Morphologies et répartitions géographiques

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Principes actifs et propriétés pharmacologiques

Les premières études cliniques qui ont permis d’isoler les principes actifs présent dans les feuilles de Centella asiatica furent effectuées en 1940 (Rouillard-Guellec et al., 1997). L’étude était basée sur l’utilisation de deux techniques de chromatographie : la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) et la Chromatographie en couches minces (Raharison, 1983 ; Rouillard-Guellec et al., 1997 ; Brinkhaus et al., 2000)
La feuille de C.asiatica contient deux triterpènes, l’acide asiatique et l’acide madécasique, et leurs dérivés, l’asiaticoside, le madécassoside et l’acide terminole.
L’asiaticoside, la substance active la plus importante, a été découverte par Bontems en 1942. C’est à l’asiaticoside que la plante doit son activité. En effet, il est doté de propriétés qui confèrent à la plante de nombreuses vertus thérapeutiques, telles que : antidiarrhéique, anti-chéloïdien, anti-lépreux, anti-galeux, anti-rhumatismeux, antispasmodique, anti-tumorale, antivénérien, anti-scléreux, anti-ulcéreux, cicatrisant, dépuratif, diurétique, fortifiant, ophtalmique, tonique, vulnéraire (Raharison, 1983).

Morphologies et répartitions géographiques

Centella asiatica présente des variations morphologiques difficiles à interpréter. La morphologie de la plante varie en effet considérablement avec l’habitat et dans un même habitat au cours de l’année et suivant les changements climatiques (Boiteau, 1943). Cependant, la forme générale des feuilles, la variation de la pilosité et la variation du développement des involucres ont permis la reconnaissance de trois variétés principales, au sein desquels peuvent encore exister des variations morphologiques diverses. (Boiteau, 1943).
Rappels bibliographiques
Ces trois variétés sont:
– Centella asiatica (L.) Urb. var. typica,
– Centella asiatica var. abyssinica Gandoger pro sp.
– Centella asiatica var. floridana Nannf pro sp.

Variététypica

La variététypica a une forme dite asiatico-malgache. Elle a :
– des feuilles nettement réniformes, bien dentées d’une contexture variable, plus ou moins molles suivant l’habitat et la saison de récolte,
– une faible pilosité,
– un involucre muni de deux bractées relativement courtes .
Elle s’étend de l’Asie méridionale à Madagascar, dans les pays suivant : Japon, Taiwan, Philippines, Chine, Indochine, Thaïlande, Birmanie, Timor, Java, Célèbes, Sumatra, Bornéo, Sri Lanka, Indes, Ile de Socotora, Seychelles, Mayotte, Ile dela Réunion, Ile Maurice et Madagascar (Boiteau, 1943) (Carte 1).

Variétéabyssinica

La variétéabyssinica a une forme dite africaine. Elle a :
– des feuilles suborbiculaires à sinus marqué avec des dents plus atténuées,
– une forte pilosité,
– un involucre développé et entièrement recouvert de poils longs et arachnéens.
Elle est localisée dans toute l’Afrique équatoriale et tropicale, de l’Ethiopie et du
Sénégal jusqu’à la province du Cap, y compris les Comores et de Zanzibar (Boiteau, 1943) (Carte 1).

Variétéfloridana

La variétéfloridana a une forme océano-américaine. Cette variété a des feuilles souvent plus longues que larges, à sinus bien marqué, à faible pubescence, à dents nettement marquées et deltoïdes (Boiteau, 1943).
Elle est retrouvée en Tasmanie, en Nouvelle Zélande, en NouvelleCalédonie, en Uruguay, en Paraguay, au Brésil, à Porto Rico, en Martinique, au Guadeloupe, au Guatemala, au Mexique et aux Etats-Unis (Boiteau, 1943) (Carte 1).

Généralités sur la technique CAPS ou PCR-FLP

La technique CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) ou PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) permet d’estimer le polymorphisme au sein d’une population ou entre des populations différentes (Szalanski et al, 2003). Le polymorphisme étant défini comme la résultante de variation de bases dans la séquence de l’ADN, cette technique permet donc de mesurer la diversité génétique à l’échelle d’un génome (Tagu et al., 1999).
La technique PCR-RFLP repose sur l’amplification in vitro (PCR) d’une région connue et spécifique d’un ADN, suivie d’une digestion enzymatique spécifique (Szalanski et al, 2003). Elle consiste à digérer le fragment amplifié avec une ou plusieurs enzymes de restriction et à révéler le polymorphisme des sites de restriction par électrophorèse en gel d’agarose ou d’acrylamide non dénaturant, c’est-à -dire un gel qui ne dénature pas l’ADN en simple brin (Grivet et al, 1999).

Amplification in vitro ou PCR

La technique PCR est une technique d’amplification in vitro (Etienne, 1993). C’est un concept technologique découverte par Karry Mullis en 1983. Elle fût ensuite développée par Henri A. Herlich et collaborateurs en 1985 (Larzul, 1993). Cette technique permet d’augmenter de manière considérable la quantité d’ADN initiale (Etienne, 1993).
L’amplification d’une séquence nucléotidique par la technique PCR estune réaction catalysée par une enzyme thermostable, la Taq polymérase, en présence d’ADN, de paires d’amorces, des desoxyribonucléotides ou dNTP et de Dichlorure de magnésium ou MgCl2 (GNIS, 2006).

Réactifs de la PCR

ADN matriciel

L’ADN matriciel est une séquence de nucléotides constituée de différentes régions qui peuvent éventuellement être amplifiées. Dans la technique PCR, estil généralement utilisé sous forme bicaténaire, c’est-à -dire à double brin (GENET, 2006).
Les trois types de génome existant chez les végétaux, le génomenucléaire, le génome chloroplastique et le génome mitochondrial, peuvent être utilisés comme ADN matriciel.

Amorces

Une amorce est un oligonucléotide monocaténaire, c’est-à -dire à simple brin, qui a été cloné et synthétisé in vitro. Après hybridation sur une séquence homologue d’un brin d’ADN dénaturé, l’amorce sert de point d’ancrage pour démarrer la synthèse du brin complémentaire (Grivet et al., 1999). Les amorces sont utilisées en paires, l’une va intervenir dans l’amplification du brin d’ADN 5’ -3’ et l’autre dans l’amplification du brin complémentaire 3’ -5’.
Pour l’amplification des génomes d’une plante, trois types d’amorces peuvent être utilisées selon l’ADN ciblé:
– les amorces nucléaires, spécifiques au génome nucléaire,
– les amorces chloroplastiques, spécifiques au génome chloroplastique,
– les amorces mitochondriales, spécifiques au génome mitochondrial.
Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d’ADN à amplifier. Ce choix doit se faire de manières rationnelles. Il est indispensable d’utiliser des amorces de taille suffisante (20 à 30 nucléotides) pour s’assurer de la spécificité des fragments amplifiés car il existe toujours un risque d’amplifier des régions non spécifiques (Etienne, 1993). Le choix des amorces se fait soit à partir des donnés des études antécédentes, soit en consultant les banques de séquences disponibles sur Internet (Exemple : National Center for Biotechnology Information ou NCBI, retrouvé sur le site webwww.ncbi.nlm.nih.gov).

ADN polymérase

L’ADN polymérase utilisée pour la PCR est la Taq polymérase.Elle permet l’extension des amorces en fixant les dNTPs dans le sens 5’ – 3’ (Larzul, 1993).
La Taq polymérase a été isolée, pour la première fois, par Klenow en 1969. Elle a été extraite à partir d’une bactérie extrémophyle (non inactivée par la chaleur), le Thermus aquaticus. C’est une bactérie thermophile qui vit à proximité des sources chaudes de Yellowstone National Park aux Etats-Unis. Sa température optimale d’action est de 72°C et elle est capable de résister à de fortes températures llant jusqu’à 95°C (Etienne, 1993 ; Larzul, 1993 ; Tagu et al., 1999).
La fidélité de l’activité enzymatique de la Taq polyméraseest due à la présence d’une activité exonucléasique 3’-5’ associée, qui lui confère la capacité d’exciser un nucléotide incorrectement apparié en 3’ d’une amorce.

Désoxyribonucléotides

Les désoxyribonucléotides (dGTP, dCTP, dATP, dTTP) appelés globalement dNTPs (Désoxyribonucléotides Triphosphates), sont les éléments de seba utilisés par la Taq polymérase pour synthétiser les brins d’ADN complémentaires (IML, 2006).

Le dichlorure de magnésium

Le dichlorure de magnésium ou MgCl est un cofacteur de la Taq polymérase. Il facilite l’ouverture des brins d’ADN bicaténaire et forme des complexes solubles avec les dNTPs (GNIS, 2006).

Réaction de la PCR

La réaction de la technique PCR est une réaction cyclique constiuée par une succession de trois étapes thermostatiques : la dénaturation, l’hybridation et l’élongation (Figure 3). Elle est effectuée dans un appareil appeléthermocycleur (GNIS, 2006).

Etape de dénaturation

Les 2 brins complémentaires de l’ADN sont maintenus appariés par des liaisons spécifiques non covalentes établies entre les basesC-G et A-T. L’étape de dénaturation consiste à coupe r ces liaisons par chauffage et à séparer ainsi les deux brins d’ADN. L’ADN est dit dénaturé et chaque brin d’ADN servira de matricepour l’amplification (Larzul, 1993).

Etape d’hybridation

Par une diminution progressive de la température, les amorces viennent s’hybrider sur les matrices au niveau de leurs séquences complémentaires respective (Larzul, 1993).
La température d’hybridation, dite température d’annealing ou accrochage des amorces, est un paramètre important pour la réaction de la PCR. Elle dépend de la séquence des amorces oligonucléotides.

Etape d’élongation

A une température élevée et en présence de la Taq polymérase, s dNTPs vont former les brins complémentaires dans le sens 5’ – 3’ à partir des amorces. Ces dNTPs doivent être en large excès dans le milieu réactionnel.Les nucléotides sont incorporés en fonction de la séquence cible de l’ADN matrice. Cette extension est réalisée de façon simultanée sur les deux brins d’ADN. Deux nouveaux brins complémentaires sont ainsi synthétisés, ce sont lesamplicons (Larzul, 1993)
A chaque cycle, la quantité d’ADN est doublée : 2n copies du fragment sont obtenues après n cycles (Tagu et al., 1999).

Digestion enzymatique

La digestion enzymatique consiste à couper les produits de la PCR par l’intermédiaire des enzymes de restriction.
Les enzymes de restrictions furent découvertes à partir de 1973 (GENET, 2006). Elles appartiennent à la classe des endonucléases, c’est-à -dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique. Elles sont isolées à partir de bactéries d’où elles tirent leurs noms et leurs classifications (GENET, 2006). Ce sont des enzymes qui digèrent (ou coupent) les ADN bicaténaires en des sites spécifiques, arrangés en palindrome (même séquence surdeux brins complémentaires mais en sens inverse), appelés sites de restriction, (Kremer, 1998).
La coupure des enzymes de restriction peut être franche ou décalée sur les deux brins (Tagu et al., 1999). Les coupures franches sont obtenues des extrémités franchespar coupure au même endroit sur les deux brins .
La spécificité des enzymes de restriction est telle que leremplacement d’une seule base dans un site suffit à empêcher la coupure de l’ADN par l’enzyme utilisée. Cette spécificité est exploitée pour la mise en évidence du polymorphismeune: présence-absence de site de restriction entraîne un polymorphisme de longueur de fragment (Kremer, 1998).

Migration et révélation

L’action d’une enzyme de restriction sur une molécule d’ADN génère des fragments de restriction (Tagu et al, 1999). Ces fragments peuvent être séparés en fonction de leurs tailles par électrophorèse. L’électrophorèsest une technique de séparation par migration, sous l’effet d’un champ électrique, des molécules protéiques ionisées dont les mobilités sont différentes. Son support de migration est constitué par unmilieu gélifié. Pour cette étude, du gel d’acrylamide a été utilisé afin d’obtenir une bonne résolution parce que l’électrophorèse sur gel acrylamide permet des séparationsde fragments de petite taille (inférieur à 1000 paires de base).
Après la digestion enzymatique, l’ADN est déposé dans des puits d’inclusion à l’extrémité d’un gel préalablement confectionné et est ensuite soumis à un champ électrique.
Les molécules d’ADN, chargées négativement, migrent dans un champ électrophorétique de l’anode (pôle négatif) vers la cathode (pôle positif). En passant au travers des mailles de l’acrylamide, les molécules se séparent selon leur taille : plus le fragment a une taille élevée, moins la migration électrophorétiquesera importante ; à l’opposé les fragments de petites tailles auront une distance de migration plus élevée (GENET, 2006).
La taille des fragments de restriction est obtenue en comparant leur mobilité électrophorétique à celle des marqueurs de taille (fragment de taille connue) qui sont migrés sur le gel en même temps que les échantillons.
Le tampon utilisé pour la migration électrophorétique est le TBE ouTris-Borate-EDTA. Il permet de garder constant le pH du milieu à 8,3, pour éviter la dégradation de l’ADN. Il permet également le passage du courant dans l’appareil électrophorétique.
La détection des fragments d’ADN sur ce type de gel est réalisée par exposition aux rayons ultraviolets, après réaction avec le BET ou Bromure d’ethydium. Le BET est un agent qui s’intercale entre les bases des acides nucléiques, il a la propriété de fluorescer en rouge orange lorsqu’elle est excitée sous rayons ultraviolets.
Le profil de restriction obtenu permet de visualiser l’existence ou non de polymorphisme génétique au sein de l’espèce étudiée.

Méthodes

Etudes morphométriques

Mesures

Chaque localité a été représentée par cinq feuilles appartenant à cinqonescl différents .
L’étude a été basée sur 14 paramètres:
– la longueur du pétiole, mesurée en mm à l’aide d’une règle graduée,
– la longueur du limbe, mesurée en mm à l’aide d’une règle graduée,
– la grande longueur du limbe, mesurée en mm à l’aide d’une règle graduée,
– la largeur du limbe, mesurée en mm à l’aide d’une règle graduée,
– l’angle de l’échancrure du limbe, mesuré en degré à l’aide d’un rapporteur,
– le nombre de dents foliaires, qui a été compté à la main,
– la surface du limbe, déterminée par un appareil de mesure de surface foliaire (LI-30000A Portable Area Meter) et mesurée en cm²,
– la surface calculée du limbe, exprimé en cm², déterminée parproduitle de la largeur et de la grande longueur du limbe (feuille assimilée à un rectangle),
– le poids de la matière sèche de la feuille, exprimé en mg. Lesfeuilles ont été séchées à l’étuve à105°C pendant 24h, et ont ensuite été pesées sur une balance de précision,
– le rapport entre la longueur et la largeur du limbe, exprimé en mm/mm,
– le rapport entre la grande longueur et la longueur du limbe, exprimé en mm/mm,
– le rapport entre la grande longueur et la largeur du limbe, exprimé en mm/mm, représente également l’échancrure du limbe,
– le rapport entre le poids de la matière sèche et la surface du limbe, exprimé en mg/mm,
– le rapport entre la longueur du pétiole et la longueur du limbe, exprimé en mm/mm. Les termes  utilisés pour désigner les différents paramètresont été appliqués selon la terminologie de Kade et al en 2003.
Une analyse préliminaire en analyse en composantes principales a été effectuée avec ces 14 paramètres, afin de sélectionner les paramètres les plus discriminants pour l’étude. Ceux présentant un cosinus carré supérieur à 0.500 ont été retenus.

Table des matières

Introduction
Rappels bibliographiques
I. Généralités sur Centella asiatica (L.) Urban
I.1. Classifications
I.2. Description botanique
I.2.1. Appareil végétatif
I.2.2. Appareil reproducteur
I.3. Mode de multiplication
I.4. Principes actifs et propriétés pharmacologiques
I.5. Morphologies et répartitions géographiques
I.5.1. Variété typica
I.5.2. Variété abyssinica
I.5.3. Variété floridana
II. Généralités sur la technique CAPS ou PCR-RFLP
II.1. Amplification in vitro ou PCR
II.1.1. Réactifs de la PCR
II.1.1.1. ADN matriciel
II.1.1.2. Amorces
II.1.1.3. ADN polymérase
II.1.1.4. Désoxyribonucléotides
II.1.1.5. Le dichlorure de magnésium
II.1.2. Réaction de la PCR
II.1.2.1. Etape de dénaturation
II.1.2.2. Etape d’hybridation
II.1.2.3. Etape d’élongation
II.2. Digestion enzymatique
II.3. Migration et révélation
Matériel et Méthodes
I. Matériel végétal
II. Méthodes
II.1. Etudes morphométriques
II.1.1. Mesures
II.1.2. Analyses statistiques
II.1.2.1. Analyses en composantes principales
a. Présentation de la technique
b. Analyse et interprétation des résultats
II.1.2.2. Classification Ascendante Hiérarchique
II.2. Etudes de la diversité génétique
II.2.1. Extraction d’ADN
II.2.1.1. Protocole d’extraction
II.2.1.2. Test de présence d’ADN
a. Migration
b. Révélation
II.2.1.3. Estimation de la quantité d’ADN
II.2.2. Procédure de la technique CAPS
II.2.2.1. Amplification in vitro ou PCR
II.2.2.2. Digestion enzymatique
II.2.2.3. Migration et Révélation
a. Migration
b. Révélation
II.2.3. Analyse des profils de restriction
Résultats
I. Etudes morphométriques
I.1. Analyse en Composantes Principales (ACP)
I.1.1. Corrélation entre les variables
I.1.2. Etudes des similitudes entre les individus et entre les individus et les variables
I.2. Classification Ascendante Hiérarchique (CAH)
I.3. Synthèse des résultats
II. Etudes de la diversité génétique de Centella asiatica
Discussions
Conclusions et perspectives
Références bibliographiques
Références des documents électroniques
Annexes

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