Soutenance mémoire
Madagascar possède une biodiversité floristique réellement unique au monde rapportée à la superficie du pays. Sa flore est riche avec 1500 espèces d’orchidées dont environ 85% sont endémiques (Ravo, 1996 ; Dupuy et al., 1999) ; 490 genres autochtones d’arbres et de grands arbustes dont 161 sont endémiques de Madagascar et des îles de l’Archipel des Comores (Schatz, 2000). Les genres endémiques sont représentés par 940 espèces et les 329 autres genres non endémiques sont repartis en 3280 espèces dont 95 % sont endémiques. Ainsi, sur les 4220 espèces d’arbres et de grands arbustes malgaches, 96 % sont endémiques, soit un niveau extraordinairement élevé d’endémisme spécifique. Les trois familles: Euphorbiaceae, Fabaceae et Rubiaceae représentent près d’un tiers des genres d’arbres et de grands arbustes de Madagascar (Humbert, 1962). Ces arbres et arbustes sont répartis dans tous les quatre coins de Madagascar y compris le site minier d`Ambatovy
Les survies de la biodiversité dépendent de leurs habitats forestiers qui sont perpétuellement perturbées par les activités humaines. La déforestation menace la survie des espèces et diminue ainsi ces biodiversités (Andriamanga, 2011). A la Mine, l’extraction du minerai requiert le défrichement de forêts. Néanmoins, afin de pouvoir préserver les espèces faunistiques et floristiques, le projet a mis en place un programme de gestion de la biodiversité. Ambatovy a identifié, avec l’aide du Missouri Botanical Garden, toutes les espèces végétales qui n’existent que sur l’empreinte minière et sur un ou deux autres sites à Madagascar. Ces plantes sont catégorisées comme des Espèces Préoccupantes ou SOCs (Species Of Concern). La conservation ex-situ de ces espèces SOCs comprend la collecte de semences, la récupération de la plante en entier, la propagation des plantes et le développement des collections vivantes pour la réhabilitation progressive de l’empreinte de la Mine.
HISTORIQUE DE LA CULTURE IN VITRO
La multiplication in vitro trouve son fondement dans le concept de « totipotence cellulaire » énoncé au début du siècle : la cellule, unité morphologique et physiologique de l’être vivant, est capable d’autonomie. Elle possède toute l’information génétique nécessaire à régénérer la plante entière, à condition de créer les conditions favorables à ce développement. Ce concept énoncé en 1902 par Haberland (Gautheret, 1983) ne sera finalement démontré par Steward (Steward,1958) et son équipe qu’en 1958, lorsque ces chercheurs obtiendront les premiers embryons artificiels appelés « embryons somatiques » à partir de cellules de carotte qui évolueront par la suite en jeunes plantules (Zryd, 1988 ; Margara, 1989 ; Auge et al.,1989 ; Boxus, 1995).
En effet, le botaniste Haberland fut le premier en 1902 (Gautheret, 2009), à définir exactement le problème de la culture des tissus et la tenter avec des fragments de plantes très diverses. Il obtenait une survie des cellules de quelque mois mais en absence de multiplication (Schmid, 1972 et Heller, 1953).
A partir de 1922, Robbins aux Etats-Unis, et Kotte en Allemagne (Victor, 2009), obtiennent la croissance de pointes de racines pendant quelques mois seulement. En 1934, Gautheret eut l’idée d’utiliser le tissu cambial des arbres. Il avait aussi trouvé le matériel idéal mais pas encore le milieu nutritif optimal. Ce n’est qu’en 1932 que White aux Etats-Unis (White, 1932) obtint des cultures indéfinies de cellules de tabac. Au même moment, Gautheret et Nobecourt publiaient leurs résultats sur la culture indéfinie de tissus de carotte. A la suite en 1935, le Professeur Gautheret, en France, avait cultivé et multiplié des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu. Quelques temps après en 1939, il a réussi des cultures indéfinies de tissus végétaux normaux de carotte (Gautheret, 1959). La souche pourrait toujours être entretenue et les cellules continuent à proliférer. Les travaux de White sur les cultures de tabac concernaient sur des tumeurs végétales et ne nécessitaient pas d’adjonction de phytohormones. Il faut citer également les travaux contemporains du français Nobecourt (Nobecourt, 1939), quatrième pionnier des cultures in vitro végétales, sur la carotte. Le succès fut assuré lorsqu’on commença à ajouter au milieu de culture de l’auxine. En 1946, partant d’apex, Ball aux USA (Ball, 1949) a obtenu quelques plantes de lupin. Tandis que Wetmore et Morel (Morel, 1952) ont régénéré des fougères en 1949. A la même époque, l’équipe de Limasset et Cornuet en France (Limasset et Cornuet, 1949) démontrent l’absence de particules virales dans les apex de tabac (Zryd, 1988). Ces dernières observations ont été mises à profit, vers les années 1952, par Morel et Martin à l’I.N.R.A. de Versailles qui ont réussi à obtenir, par culture in vitro de méristèmes, des plantes saines (indemnes de viroses) à partir de dahlia. Dix ans plus tard (Murashige et al., 1962) ont mis au point des cultures de tissus de tabac avec le fameux milieu de culture M.S. utilisé largement en culture in vitro. Il s’agit d’un milieu contenant des éléments minéraux, des vitamines du groupe B, du sucre, et des régulateurs de croissance (auxine, cytokinine,…).
Depuis le début du XXème siècle, de nombreux chercheurs ont œuvré et continué à travailler au cœur de leurs laboratoires afin d’améliorer les techniques mises au point par les pionniers dans les différentes techniques de cultures in vitro. L’objectif étant d’utiliser ces outils sur le plus grand nombre d’espèces possibles et avec le meilleur rendement, ceci à des fins d’amélioration des plantes au service de l’homme et de son environnement.
DEFINITIONS
Culture in vitro
La culture in vitro est un corpus de méthodes faisant intervenir d’une part des éléments d`asepsie et d`autre part impliquant la mise en place d`un environnement parfaitement contrôlé. Ces méthodes s`appliquent tout autant à des plantes entières qu`à des fragments de plante (tissus ou organes) et bien entendu à des cellules plus ou moins isolées (Zryd, 1988). Elle englobe la micropropagation, la culture du méristème, l`embryogénèse somatique,…
Cette technique exploite ce qu`on appelle «la totipotence» cellulaire. C`est une aptitude pour une cellule végétale à exprimer la totalité des potentialités du génome pour donner un organisme entier (Boutherin et al., 1989). Cette totipotence cellulaire s’accompagne d’une possibilité de multiplication indéfinie et peut être observé dans les zones de croissance de la plante: les méristèmes, cellules restant dans un état méristèmatique permanent.
Micro-propagation
Le microbouturage consiste à produire, en conditions stériles, de nombreux bourgeons axillaires à partir d’un bourgeon ou d’un méristème. Les bourgeons sont multipliés, allongés en tigelles de quelques centimètres et enracinés en présence d’une auxine (Gille, 2002). Le principe est donc de prélever un groupe de cellules d’une plante, ou un fragment de tige ou feuille ou organe végétatif et de le placer dans un milieu contenant tous les éléments nutritifs nécessaires au développement de la plante fille. Ainsi, à partir d’un de ces fragments, un explant peut reconstituer une plante entière.
La micropropagation emprunte deux principales voies.
➤ L’une qui utilise des tissus méristèmatiques (méristème ou apex de tige, bourgeons axillaires) potentiellement capables de donner, suite au développement normal, un individu appelé microbouture. Cette technique est souvent appelée « multiplication conforme » car elle part de méristème préexistant dans lequel, les cellules sont génétiquement stables (Boxus, 1995). L’individu est généralement obtenu en deux étapes successives, d’abord la production de tige, puis son enracinement.
➤ L’autre voie utilise toute sorte de tissus différenciés (fragments de tige, de racines, de pétiole, de feuilles, d’embryons matures et immatures, d’hypocotyles, cotylédons…etc.) pour aboutir à la néoformation soit de bourgeons ou de racines, c’est l’organogenèse, soit de structures ressemblant aux embryons zygotiques, c’est l’embryogenèse somatique (Zryd, 1988 ; Margara, 1989).
La formation d’embryons ou de pousses adventives peut se produire directement sans passer par la callogenèse dans le cas de l’organogenèse ou embryogenèse directe, ou indirectement dans le cas où les pousses ou les embryons se forment à partir de cals cas de l’organogenèse ou embryogenèse indirecte (Dobranszki et Teixeira da Silva, 2010).
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Table des matières
INTRODUCTION
Première partie: Généralités
I. HISTORIQUE DE LA CULTURE IN VITRO
II. DEFINITIONS
II.1. Culture in vitro
II.2. Micropropagation
II.3. Organogenèse
II.4. Rhizogenèse
III. MILIEU DE CULTURE
III.1. Eléments minéraux
III.1.1. Macroéléments
III.1.2. Microéléments
III.2. Eléments organiques
III.2.1. Sucres
III.2.2. Vitamines
III.2.3. Acides aminés
III.3. Régulateurs de croissance
III.3.1. Auxines
III.3.2. Cytokinines
IV. AUTRES SUPPLEMENTS UTILISES EN CULTURES DE TISSUS VEGETAUX
V. AVANTAGES DU MICROBOUTURAGE
VI. MILIEU D’ ETUDE
VI.1. Site de recolte de la plante mère
VI.2. Laboratoire
Deuxième partie: Matériel et Méthodes
I. MATERIEL VEGETAL
I.1. Classification botanique
I.2. Description morphologique
II. METHODES
II.1. Stérilisation des matériels
II.2. Péparation du milieu de culture
II.2.1. Préparation de la solution mère
II.2.2. Homogénéisation et coulage
II.3. Multiplication in vitro de Morinda sp nov A
II.3.1. Multiplication par allongement des pousses
a. Protocole de realisation de la culture
b. Paramètres d’évaluation
II.3.2. Multiplication par bourgeonnement axillaire
a. Protocole de réalisation de la culture
b. Paramètre d’évaluations
II.4. Conditions de culture
II.5. Traitement statistique des resultats
Troisième partie: Résultats et interprétations
I. MULTIPLICATION PAR ALLONGEMENT DES POUSSES
I.1 Nombre de nœuds
I.2. Hauteur des pousses
II. MULTIPLICATION PAR BOURGEONNEMENT AXILLAIRE
II.1. Nombre de pousses
II.2. Hauteur des pousses
III. COMPARAISON DES DEUX METHODES
III.1. Facteur de multiplication
III.2. Hauteur des pousses
Quatrième partie: Discussion
I. MULTIPLICATION PAR ALLONGEMENT DES POUSSES
II. MULTIPLICATION PAR BOURGEONNEMENT AXILLAIRE
CONCLUSION
