Mycobacterium Avium Subspecies Paratuberculosis : une résistance particulière ?

MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS

LE LAIT : UN VECTEUR POTENTIEL ?

Au fur et à mesure que les données concernant Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis s’accumulaient, naissaient de nouvelles interrogations et le lien possible entre la maladie de Crohn et la paratuberculose a poussé différentes équipes de chercheurs à se pencher sur les éventuels vecteurs de la mycobactérie. La transmission par voie orale étant celle qui avait rassemblé les suffrages, ce sont les denrées alimentaires issus des bovins infectés qui ont été particulièrement observées. Les populations d’éleveurs bovins n’étant pas significativement plus touchées que les autres, la possibilité d’une transmission oro-fécale due à un manque d’hygiène a été écartée. Les possibilités restantes étaient une contamination par le lait ou par la viande et les organes consommables. Si c’est aujourd’hui le lait qui est au centre des débats de par l’abondance des travaux qui ont été menés, d’autres études sont en cours à l’heure actuelle pour rechercher Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis dans la viande et les tissus consommables par l’homme.

Recherches sur le lait naturel

Plusieurs études ont été menées dans les années 90. Les chiffres sont très différents selon les méthodes de détection employées et les animaux considérés : certains chercheurs ont testé des animaux issus de troupeaux au sein desquels des cas cliniques avaient été enregistrés au préalable, d’autres n’ont pris en compte que les vaches positives (par coproculture ou par sérologie)et enfin une dernière démarche a consisté à prendre des échantillons de façon totalement aléatoire. Quoi qu’il en soit, le point commun de ces études est qu’elles ont montré avant toute chose que l’excrétion dans le lait était subordonnée à l’état clinique des animaux. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis était ainsi détecté chez 35% des animaux ayant développé des signes cliniques alors que ce taux tombe à 11.6% chez les animaux asymptomatiques.Une étude de (Streeter et al, 1995) semble montrer que le colostrum est plus facilement vecteur de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis que le lait puisque sur 126 animaux asymptomatiques testés, 36 présentaient des échantillons fécaux positifs et parmi ces mêmes animaux, huit présentaient Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis dans le colostrum contre seulement trois dans le lait. Selon les techniques de détection utilisées, les taux de prélèvements positifs sont variables mais les taux de contamination restent toujours faibles (entre 2 et 5 ufc /50ml lait). Il va sans dire que ces mesures ne tiennent pas compte de probables contaminations fécales. Hammer, 1999 a utilisé de façon simultanée la culture et la Polymerisation Chain Reaction (sonde IS900) pour détecter Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis dans le lait et ses résultats montrent également la présence dans certains cas d’éléments détectables par PCR mais ne présentant aucune croissance. Ceci invite à se montrer prudents vis à vis de la PCR qui peut révéler des « faux » positifs. Une étude plus récente menée sur des échantillons de lait cru commercialisé en GrandeBretagne a isolé 4 prélèvements contenants des cellules viables de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis sur 244 testés (Grant et al., 2002a).
Il est à noter en revanche que les mêmes études menées sur des cheptels ovins n’ont montré que très exceptionnellement un passage de mycobactéries dans le lait.

Recherches sur le lait pasteurisé

Dans la mesure où il ne semblait pas y avoir de corrélation entre l’apparition de la maladie de Crohn chez l’homme et la consommation de lait cru, il a été évoqué le fait que Map puisse être présent dans le lait pasteurisé.Une étude datant de 1996 (Millar et al) a montré la présence de Mycobacterium avium subspecies .paratuberculosis dans du lait après pasteurisation. Sur les 312 échantillons testés, 22 s’étaient avérés positifs après une détection par PCR IS900. Des mises en culture des échantillons testés ont été entreprises et ont donné des résultats positifs aussi bien parmi les échantillons PCR positifs que parmi ceux initialement négatifs.On a ainsi trouvé que 50% des échantillons PCR positifs contenaient des éléments capables de générer des colonies, contre 16% au sein des échantillons PCR négatifs.Des recherches plus larges ont été depuis entreprises sur des laits commercialisés et on a pu obtenir des cultures positives après isolement par PCR. La Food Standard Agency en 2000, a détecté des éléments viables dans 2.1% des échantillons issus du commerce (étude réalisée au Royaume-Uni). Même s’il n’est pas possible d’exclure dans ce cas une contamination post-pasteurisation, la survie de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis au traitement thermique classique apparaît vraisemblable d’autant plus que d’autres études de vaste envergure ont donné des résultats allant dans le même sens pour les petits ruminants (Grant et al., 2002a).

Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie choix d’une sonde fluorescente de type Taqman®

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Table des matières

INDEX DES FIGURES
INDEX DES TABLEAUX
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE DES DONNEES CONCERNANT MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS ET LE LAIT
I – LE LAIT : UN VECTEUR POTENTIEL ?
1- Recherches sur le lait naturel
2- Recherches sur le lait pasteurisé
II – MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS : UNE RESISTANCE PARTICULIERE ?
1- Courbes d’inactivation thermique
2- Evaluation de l’efficacité des traitements thermiques sur des laits contaminés par Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
3- Influence de l’augmentation de la température et/ou du temps de chauffage
4- Analyse des contradictions
a- Inoculats
Les souches
Mode d’obtention des cellules
Taux d’inoculation
b- Lait
c- Matériel de chauffage et de refroidissement
Matériels
Méthodes de mélange
Refroidissement
d- Détection
5- Hypothèse du « clumping »
a- Méthodes de « declumping »
b- Une hypothèse contestée
DEUXIEME PARTIE : MISE AU POINT D’UNE METHODE DE DETECTION STANDARDISEE DANS LE LAIT. RECHERCHE DE CELLULES VIVANTES PAR RT-PCR
I- PRINCIPES DE LA METHODE DE DETECTION
1- Utilisation du facteur d’élongation EF-Tu
a- Rappels concernant la synthèse protéique
L’initiation
L’élongation
La terminaison
b- Les facteurs d’élongation
Le facteur EF-Tu
Les sondes Taqman®
2- Utilisation du gène IS900
a- Choix d’une sonde fluorescente de type Taqman®
b- Validation des amorces et de la sonde en PCR quantitative sur ADN de souches
c- Validation des amorces et de la sonde en RT-QPCR quantitative sur ARN de souches
3- Démarche expérimentale
a- Obtention des amorces
b- Etude de la spécificité de la méthode de détection par EF-Tu
Choix de la sonde fluorescente de type Taqman®
Validation des amorces et de la sonde PCR quantitative sur des ADN de souches
Validation des amorces et de la sonde en RT-PCR qualitative sur des ARN de souches
Validation de la RT-QPCR sur du lait artificiellement contaminé par Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
c- Etude de la sensibilité de la méthode de détection
Optimisation de gamme étalon d’ARN synthétique
Sensibilité de la méthode sur du lait artificiellement contaminé par Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
Conclusion
II- DETERMINATION DE L’ECHANTILLON
1- Choix des animaux
2- Collecte des laits
III- PROTOCOLE EXPERIMENTAL ET RESULTATS
1- Q-PCR pour la détection d’IS900
2- RT-QPCR pour la détection de EF-Tu
a- extraction d’ARNs et d’ADN issus de lait contaminé par Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
b- RT-QPCR
3- Résultats
a- Données globales
b- Q-PCR ciblée sur IS900
c- RT-QPCR ciblée sur EF-Tu
4- Discussion des résultats
a- L’animal n’est pas excréteur
b- Le lait est contaminé mais ne contient aucun organisme viable
c- La technique de détection est défaillante
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES