qui signifient res-pectivement champignon et poison (Yiannikouris et al., 2002). Il a été inventé en 1962, suite à une crise vétérinaire due à la mort de cent mille dindonneaux en Angleterre. Les myco-toxines sont des composées non-protéiques, de faible poids moléculaire qui proviennent prin-cipalement des acides aminés (Bhatnagar, 2002). Près de 400 types de mycotoxines ont été découvertes mais juste une trentaine de ces molécules seulement ont une véritable importance en termes de santé animale et humaine (Creppy, 2000). Elles sont regroupées en fonction de leurs similitudes structurelles et de leurs principaux effets toxiques (Bennet et al., 2003). L’ingestion des aliments contaminés provoque une intoxication chez le consommateur à con-dition que leur concentration soit suffisamment élevée pour produire un effet toxique (Quil-lien, 2002).

ECOTOXINOGENE

LES MOISISSURES

Le stockage des aliments conduit à une détérioration des aliments par les moisissures (Pitt, 1997). Le développement des moisissures sur les denrées alimentaires peut conduire à une dépréciation de la valeur nutritionnelle ou à des risques pour le consommateur (mycotoxi-coses). Les moisissures peuvent produire des toxines signifiantes (Tableau 1) (Chapeland-Leclerc et al., 2005). Les champignons majeurs connus comme précurseurs de l’ochratoxine A et de l’aflatoxine qui sont impliquées dans l’alimentation humaine et animale, appartiennent principalement aux genres : Aspergillus et Penicillium (Filali et al., 2001; Lopez de Cerain et al., 2002 ; Delage et al., 2003). Certains échantillons d’orges (82,3%) en Espagne (Medina et al., 2006) et d’autres échantillons de sorgho et de riz (71,7%, et 77,7%) au Togo conte-naient les Aspergillus (Ahanogbé et al., 1994).

MYCOTOXINES EN ALIMENTATION HUMAINE ET ANIMALE

La contamination des aliments ou des graines peut avoir lieu avant ou pendant le stockage. Les champignons toxinogènes sont classés en 4 groupes :
• Pathogènes pour la plante (exemple de Fusarium graminareum élaborant la zéaralénone) ;
• Moisissures poussant et produisant les mycotoxines sur des plantes sénes-centes ou stressées (Fusarium moniliforme produisant la fumonisine et Asper-gillus flavus produisant les aflatoxines) ;
• Champignons colonisant à l’origine la plante et prédisposant celle-ci à la contamination par la mycotoxine lors de la récolte (Fusarium roseum produi-sant des trichothécènes) ;
• Champignons existant dans le sol et dans le matériel de putréfaction et qui
prolifèreront lors du stockage (Aspergillus ochraceus et Penicillium viridica-tum élaborant tous deux l’ochratoxine A).
Ces moisissures et mycotoxines entraînent des problèmes économiques tout au long de la chaîne alimentaire ; du producteur de grains, aux éleveurs de volailles et de bétail, et aux industries alimentaires fabriquant des produits pour les animaux et pour l’homme. Elles po-sent aussi des problèmes de santé pour l’homme (Creppy et al., 2002b).
Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à deux mycotoxines : l’aflatoxine et l’ochratoxine A.

L’AFLATOXINE

L’aflatoxine est un métabolite secondaire synthétisé par des souches d’Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus et Aspergillus nomius (Blanc, 1982).
• Structure des aflatoxines
Les travaux de l’équipe de recherche d’Asao, d’Iongh et Holzapfel ont permis de connaitre la structure des aflatoxines. Il existe l’aflatoxine B1, B2, G1, G2 et M (figure 2).
• Propriétés physico-chimiques des aflatoxines
Les aflatoxines sont des molécules de faibles poids moléculaires (312 à 330 g/mol). Elles sont très peu solubles dans l’eau (10 à 30 µg/ml), insolubles dans les solvants non po-laires et très solubles dans les solvants polaires (le chloroforme, le méthanol) (Creppy et al., 2002b). Sous la lumière UV, les aflatoxines B émettent de manière intense une fluorescence bleue, tandis que les aflatoxines G émettent une fluorescence verte (Asao et al., 1965). Les aflatoxines se trouvent instables sous la lumière ultraviolette en présence d’oxygène avec des pH extrêmes (pH < 3 ou pH > 10). La température minimale de décomposition s’élève à 237°C. Cette propriété les rend particulièrement résistantes aux traitements thermiques comme la congélation, la pasteurisation ou encore la stérilisation (Creppy et al., 2002b).
Par oxydation, le cycle lactone des aflatoxines devient sensible à une hydrolyse alcaline, mais en cas de neutralisation, il peut se reformer. Les aflatoxines sont aussi dégradées par l’ammoniaque (NH4OH) et l’hypochlorite de sodium (NaOCl). Ainsi, lors de cette dernière réaction, il se forme le 2,3-dichloro-aflatoxine B1 qui est directement génotoxique (Cole et Cox, 1981).
• Toxicocinétique de l’aflatoxine
L’absorption des aflatoxines est possible par voie orale et trachéale (Kumagai et al., 1989). La distribution a lieu principalement au niveau du foie via la veine porte. Elle s’effectue à partir du plasma sanguin vers les hépatocytes, par diffusion passive (Müller et al., 1988). Le métabolisme hépatique de l’aflatoxine s’effectue soit par l’intermédiaire des cytochromes hépatiques P450 et par le devenir de l’aflatoxine B1-8,9-époxyde (figure 3) (Creppy et al., 2002b). L’élimination est principalement biliaire. Elle représente environ 50
% de la dose excrétée chez la plupart des espèces animales, tandis que la voie urinaire repré-sente 15 à 25 % de la dose ingérée (Wong et al., 1980). Chez certains animaux, il semblerait que les aflatoxines persistent dans le foie et le rein sous forme liée et non métabolisée (Chen et al., 1984).
• Effets toxique généraux des aflatoxines
Les aflatoxines possèdent des propriétés cancérogènes, hépatotoxiques, tératogènes et immunotoxiques. Des groupes B et G, l’AFB1 est le composé présentant le potentiel toxique le plus important. L’aflatoxine B1 est la seule mycotoxine ayant un rôle avéré dans l’apparition de certains cancers du foie (Wogan, 2000). C’est la raison pour laquelle elle a été déclarée agent cancérogène pour l’Homme par le CIRC (groupe 1) (IARC, 1993).

L’OCHRATOXINE A

L’ochratoxine A est produite par des Aspergillus ochraceus dans les régions chaudes et Penicillium verrucossum dans les climats tempérés. Neuf Ochratoxines ont été identifiées, mais l’ochratoxine A est la plus abondante et la plus toxique (Creppy, 2004).
• Structure de l’ochratoxine A
L’ochratoxine A est une mycotoxine dérivée de la famille des dihydro isocouma-rines. Son nom chimique est «Lphénylalanine-N-[(5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-méthyl-1-oxo-1H2-benzopyrane-7yl) carbonyl]-(R)-isocoumarine» (Ratulo et al., 2004 ) et sa for-mule brute est C20H18ClNO6 (Weidenburner, 2001).
Les structures des autres ochratoxines sont similaires à celle de l’ochratoxine A (Figure 4). L’ochratoxine B est le dérivé non chloré de l’ochratoxine A. L’ochratoxine C est son ester éthylique (Creppy et al., 1990 ; Hadidane et al.,1992) .
• Propriétés physiques et chimique de l’ochratoxine A
L’ochratoxine A est un acide organique faible de pKa égal à 7,1. C’est un solide blanc ayant une masse molaire de 403,8 g/mol. De structure cristalline variant, elle possède une intense fluorescence en lumière UV (El khouri, 2007). Elle est de couleur verte en milieu acide et bleue en milieu alcalin. Cette fluorescence est à l’origine des méthodes de détection et de dosage de l’Ochratoxine A. En raison de la stabilité de sa structure chimique, l’OTA résiste aisément aux procédés industriels de transformation.
Elle est dégradée partiellement dans des conditions normales de cuisson mais est totalement détruite par des solutions d’hypochlorite de sodium (Müller, 1982).
• Toxicocinétique de l’ochratoxine A
L’ochratoxine A est absorbée au niveau du jéjunum par la diffusion passive de la forme non ionisée (Studer-Rohr et al., 2000). La distribution tissulaire de l’ochratoxine A suit en général l’ordre suivant : reins >foie et muscle> graisses. Dans l’organisme l’OTA est métabolisée en plusieurs conjugué pouvant être retrouvés dans le sang ou les urines (figure 5) (Li et al., 1997 ; Creppy et al., 1999 ; Faucet et al., 2006 ). L’élimination se fait par toutes les voies d’excrétions (urinaire, fécale et biliaire). Une partie de l’ochratoxine A qui se re-trouve dans la bile peut être réabsorbée au niveau de l’intestin (Creppy et al., 1999 ; Pfohl-Leszkowicz et al., 2002 ; Manderville et al., 2006).

ECHANTILLONNAGE

Afin d’obtenir une représentativité des échantillons à analyser, nous avons effectué un échantillonnage à deux degrés.
• Un échantillonnage en grappe pour le choix des marchés. Ainsi cinq principaux marchés de Lomé ont été retenus :
 le marché de Hédjranawoé ;
 le marché d’Akodésséwa ;
 le marché de Bè ;
 le marché d’Adidogomé ;
 le marché d’Attikpodji.
• Un second sondage aléatoire auprès des consommateurs pour sélectionner les aliments qui sont couramment consommés. Ainsi 14 aliments ont été retenus :
 Grains de maïs (Zea mays) et produits issus de leur transformation (« Ema », « Akloui », « Khom », »Akassa », « Liha  » et « Akpan ») ;
 Grains de sorgho (Sorghum bicolor) et dérivés (« Tchoukoutchou » et « Tchakpalo ») ;
 Manioc (Manihot esculenta) et dérivés (cosette de manioc et « Agbelima ») ;
 Bière industrielle dénommée Pils faite à base du riz, du malt et du houblon.

TAILLE DE L’ECHANTILLON

Au total 210 échantillons pesant environ 200g chacun ont été prélevés au hasard dans les cinq marchés dans la période du 02 Mai au 02 Juin 2018.

TRANSPORT ET CONDITIONNEMENT

Les échantillons prélevés dans les différents marchés ont été conditionnés dans des sa-chets plastiques. Ils ont été acheminés dans moins de deux heures au laboratoire de l’Institut Togolais de Recherche Agronomique dans une glacière. Ils ont été codifiés et conservés dans des congélateurs muni de thermomètre de suivi de contrôle de la température à -20°C. La taille globale des échantillons est supérieure à 1 kg (CEC, 2006).

ANALYSE DES ECHANTILLONS

PREPARATION DES ECHANTILLONS

Pour chaque type d’aliment, il a été effectué un mélange de cinq échantillons élé-mentaires (100g) pour obtenir trois échantillons composites par type d’aliments.
Pour les produits solides, la préparation a commencé par un broyage de l’échantillon grâce au broyeur afin de réduire la taille et bien le mélanger. La granulométrie du broyat a une taille de 0,5 mm.Pour les produits liquides, après le mélange, l’homogénéisation a été effectuée grâce à un agitateur. Un bon nettoyage du broyeur et des béchers a été effectué à l’aide du tampon de lavage PBS entre deux échantillons pour éviter les contaminations croisées.
Les manipulations ont été effectuées dans les laboratoires de contrôle qualité et de normalisa-tion et de biosécurité et biodiversité de l’Institut Togolais de Recherche Agronomique à Lo-mé.

PARAMETRES PHYSICO-CHIMIQUES

 La teneur en eau
La teneur en eau d’un produit est la perte de masse subite par ce produit après chauf-fage. Elle est déterminée par la méthode de chauffage à l’étuve. Cette méthode est validée par la norme française V 03-903 : 1966.
• Principe : Dessiccation du produit à une température voisine de 103°C, dans une étuve isotherme, jusqu’à élimination complète de l’eau. Suivi d’une déter-mination de la perte d’eau.
• Mode opératoire
– Un creuset vide est chauffé à l’étuve et refroidit au dessiccateur ;
– Dans le creuset vide, après l’avoir pesé nous mettons environ 5g de l’échantillon tout en notant la masse totale obtenue ;
– Le creuset contenant la prise d’essai est mis à l’étuve à 103°C ;
– Après 4h, nous enlevons le creuset de l’étuve et nous le mettons dans le dessiccateur ;
– Après refroidissement, nous pesons le creuset après étuvage ;
– La manipulation du creuset est faite avec une pince.
• Expression des résultats
La teneur en eau est calculée par la formule suivante (équation 1) : Te ( – )
Équation 1 : formule de calcul de la teneur en eau
Te : Taux d’humidité en pourcentage
Mt : masse en gramme de la creusée contenant l’échantillon
m1 : masse en gramme de la creusée contenant l’échantillon après étuvage
me : masse en gramme de l’échantillon
 La teneur en protéines
Les protéines contiennent de l’azote. Cette propriété sera exploitée dans la méthode de détermination de la teneur en protéines dans les aliments. Le dosage de l’azote dans les produits se fera par la méthode de KJELDAHL. Pour déterminer la teneur en protéines, le taux d’azote sera multiplié par le coefficient de conversion spécifique aux céréales destinées à l’alimentation humaine.
• Principe : Minéralisation de la matière organique par l’acide sulfurique en pré-sence d’un catalyseur, alcalinisation des produits de la réaction, distillation et ti-trage de l’ammoniac libéré.
• Mode opératoire
– 1g de l’échantillon concerné est introduit dans un matras Kjeldahl ;
– La minéralisation de la matière organique (transformation de l’azote protéique en ammoniac) se fait en ajoutant 5g de catalyseur (K2SO4 et CuSO4) et 25ml d’acide sulfurique concentré dans le matras suivi d’un chauffage avec modération (en agitant de temps en temps) pendant 2h de temps.
– Après refroidissement du matras, la Distillation de l’ammoniac (les molécules d’ammoniacs libérées sont entrainées par la vapeur et fixées dans une solu-tion d’acide borique) se fait en mettant 250ml d’eau dans le matras pour dissoudre complètement les sulfates (les ions ammoniums formés sont transformés en ammoniac à l’aide d’un excès de NaOH et l’acide sulfurique est neutralisé). Le matras est ensuite placé sur le distillateur automatique.
Dans un erlenmeyer, 25ml d’acide borique (2%) et cinq gouttes de l’indicateur de Tas-hiro (mélange de Rouge de Méthyle et de bleu de méthylène) sont ajoutés. Il est placé sous le tuyau de récupération du distillateur automatique de marque Kjeldahl.
Après ajout de 80ml de solution de soude concentré dans le matras, l’ammoniac est dis-tillé par la vapeur d’eau et piégé dans la solution d’acide borique dans l’erlenmeyer ;
– Titrage : nous avons procédé à la titration du distillat récupéré en utili-sant de l’acide sulfurique à 0, 5 N ;
– Essai à blanc : Tous les Réactifs sont mis sauf l’échantillon, pour soustraire l’ammoniac contenu dans les réactifs de l’ammoniac contenu dans l’échantillon.

DOSAGE DE L’OCHRATOXINE A

Il a été fait à l’aide de la méthode développée et validée par RIDASCREEN sur les céréales, l’alimentation animale, la bière et le sérum de porc (R-BIOPHARM, 2003).
 Principe
Le test est basé sur une réaction antigène / anticorps. Les puits des barrettes de la mi-croplaque sont recouverts d´anticorps spécifiques dirigés contre l’ochratoxine A. Les solu-tions étalons ou les échantillons et le conjugué ochratoxine A enzyme sont ajoutés. L’ochratoxine A et son conjugué enzymatique entrent en compétition pour la liaison aux sites spécifiques de fixation de l’anticorps anti-ochratoxine A (test enzymatique par compétition). Tout conjugué enzymatique non-fixé est ensuite éliminé lors des lavages. Le subs-trat/chromogène est ajouté dans le puits et l’ensemble est laissé à incuber. Le conjugué enzy-matique fixé transforme le chromogène en un produit bleu. L’addition de la « solution» stop conduit à un changement de couleur du bleu au jaune. La couleur développée est inversement proportionnelle à la concentration en ochratoxine A de l’échantillon.
 Préparation des échantillons
• Bière
– 2ml d’échantillon filtré est mis dans un tube à vis centrifuge ;
– Un volume de 2,5 ml HCl et 4ml CH2Cl2 est ajouté dans le tube suivi d’une agitation pendant 5min suivi d’une centrifugation pendant 15min/3500g /15°C ;
– Après centrifugation, la phase aqueuse supérieure est éliminée ;
– La phase inférieure CH2Cl2 est filtrée et est récupérée dans un bécher ;
– 2ml de la phase CH2Cl2 récupérée et 2ml de NaHCO3 sont ajoutés dans un nouveau tube à vis centrifuge, suivi d’une agitation pendant 5min et d’une centrifu-gation pendant 5min/3500g /15°C ;
– Après centrifugation, la phase supérieure NaHCO3 est récupérée dans un nouveau tube à vis centrifuge ;
– Nous répétons l’extraction et la centrifugation de la phase CH2Cl2 récu-pérée avec 2ml de NaHCO3 suivi d’une agitation pendant 5min et d’une centrifugation pendant 5min/3500g /15°C ;
– Après centrifugation, la phase supérieure NaHCO3 est récupérée ;
– Après mélange des deux phases de NaHCO3, un volume de 0,75ml de HCl et 2ml CH2Cl2 est introduit dans le tube à vis centrifuge, suivi d’une agitation pen-dant 5min et d’une centrifugation pendant 5min/3500g /15°C ;
– Après centrifugation, la phase aqueuse supérieure est éliminée;
– La phase inférieure CH2Cl2 est évaporée à 60°C ;
– 1ml de NaHCO3 est ajouté au Résidu dans le bouchon à vis centrifuge ;
– 50 µl du mélange (NaHCO3 et Résidu) est utilisé par puits.
• Céréales
– 2g de l’échantillon broyé et 5ml de HCl sont introduits dans un tube à vis cen- trifuge ;
– Après agitation pendant 5min, un volume de 10ml de CH2Cl2 est ajouté ;
– Une seconde agitation est faite pendant 15min suivi d’une centrifugation pen-dant 5min/3500g /15°C ;
– Après centrifugation, à 3500 g pendant 5 min à 15+4 °C ou à température am-biante la phase aqueuse supérieure est éliminée;
– Avec un papier filtre, la phase inférieure CH2Cl2 est filtrée et est récupérée dans un nouveau tube à vis centrifuge ;
– Un volume équivalent de NaHCO3 est ajouté à la phase CH2Cl2 récupérée, suivi d’une agitation pendant 15min et une centrifugation pendant 15min/3500g /15°C ;
– Après centrifugation, la phase aqueuse supérieure est récupérée dans un nou-veau tube à vis centrifuge ;
– Dans un bécher, un mélange de 100µl de la phase aqueuse supérieure et 400 µl NaCO3 est effectué ;
– 50 µl du mélange (phase aqueuse supérieur et NaHCO3) est utilisé par puits.
 Protocole de dosage
– Un nombre suffisant de puits est installé tout en notant les positions ;
– 50 µl de solution étalon ou échantillon (en triple) est ajouté dans les puits ;
– Ensuite, un volume de 50 µl du conjugué ochratoxine A-Enzyme diluée est in-troduit dans chaque puits ; suivi d’un mélange (tout en faisant un mouvement circulaire de la plaque sur la paillasse) et d’une incubation pendant 30min ;
– Les puits sont vidés, en renversant la plaque délicatement avec un tapotage contre du papier absorbant ;
– Un double lavage de chaque puits est effectué avec 250 µl de PBS
– Après le lavage, la plaque est renversée délicatement et un tapotage contre du papier absorbant ;
– Ensuite, un volume de 100 µl de solution substrat /chromogène est ajouté dans chaque puits ;
– Nous mélangeons doucement en faisant un mouvement circulaire de la plaque sur la paillasse et nous l’incubons la plaque pendant 15min ;
– Après incubation, 100 µl de solution stop est ajouté dans chaque puits accom-pagné de mouvements circulaires de la plaque sur la paillasse ;
– La Densité Optique (DO) est mesurée à 450 nm.
 Détermination des concentrations en ochratoxine A
Elle est faite en trois étapes :
– Calcul du pourcentage d’activité (équation 6) :
% Activité
Équation 6: formule de calcul du pourcentage d’activité en ochratoxine A
– Représentation sur papier semi-logarithmique des étalons en fonction de la concentration en ppt
– Concentration réelle en ochratoxine A : c’est la concentration lue sur la courbe d’étalonnage (Annexe 3) multipliée par le facteur de dilution suivi d’une conversion en ppb.

DOSAGE DE L’AFLATOXINE

Les aflatoxines ont été extraites à l’aide des colonnes immuno-affinités suivies d’une lecture au fluorimètre.
 Extraction de l’échantillon :
– 50g de l’échantillon broyé avec 5g de NaCl sont introduits dans un broyeur ;
– Un volume de 100ml du mélange Méthanol : Eau (80:20) est ajouté dans le broyeur ;
– Après un broyage, le mélange est filtré avec du papier filtre,
– Le filtrat est récupéré dans un bécher.
 Dilution de l’extraction
– 10ml du filtrat et 20ml d’eau distillée sont introduits dans un béchersuivi d’un mélange ;
– Après un broyage, le mélange est filtré avec du papier filtre,
– Le filtrat est récupéré dans un nouveau bécher.
 Colonne chromatographique
– Les deux bouchons de la colonne d’immuno-affinité sont enlevés ;
– La colonne d’immuno-affinité est secouée doucement et est fixée au support de pompe VICAM ;
– 1ml du filtrat dilué est ajouté dans l’espace tête de la colonne ;
– Le filtrat sort goutte à goutte de la colonne ;
– 1 ml d’eau purifiée est ajouté dans la colonne;
– Après ,1ml de méthanol est introduit dans l’espace tête de la colonne ;
– L’éluant est recueilli dans un petit verre ;
– 1ml de solution afla-test développer est versée sur l’éluant ;
– Après un mélange, le petit verre est placé dans un fluorimètre calibré ;
– La lecture de la concentration d’aflatoxine est suivie.

CONCENTRATION DE L’AFLATOXINE

L’analyse de l’aflatoxine est réalisée sur les aliments dont la concentration maximale en Ochratoxine A est supérieure ou égale à 2 ppb. Les concentrations de l’aflatoxine sont pré-sentées dans le tableau 6. Elles varient de 3ppb à 90ppb.
La concentration moyenne en aflatoxine dans le manioc, sorgho, maïs et dérivées est présen-tée à la figure 15. Les produits brutes (sorgho grain, maïs grain et manioc cru) ont des concen-trations en aflatoxines plus élevées que les dérivées et ses concentrations sont supérieures à 30 ppb.Le niveau retrouvé dans le maïs est de deux fois ceux retrouvés dans le manioc et le sorgho.Les dérivées du maïs tels « Akassan » et « Akpan » ayant le même diagramme de traite-ment technologique ont présentés des teneurs en aflatoxines (4 à 5 ppb) plus faibles compa-rées aux autres dérivées issus de la farine fermentée (« Khom », « Ema » et « Aklui »).

DISCUSSIONS

• Ochratoxine A
Les résultats de la présente étude montrent qu’un niveau moyen remarquable de con-tamination en ochratoxine A au-dessus de la norme du Codex Alimentarius est retrouvé dans le « khom » une dérivée de maïs fermentée destinée à la consommation directe. La technique de production nécessite des moyens de détoxifications (vannage, triage, lavage) et une fermenta-tion traditionnelle non contrôlée de 5jours. Ainsi la forte contamination de cette dérivée fer-mentée par rapport aux autres dérivées du maïs peut s’expliquer par l’absence de traitement physique de décontamination des grains de la matière première d’une part, ou du niveau élevé de l’ochratoxine A dans les grains avant traitement. Wood (1982) et Scudamore (2005) ont montré qu’il y’a un impact positif de la réduction de l’ochratoxine A par le nettoyage, le triage et le moulage humide. Le trempage des grains de maïs dans l’eau élimine environ 43% de l’ochratoxine A.
Ces résultats s’alignent sur les recherches antérieures effectuées au Ghana et où le niveau de contamination varie de 0,6 ppb à 6,1ppb pour les pâtes fermentées à base de maïs (Kpodo et al., 1996). A part le « khom » où quelques variances sont observées dans la techno-logie de production, tous les autres produits analysés ont un niveau d’ochratoxine A conforme / inférieure à la norme du Codex Alimentarius (inférieure à 5 ppb).
La technique de fabrication de certaines dérivées de maïs passe par un tamisage sur une toile fine et un trempage de la farine tamisée dans l’eau (fermentation). Les mycotoxines présentent dans le péricarpe, l’albumen et l’embryon sont plus retenus dans le tamisage. Le processus de fermentation pourrait avoir impacté sur le niveau de contamination (Okeke et al., 2018). Ce processus justifie le niveau en éléments nutritifs plus faible des dérivées moins contaminées (« Akpan » et « Akassan ») par rapport à « khom » (notamment en glucides).
Les céréales brutes (maïs et sorgho) sont aussi contaminées par l’ochratoxine A et justifient leur présence dans les dérivées. La valeur maximale de l’ochratoxine A du maïs est supérieure à celle rapportée dans des études en Côte d’ivoire (Creppy, 2002a ; Sangare-Tigori et al., 2006), en Angleterre (Scudamore et al., 2000). Cependant des niveaux infé-rieures voire une absence d’ochratoxine A sont aussi rapportés de part le monde (Zinedine et al., 2006; Irama et al., 2014; Toffa et al., 2015). Contrairement au maïs, le sorgho a présenté un niveau moyen de 2,72 ppb. La contamination des grains de sorgho a été rapportée par les études de Ghali où le niveau varie de 0,11 ng/g à 33,8 ng/g avec une teneur moyenne de 5,4 ng/g (Ghali et al., 2009b). Alors que Zaied et al (2009) ont montré que 38% des échantillons de sorgho tunisien sont contaminés par l’OTA avec une concentration moyenne de 117 ng/g. Elbashir et Ali (2013) ont observé une faible incidence dans le sorgho des différentes régions du Soudan. Au Nigéria, la contamination variait de 0 à 29,5 ppb dans les grains de sorgho (Makun et al., 2013). L’existence de l’ochratoxine A dans les matières premières et leur de-gré de contamination s’expliquerait par les mauvaises pratiques agricoles, aux conditions en-vironnementales (Ecologie, climat, stress hydrique) et mauvaises modes de conservations.
La présence des moisissures sur les produits alimentaires dérivés du manioc, comme constaté dans le présent travail, a été rapporté par d’autres études antérieures (Gnonlonfin et al., 2008). La farine fermentée de manioc (« Agbélima ») a un taux faible en ochratoxine A. Le caractère acide (PH= 4,5) et la faible teneur en protéines de la farine fermentée du manioc ne favorisent pas la croissance des moisissures et par conséquent l’ochratoxine A (Guira ,2013). Dans la cossette de manioc produit sec, la contamination est huit fois supérieure à celle d’agbélima, la perte d’eau liée au séchage aurait favorisé la concentration d’ochratoxine A dans ce produit. Les données moyennes du manioc et ses dérivées sont relativement élevées par rapport à celles retrouvées dans les cossettes du marché de Kinshasa et RD Congo (Mukandila, 2010).
Fabriquée à partir de moût de céréales, la contamination de la bière par l’ochratoxine A provient de la contamination des matières premières. Les niveaux de contamination en ochratoxine A les plus faibles sont retrouvés dans les bières (0,096 ppb à 0,232 ppb). Le pro-cessus de fabrication de la bière inclus des méthodes (vannage, lavage, séchage, mouture, tamisage, chauffage, décoction ou infusion, filtration pour récupérer la drêche) qui permettent la détoxification des céréales. Pour la bière, le procédé de maltage n’a pas d’influence sur la teneur en OTA et les quantités en OTA présentes se retrouvent dans le malt. Une réduction de 80 % et 50 % est observée respectivement lors des procédés de brassage et de fermentation. Au final, c’est bien 30 % à 40 % de l’ochratoxine A présente dans l’orge qui se retrouve dans la bière (Boivin, 1997). La bière industrielle a un taux plus faible que les bières tradition-nelles. En industrie, au cours du maltage on procède au dégermage des graines et d’autres traitements comme la pasteurisation, la stérilisation, la pascalisation et le conditionnement sont utilisés et contribuent à réduire ou éliminer les toxines dans les bières industrielles. Des études ont montré la faible contamination ou l’absence d’ochratoxine A dans les bières indus-trielles ou traditionnelles (Filali et al., 2001 ; Abia et al., 2013 ; Ezekiel et al., 2015). Cepen-dant des bières produites à base de produits locaux (sorgho) peuvent présenter des niveaux de contaminations élevés. En Afrique du sud, Odhav et al., (2002) ont rapporté une contamination allant de 1,5 à 2340 µg/l pour les boissons à base de sorgho et 2,340 µg/kg à 3 µg/kg pour la bière industrielle.
• Aflatoxines
Les échantillons ont montré aussi une contamination en aflatoxines dans les produits bruts et dérivées (4 ppb – 80 ppb). Ces résultats sont en accord avec les précédentes études au Togo qui montraient l’existence d’aflatoxines à des niveaux de contaminations d’environ 100ppb dans les céréales brutes (Hell et al., 2000; Dossou, 2002; Gong et al., 2002; Egal et al., 2005 ; James et al., 2007). Une autre étude au Togo a révélé la présence de l’aflatoxine B1 dans le sang et l’urine des témoins et patients ayant participé à l’étude (Agbetsivi, 2005).
Comparativement aux grains de maïs où la teneur en aflatoxines est de 80ppb, le grain sorgho est moins contaminé (32 ppb). Le grain de maïs est très fréquemment contaminé par des espèces d’Aspergillus aflatoxinogènes (Odhiambo et al., 2013; Kachapulula et al., 2017). En Afrique occidentale, les concentrations en aflatoxines dans le sorgho sont substan-tiellement plus faibles que dans le maïs (Kane et al., 1991; Bandyopadhyay et al., 2007). L’hygrométrie et la température constituent des facteurs importants dans le développement des moisissures et la production des toxines. Ainsi, les conditions de température (30°C) et d’humidité relative (70%) favoriserait le développement des moisissures toxinogènes (Blanc, 1982). Les mauvaises pratiques agricoles à savoir les récoltes à surmaturité, le séchage retar-dé, les grains endommagés pendant l’égrainage (Wagacha et al., 2008; Ahmed et al., 2009; Akowuah et al., 2015) , les dommages causés par les insectes , le stress dû à la sécheresse avant la récolte ( Hell et al., 2008) sont à l’origine de la contamination des céréales par l’aflatoxine. Une autre étude au Togo a révélé la présence de l’aflatoxine B1 allant jusqu’à 256 ppb dans le maïs (Hanvi et al., 2019). La valeur retrouvée dans notre échantillon de maïs (80 ppb) est inférieure à celle retrouvée au Ghana (1400 µg/kg) et au Nigéria (1200 µg/kg) (Perrone, 2014). La contamination allait de 0, 3 ppb à 395 ppb (Sénégal) et 0ppb à 609 ppb (Burkina-faso) pour les grains de maïs analysés (Probts et al., 2014). La valeur retrouvée dans notre échantillon de sorgho est supérieure à celle retrouvée dans le sorgho au Nigéria (Apey et al., 2016).Warth et al., 2012 ont montré que les grains de sorgho collectés au Bur-kina-Faso ont une contamination deux fois moins que ceux du maïs. Le grain de maïs est plus riche en glucides que celui du sorgho. En Afrique de l’ouest, le maïs représente la principale source d’apport calorique dans le régime alimentaire national de presque tous les pays de la zone (Faostat, 2015). Plusieurs méthodes de traitements réduisent à peine le niveau de myco-toxines dans le maïs contaminé, donc transféré sur des produits transformés (James et al., 2018). Les dérivées fermentées de maïs comme « Khom » (21 ppb), « Aklui » (18 ppb) et « Ema » (15 ppb) ont une concentration supérieure à celle d’ »Akpan » (4 ppb) et d’ »Akassan » (5 ppb). Cela est dû à la technologie. « Akpan » et « Akassan » ont la même technologie. Dans leur pro-cessus il y’a des étapes qui permettent la détoxification de la graine comme le tamisage fin de la farine fermentée de maïs. Par contre « Aklui » et « Ema » ont le dépélliculage dans leur proces-sus. Les travaux de Fandohan et al en 2003 ont montré que le dépelliculage a un impact sur les teneurs en mycotoxines. Les taux élevés d’aflatoxine dans « Aklui » et « Ema » peuvent se justifier par la présence de l’aflatoxine en minorité sur l’enveloppe mais plutôt dans l’albumen et l’embryon. Le « Khom » (dérivée fermentée cuite) présente une contamination supérieure aux autres dérivées du maïs. Une fréquente consommation des dérivées fermentées présente-rait un risque pour la santé. La contamination des dérivées est due à la présence de l’aflatoxine dans les grains de maïs utilisés. Une étude antérieure a montré une concentration en aflatoxines allant de 6,1 ppb à 196 ppb pour les « Khom » analysées au Ghana (Kpodo et al., 1996). Les travaux de Fandohan et al en 2005 ont montré le traitement traditionnel sur le maïs peut considérablement réduire les niveaux d’aflatoxines jusqu’à 93 % et la fermentation n’a pas un effet signifiant sur la réduction des mycotoxines. Aucune contamination n’a été retrouvée pour l’ »Ema ». Un taux faible (1,83 ng /g) a été retrouvé dans l’ »Akpan ».
La contamination en aflatoxines des tubercules notamment du manioc a montré une teneur égale à 35 ppb. Cette forte contamination du manioc au Togo peut s’expliquer par la tenneur en eau élévée et le stockage dans le sol ou dans des caisses en bois durant plusieurs mois.Des études antérieures ont identifié la présence d’Aspergillus flavus dans les dérivées du manioc (Gnonlonfin et al., 2007; Mukandila et al., 2010). Au Cameroun et en Tanzanie, la contamination par l’aflatoxine a été retrouvée dans les chips (Essono et al., 2009; Manjula et al., 2009). Nos résultats sont en désaccord avec une étude qui montrait l’absence de l’aflatoxine dans le manioc frais (Adjovi et al., 2015). De même les travaux effectués au Ghana, au Nigeria et au Bénin ont également montré que des échantillons de copeaux de ma-nioc entièrement transformés n’étaient pas contaminé par des aflatoxines (Wareing et al., 2001 ; Jimoh et al., 2008 ; Gnonlonfin et al., 2008; Gnonlonfin et al., 2012). Un faible ni-veau d’aflatoxine (0,3 ppb – 4,4 ppb) a été retrouvé dans les chips, farine et copeaux de ma-nioc en Tanzanie, au Congo et au Nigéria (Manjula et al., 2009 ; Abass, 2017) . Une autre étude au Bénin a prouvé l’existence de propriétés anti-aflatoxines dans le manioc (Adjovi et al., 2013).
Une co-occurrence entre l’ochratoxine A et l’aflatoxine existe dans les échantillons analysés destinés à la consommation. La concentration de l’aflatoxine est supérieure à celle de l’ochratoxine A. Nos résultats sont en accord avec les travaux de Carvalho qui a retrouvé une fréquence de 77,7 % pour l’aflatoxine et 33,3 % pour l’ochratoxine A dans les échantillons qu’il a analysé (Carvalho et al., 2016). Les moisissures produisant l’OTA, peuvent également produire d’autres toxines ou cohabiter avec d’autres moisissures produisant des toxines diffé-rentes ou des aflatoxines produites par Aspergillus flavus (Steyn, 1993). D’autres études ont rapporté la co-occurrence de différentes mycotoxines dans les céréales et produits céréaliers (Ghali et al., 2008 ; Zinedine et al., 2009). La co-contamination de mycotoxines entrainent des effets additifs et synergiques sur la santé (Salem et al., 2010).
Au TOGO, il n’existe pas de législations nationales pour les mycotoxines dans les denrées alimentaires. Ce sont donc les limites du Codex Alimentarius qui sont utilisées (Ecowax, 2015). La valeur fixée par le Codex Alimentarius pour l’aflatoxine totale est de 10 ppb et 5ppb pour l’ochratoxine A (Codex, 1995a). Par contre certains pays de la CEDEAO ont établis des limites nationales pour l’aflatoxine. Au Bénin et au Nigéria, la limite maximale pour l’aflatoxine est de 4 ppb alors qu’elle est de 15 ppb pour le Ghana et 20 ppb pour le Bur-kina-Faso (Ecowax, 2015). Sur le plan régional, la limite maximale europénne est de 4 ppb pour l’aflatoxine et 3 ppb pour l’ochratoxine A. En Amérique, elle est de 20ppb pour l’aflatoxine (FAO, 2004).
Seul, un échantillon a une valeur en ochratoxine A qui dépasse la limite du Codex Alimenta-rius et la limite européenne. Pour l’aflatoxine, certaines valeurs retrouvées dépassent large-ment les différentes limites établies. Les causes possibles sont les conditions climatiques (chaudes et humides), la composition chimique du substrat, le stress subit par la plante et dommages causées par les insectes qui attaquent la surface et facilite l’accès des moisissures, l’ignorance des paysans sur la présence des mycotoxines, les mauvaises pratiques agricoles, le stockage pour la plupart dans les greniers et dans les silos, l’absence des méthodes de décon-tamination (surtout le tri et le lavage) avant les procédés de transformations. Les pratiques agricoles en Afrique visent l’autosuffisance alimentaire sans se préoccuper de la présence de mycotoxines dans les aliments. La pauvreté et surtout l’insécurité alimentaire représente la principale barrière à la mise en place de certaines méthodes de lutte telle que le tri (Fandohan et al., 2008). La lutte contre les mycotoxines manque de volonté politique dans la quasi-totalité des pays africains. De ce fait les programmes de lutte contre ce fléau ne sont pas inté-grés dans les chaines de valeurs céréalières. La prévention et le contrôle des mycotoxines en Afrique ne concernent que les céréales destinées à l’exportation (Dieme et al. 2016).

Table des matières

Sigles et abreviations
Introduction
première partie : généralités
I. Présentation du milieu d’etude
1. Présentation du pays
2. Les habitudes alimentaires des togolais
II. Mycotoxines
1. Ecotoxinogène
1.1 Les moisissures
1.2 Toxinogénèse dans les denrées alimentaires
2. Biosynthèse des mycotoxines
3. Mycotoxines en alimentation humaine et animale
3.1 L’aflatoxine
3.2 L’ochratoxine A
4. Méthodes de détection des mycotoxines
5. Toxicité des mycotoxines
6. Régulation et législation des mycotoxines dans le monde
III. Objectifs du travail
deuxième partie: méthodologie
I. Période et cadre d’étude
II. Echantillonnage
III. Taille de l’échantillon
IV. Transport et conditionnement
V. Matériel de travail
VI. Analyse des échantillons
1. Préparation des échantillons
2. Paramètres physico-chimiques
3. Dosage de l’ochratoxine A
4. Dosage de l’aflatoxine
VII. Analyse statistique
troisième partie : résultats et discussion
I. Résultats
1. Concentration de l’ochratoxine A
2. Concentration de l’aflatoxine
3. Qualité des produits
II. Discussions
Conclusions et recommandations
Bibliographie

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