MODULATION MUSCARINIQUE DE LA DEPRESSION CORTICALE ENVAHISSANTE

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Canaux Potassiques à deux domaines pore (K2P)

Les canaux potassiques à deux domaines pore ou K2P constituent une grande sous famille de canaux potassiques, et structurellement bien distincte. Le génome humain contient 15 gènes codant pour des canaux K2P (KCNK), qui peuvent être divisés en six groupes distincts sur la base de leurs propriétés structurelles et fonctionnelles : TWIK, TASK, TREK, THIK, TALK et TRESK. Cependant les canaux K2P se différencient de la plupart des autres classes de canaux K+ car ils s’assemblent en « dimères de dimères », avec chaque sous unité contenant 4 segments transmembranaires (TM1 à TM4). Ainsi deux des quatre domaines pores sont requis pour former un pore standard de canal K+ tétramérique (figure 10).
Fonctionnellement, les canaux K2P agissent comme des canaux potassiques de fuite classiques, qui contribuent au potentiel de membrane de repos dans une grande variété de cellules dont les neurones, les myocytes squelettiques et myocardiques, la glie…

Céphalée Migraineuse

La céphalée particulière, pulsatile, si caractéristique de la Migraine, provient de l’activation et la sensibilisation de la voie TrigéminoVasculaire (TGV). La voie TGV fait le relai entre signaux douloureux périphériques et le cerveau.
Les méninges qui recouvrent et protègent le cerveau et leurs gros vaisseaux sont innervés par des afférences nociceptives périphériques provenant du ganglion trigéminé. Le ganglion projette aussi centralement vers le noyau spinal trigéminé (SpV). Celui-ci envoie des connexions vers :
* Les noyaux du Tronc Cérébral, les Noyaux Hypothalamiques et les Noyaux des ganglions de la base. Ces connexions joueraient un rôle dans les symptômes associés à la céphalée comme les nausées, vomissements, fatigue, etc.
* Les noyaux thalamiques VentroPostérioMedial et Postérieur (Po/VPM) qui relient les afférences vers le cortex somatosensoriel, insulaire, pariétal, visuel, auditif, olfactif… ce qui expliquerait les autres symptômes associés à la migraine : troubles visuels, photophobie, maladresse, etc.

Migraine Hémiplégique

Il existe des formes particulièrement sévères mais rares de Migraine avec Aura, où les patients présentent des problèmes moteurs pendant l’aura, comme une ataxie, une hémiplégie, ou une faiblesse musculaire unilatérale (ICHD). On parle de Migraine Hémiplégique, et les crises de MH commencent généralement à l’âge de 10 ou 20 ans. Si le cas est isolé (sans historique familial), il s’agit d’une Migraine Hémiplégique Sporadique. Si au contraire le patient a au moins un parent du 1er ou 2nd degré présentant les mêmes symptômes, on parlera de Migraine Hémiplégique Familiale. Dans les cas les plus sévères, la crise de MH s’accompagne d’une ataxie cérébelleuse permanente, des crises d’épilepsie, un oedème cérébral, un coma… (figure 12)
Des études génétiques familiales ont montré que la MH est une pathologique génétique, à transmission autosomale dominante, provoquée par la mutation d’un gène. La forme sporadique de MH serait due à une mutation de novo, ou à la transmission de la mutation par un parent asymptomatique. Le séquençage a permis d’identifier les gènes impliqués, et à ce jour 3 gènes mutés sont retrouvés dans les cas de MHF et MHS. Jusqu’à présent, 200 familles touchées par la MHF et 200 personnes présentant un MHS ont été identifiés (13). (figure 13).

Migraine avec Aura et Mutation TRESK

Les mutations des canaux ioniques dans la MHF présentées plus haut ne sont pas retrouvées dans des cas typiques de migraine avec aura. D’autres types de canaux ioniques pourraient donc être impliqués dans ces cas-là.
Les canaux K2P sont exprimés dans tout le système nerveux central et ont un rôle clé dans le contrôle du potentiel de membrane de repos et l’excitabilité neuronale (24).
Récemment, une mutation dominant négatif d’un gène codant pour un canal K2P a été identifiée dans une famille de patients présentant une migraine avec aura avec un fort terrain héréditaire. La mutation F139WfsX24 est localisée sur le gène KCNK18 qui code pour le canal K2P TRESK, et engendre un canal tronqué (délétion de 2bp) (25). La protéine exprimée est non fonctionnelle et sert de dominant négatif qui régule négativement le fonctionnement de la protéine wild type. Cette étude détermine de plus l’expression du gène chez la souris principalement dans le ganglion trijumeau, les DRG et dans les ganglions du système nerveux périphérique. Cette expression dans les DRG et le trijumeau, suggère qu’elle se fait aussi dans KCNK18 dans les fibres B et les fibres C. Chez l’humain, l’étude montre une expression du canal dans la moelle épinière et des structures internes du cerveau, impliquées dans la voie trigéminale de la douleur. Il a été montré dans d’autres études, que des mutations des canaux TRESK entrainent une hyperexcitabilité des neurones du trijumeau, suggérant un rôle dans le développement de la migraine.
Dans une étude suivante, la même équipe a identifié une autre mutation perte de fonction (Cys110Arg) retrouvée non seulement chez des migraineux mais aussi chez des personnes non touchées. Evidemment, un seul variant TRESK non fonctionnel, n’est pas suffisant pour provoquer la migraine. De plus, plusieurs personnes peuvent être porteuses de mutations délétères sans pour autant présenter les symptômes de la pathologie. Si KCNK18 est un gène de la migraine, son rôle est probablement restreint à seulement peu de cas car plus de 500 patients migraineux ont été testés négatifs pour les mutations KCNK18. Cependant TRESK est reste une cible intéressante à cause de son expression dans les neurones trigéminaux et son rôle présumé dans la réduction de l’excitabilité neuronale dans des conditions inflammatoires.

Migraine et Hyperactivité Corticale

L’hypersensibilité sensorielle et l’hyperalgésie périphérique qui peuvent être observées entre les crises de migraines chez les patients et explorées expérimentalement (26), ainsi que les symptômes prodromiques survenant 24h avant la crise (difficultés langagières, irritabilité, etc), suggèrent une perturbation primaire (déjà installée) de l’excitabilité corticale. Actuellement, l’analyse de l’excitabilité corticale entre deux crises peut se faire par stimulation transcrânienne magnétique (TMS) ou IRM fonctionnelle par exemple, mais les études présentent des résultats contradictoires, où l’activité corticale est augmentée ou au contraire réduite. (27) Cependant ces résultats montrent tout de même qu’il existe bien un problème d’excitabilité, où la régulation entre excitation et inhibition est perturbée. Compte tenu des formes différentes que la migraine peut avoir d’une personne à l’autre, ces « contradictions » peuvent refléter la multiplicité des mécanismes (hypoactivation ou hyperactivation) sous-jacents à la crise de migraine.
La migraine présente une comorbidité avec l’épilepsie, la deuxième affection neurologique juste après la migraine. L’épilepsie est provoquée par un déséquilibre de la balance excitation/inhibition conduisant à une hyperexcitabilité cérébrale. Elle se caractérise par des crises paroxystiques causées par des décharges anormales et simultanées d’un large réseau de neurones. Les patients épileptiques semblent plus susceptibles de subir des crises de migraine, et la fréquence de survenue de crises d’épilepsie serait plus grande chez des patients migraineux, que la population saine (28). De plus dans au moins deux des trois types de MHF (1 et 2), les patients peuvent expérimenter des crises d’épilepsies en lien avec la mutation, phénotype retrouvé dans les modèles de souris (11). Chez les patients MHF 3 la survenue de crises et si elles sont liées à la mutation du Nav1.1 ou la présence d’un polymorphisme génétique reste encore à déterminer.
Si l’on met en parallèle migraine et épilepsie, l’hypothèse sur la nature des perturbations d’excitabilité corticale dans la migraine pourrait pencher en faveur d’une hyperexcitabilité. Il est maintenant admis que le corrélat électrophysiologique de l’aura dans la Migraine Avec Aura est un phénomène appelé Dépression Corticale Envahissante, qui hyperactiverait puis déprimerait les régions corticales sensorielles associées aux natures des auras (visuelles, olfactives, langagières…).
L’étude de la Dépression Corticale Envahissante comme conséquence et preuve d’une hyperexcitabilité corticale permet peu à peu de dévoiler les mécanismes possibles de la migraine, non seulement au niveau des auras, mais aussi au niveau du déclenchement de la céphalée.

Description de la DCE

La Dépression Corticale Envahissante est une vague de forte dépolarisation corticale qui se propage lentement (2 à 6 mm/min) au sein du tissu nerveux. Cette dépolarisation constitue la première phase du phénomène et dure une minute. Elle est suivie d’une période de silence électrique de l’activité corticale des neurones et astrocytes (dépression) de plusieurs minutes, la dépolarisation de neurones est telle que la génération de potentiels d’action devient impossible. Cette dépression se traduit sur un électroencéphalogramme (EEG) par exemple, par un silence électrique de plusieurs minutes.
Lors de l’étude de cette nouvelle vague de dépolarisation par stimulation électrique, Leao la décrivit comme une variation importante du courant direct (ou DC shift noté ΔVo) en deux phases : un premier pic négatif rapide (jusque -15 mV) puis soit un plateau moins négatif, soit un second pic négatif plus lent.
Ces dépolarisations paroxysmiques des cellules neuronales et gliales, s’accompagnent aussi d’un effondrement de l’homéostasie ionique et une perturbation importante des gradients ioniques qui traversent la membrane : une augmentation rapide du [K+]e (de 3 à 60 mM), une diminution rapide du [Na+]e et du [Cl-]e (de 140 à 50 mM) et du [Ca2+]e (de 1.0 à 0.2 mM). (11) (Figure 14) On peut observer une libération massive de neurotransmetteurs (tels que le glutamate et le GABA), un gonflement cellulaire causé par un état d’hyperosmolarité, une augmentation du métabolisme énergétique et des modifications du flux sanguin cérébral (30, 31). Cependant, malgré ces perturbations sur le passage de la DCE aucune mort cellulaire n’est observée, ni de dommage permanent du tissu cérébral. (32) Cependant, elle impose une charge bioénergétique importante au cerveau.

DCE et Voie Trigéminale

Plusieurs études permettent de placer la DCE comme activateur de la voie Trigéminée, qui est à l’origine de la céphalée typique de la migraine.
Récemment, chez le rat il a été montré que la DCE provoque une extravasation dans la dure-mère de neuropeptides vasoactifs (substance P, CGRP) provenant des afférences trigéminées, dénotant une neuro-inflammation. De plus, la DCE active les neurones du TNC (trigeminal nucleus caudalis), caractérisée par l’augmentation de l’expression du facteur c-fos dans le TNC. (44)
Plus récemment encore, il a été montré que la DCE chez le rat provoque une augmentation importante et prolongée (>45 minutes) de l’activité des nocicepteurs méningés, avec un délai entre le passage de la DCE et l’activation, qui peut être mis en parallèle avec les symptômes de la MA où la douleur survient peu après l’aura. Dans une petite proportion de rats, cependant, l’activation des nocicepteurs se fait en même temps que la DCE, ce qui peut aussi correspondre à certains cas de MA rapportés où douleur et aura surviennent simultanément. (figure 15).

Les mutations pathogènes du gène SCN1A

Les premières mutations pathogènes du gène SCN1A ont été identifiées par Escayg et al (46) : il s’agit de deux mutations faux-sens à l’origine de l’épilepsie génétique avec crises fébriles plus (EGCF+ ou GEFS+ en anglais). Cette pathologie génétique est caractérisée par des crises fébriles (provoquées par une hyperthermie ou une fièvre), qui souvent se poursuivent à l’âge adulte, et par une grande variabilité phénotypique des types d’épilepsies. Le Syndrome de Dravet est une encéphalopathie épileptique sévère caractérisée par des crises fébriles dès le déclenchement de la maladie et avec plus tard le développement d’une résistance aux traitements médicamenteux connus, des déficits cognitifs et comportementaux, une ataxie et une forte mortalité.
Puisque le SD et le GEFS+ présentent toutes les deux des crises fébriles, le gène SCN1A a été séquencé par Claes et al (47) chez des patients SD, et a identifié 7 mutations de novo. Six d’entre elles étaient suspectées de générer un canal Nav1.1 tronqué et non fonctionnel, tandis que la septième est une mutation faux-sens avec des conséquences fonctionnelles imprévisibles, à l’instar des mutations GEFS+.
Depuis les premières études, plus de 1000 mutations ont été identifiées dans le gène SCN1A. Elles sont la cause de plus de 80% des cas de SD, et environ 20% des cas de GEFS+ et d’autres phénotypes épileptiques rares. De plus, les variants génétiques de SCN1A apportent des facteurs de risque pour différents types d’épilepsies communes.
Une autre pathologie bien documentée provoquée par des mutations faux-sens de SCN1A est la MHF, une forme rare et sévère de migraine avec aura, caractérisée par une hémiplégie pendant les attaques de migraine. Dans la MHF 3, les crises d’épilepsie sont très rares et ne sont pas liées aux attaques de migraine.
Tout comme les premières mutations décrites, les mutations du Nav1.1 identifiées ensuite dans le SD sont soit des mutations faux-sens (pour environ pour un 1/3), avec des effets fonctionnels difficiles à prédire, ou des troncation/délétion qui sont prévues de donner lieu à des canaux non fonctionnels (environ 2/3). En revanche, les mutations GEFS+ et MHF du SCN1A sont toutes des mutations faux-sens. L’identification des mutants épileptogènes NaV tronqués, non fonctionnels, était au départ perturbant, car le NaV1.1 était suspecté de s’exprimer dans les neurones excitateurs et ses mutations perte de fonction n’étaient pas cohérentes avec l’hyperexcitabilité neuronale, qui est suspectée de donner lieu aux crises d’épilepsie.
Ces découvertes déconcertantes soulignent l’importance des études fonctionnelles pour l’identification des mécanismes pathologiques, qui sont toujours essentielles. En fait, bien qu’il y ait eu des progrès dans le développement d’algorithmes pour les prédictions in silico des effets des mutations, en général basées sur la conservation des propriétés physico chimiques des protéines et des séquences aminoacides dans et à travers les espèces, ils ne révèlent pas de manière fiable l’effet détaillé des fonctions de la protéine et ne sont pas des outils de prédiction des effets globaux sur les phénotypes.

Effets fonctionnels sur les propriétés d’excitabilité du canal et des neurones, étudiées dans les systèmes d’expression

Les études qui visaient à découvrir les effets fonctionnels des mutations SCN1A, en particulier les mutations faux-sens, ont initialement été entreprises sur des systèmes d’expression hétérologues sur cellules en culture qui n’expriment pas la protéine d’intérêt, et dans lesquels l’ADNc (clone ADN) d’intérêt est inséré/transfecté.
Ce sont en général des cellules embryonnaires humaines de rein (HEK) ou la lignée dérivée tsA-201, qui permet des screening relativement rapides des mutants, mais ils ne fournissent pas un fond cellulaire neuronal et de forment pas de circuits neuronaux pour étudier les effets sur l’activité de réseau.
Il est important de souligner que les mutations doivent être introduites dans l’ADNc humain de l’isoforme dans lequel la mutation a été identifiée, car les mêmes mutations peuvent avoir des effets fonctionnels différents dans les séquences paralogues ou orthologues. Cependant, l’utilisation d’ADNc humain du NaV1.1 a été un challenge technique à cause de son instabilité qui mène à des réarrangements de séquences quand il est traité avec des techniques de biologie moléculaire standard.
En effet, bien que sa séquence ait été identifiée en 1986, il a été re-cloné et exprimé avec succès pour la première fois seulement 16 ans plus tard, dans une étude visant à identifier les effets fonctionnels de trois mutations GEFS+. SCN1A subit un épissage alternatif à l’exon 11, qui produit des variants avec des délétions de 33 paires de base (11 aa) et 84 paires de base (28 aa) dans la boucle intracellulaire entre le domaine 1 et 2 ; le variant plus court de 33 pb est le variant épissé prédominant le plus exprimé dans le cerveau. Les variants complets et -33 pb ont été utilisés pour des études fonctionnelles dans des systèmes d’expression.

Autre Lignée d’optogénétique : Dlx5a/Dlx6a-cre x ChR2-td-tomato

Pour confirmer que les résultats obtenus avec les souris « VGAT ChR2 » peuvent être retrouvés dans une autre lignée de souris exprimant la ChR2 dans les neurones GABAergiques, nous avons croisés des Femelles ChR2 avec des mâles Dlx5a/dlx6a cre (sur le même modèle que précédemment présenté). La fluorescence de la Tomato est aussi vérifiée de la même façon qu’avec la lignée « VGAT ChR2 ». Dlx5a est un élément régulateur du développement des neurones GABAergiques dans le cerveau antérieur (62).

Autre Lignée d’optogénétique : PV-cre x ChR2-td-tomato

Pour certaines expériences, nous avons croisé des souris ChR2 lox Hémizygotes avec des souris issues d’une lignée PV-Cre, chez lesquelles l’expression de la Cre-recombinase est dépendante du promoteur PV ; spécifique des neurones GABAergiques libérant la protéine Parvalbumine, et représentant 5% de la population des neurones GABAergiques.

Lignée d’optogénétique avec invalidation du gène Nav1.1 : SMEI VGAT ChR2

Afin de comprendre l’implication de l’excitabilité des neurones GABAergiques dans l’induction de la CSD dans un contexte d’hyperactivité des neurones GABAergiques, nous avons croisé notre lignée principale d’optogénétique « VGAT-ChR2 » avec des souris d’un modèle génétique d’épilepsie génétique (Syndrome de Dravet) où le gène codant pour le canal Nav1.1 est invalidé, la lignée SMEI. Les animaux issus de ce croisement présentent une mortalité augmentée à partir de P21 ; les animaux sont donc utilisés en expérimentation à partir de cet âge-là.

Lignée avec invalidation des gènes codant pour TREK1 et TREK2

La lignée présentant une double invalidation des gènes codant pour TREK1 et TREK2 ont été générées comme précédemment décrite (61). Les souris mutantes et wild type, toutes des mâles, ont été cédées par Lesage et al.

Table des matières

Potentiel d’Action
Canaux Ioniques dans l’excitabilité neuronale
MIGRAINE
Historique
Migraines
Céphalée Migraineuse
Migraine Hémiplégique
Migraine avec Aura et Mutation TRESK
Migraine et Hyperactivité Corticale
DEPRESSION CORTICALE ENVAHISSANTE
Découverte de la DCE par A.A.P. Leão
Description de la DCE
DCE expérimentale
Rôle des Astrocytes
DCE et Migraine
DCE et Aura
DCE et Voie Trigéminale
INTRODUCTION DU PROJET DE RECHERCHE
1. ROLE DE L’ACTIVATION DU NAV
1.1 ET DES NEURONES GABAERGIQUES DANS L’INDUCTION DE LA DCE
Les mutations pathogènes du gène SCN1A
Effets fonctionnels sur les propriétés d’excitabilité du canal et des neurones, étudiées dans les systèmes d’expression
Mutations Epileptogènes
Mutation MHF 3
Approche Expérimentale
2. MODULATION MUSCARINIQUE DE LA DEPRESSION CORTICALE ENVAHISSANTE
3. EFFET DE L’INVALIDATION DES CANAUX TRESK SUR L’INDUCTION DE LA DCE
MATERIEL ET METHODES
MODELE ANIMAL
Ethique et Législation
Lignées Optogénétiques
Génotypage
ENREGISTREMENTS ELECTROPHYSIOLOGIQUES
Préparation des tranches de cerveau pour enregistrements électrophysiologiques ex vivo
Induction de la Dépression Corticale Envahissante ex vivo
Enregistrements électrophysiologiques ex vivo – Potentiel de Champ sur tranches
Enregistrements électrophysiologiques ex vivo – Whole cell Patch-clamp sur tranches
Pharmacologie
Analyses Statistiques
RESULTATS
PARTIE 1 – ROLE DE L’ACTIVATION DU NAV1.1 ET DES NEURONES GABAERGIQUES DANS L’INDUCTION DE LA DCE
PARTIE 2 – MODULATION MUSCARINIQUE DE LA DEPRESSION CORTICALE ENVAHISSANTE
PARTIE 3 – EFFET DE L’INVALIDATION DES CANAUX TRESK SUR L’INDUCTION DE LA DCE
DISCUSSION ET PERSPECTIVES

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