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Les espèces chimiques dérivées par réduction incomplète de l’oxygène, les ROS pour « Reactive Oxygen Species », et espèces réactives dérivées de l’azote, les RNS pour « Reactive Nitrogen Species », sont potentiellement toxiques pour les cellules, car leur pouvoir oxydant leur confère une grande réactivité sur la plupart des molécules biologiques. Des systèmes cellulaires existent, qui assurent leur maintien à des concentrations non toxiques. Cependant, l’oxygène est nécessaire aux cellules pour son rôle d’accepteur final d’électrons dans la chaîne respiratoire, et certains ROS ou RNS sont nécessaires à l’accomplissement de diverses fonctions biologiques. En particulier, l’H2O2 participe en tant que second messager à la signalisation cellulaire en aval de l’engagement de certains récepteurs à des facteurs de croissance.
Modifications chimiques des thiols par les espèces oxydantes
Réactivité des espèces réactives dérivées de l’oxygène et du monoxyde d’azote
Malgré le haut potentiel du couple O2/H2O, de l’ordre de 700mV, l’oxygène ne réagit que très lentement sur la plupart des molécules biologiques, car l’état de spin triplet de son niveau fondamental l’empêche de réagir avec des état singulets. Cependant, l’oxygène peut réagir avec des métaux pour subir dans la cellules une série de réductions qui aboutissent à la formation d’espèces dites « espèces réactives de l’oxygène » (ROS) : par réductions successives à un électron, l’anion superoxyde O2•- , le peroxyde d’hydrogène H2O2, puis le radical peroxyle HO• . Le superoxyde est produit dans les cellules au cours de cycles futiles d’enzymes de type oxydases qui utilisent l’O2 comme substrat, notamment au niveau de la chaîne respiratoire, ou par des enzymes spécialisés, les NADPH oxydases. Il est relativement peu réactif, et présente une spécificité pour l’oxydation de métallo protéines comme les protéines à centre fer-soufre. L’H2O2 produit par dismutation du superoxyde, spontanée ou catalysée, ou par l’effet de radiations ionisantes, peut oxyder des métallo-protéines, mais également certains acides aminés, en particulier les acides aminés soufrés. HO• peut être généré par des radiations ionisantes ou par la réduction catalysée par des métaux de l’ H2O2 (réaction de Fenton). Il réagit avec la plupart des molécules biologiques sans spécificité, avec des constantes de vitesse de réaction très élevées, proches des constantes de diffusion. Sont aussi considérés comme ROS l’état activé singulet de spin de l’oxygène 1O2, produit par photo-excitation de l’oxygène triplet, et l’acide hypochloreux HOCl, produit lors d’intoxication au dichlore par hydrolyse de ce composé ou au cours de la réponse inflammatoire par des enzymes spécialisés, les myéloperoxydases. Ces deux espèces présentent un large spectre de réactivité.
Le monoxyde d’azote NO est produit dans les cellules au cours de l’oxydation de l’arginine par les NO-synthases. Il peut réagir sur certaines métallo-protéines, en particulier les protéines contenant un fer ferreux. Les espèces dérivées du monoxyde d’azote (RNS) par oxydation comprennent des oxydes d’azote supérieurs, comme l’acide nitreux HNO2 et le trioxyde d’azote N2O3, ainsi que le peroxynitrite ONO2- . Ces espèces sont très oxydantes envers de nombreuses molécules biologiques.
De par leur grande réactivité, les espèces oxydantes sont potentiellement toxiques, et cette toxicité a été impliquée dans de nombreuses pathologies comme le cancer, l’athérosclérose, certains diabètes ou maladies neurodégénératives, ou des phénomènes de vieillissement. Pour limiter cette toxicité, les cellules sont équipées d’un arsenal de protection permettant la détoxication de ces espèces et la réparation des dommages oxydatifs causé aux bio-molécules. Nous nous sommes intéressés uniquement aux réactions conduisant à l’oxydation de cystéines dans des protéines sous forme de ponts disulfure.
Oxydation de cystéines en ponts disulfure
La cystéine est l’acide aminé le plus réactif envers des agents électrophiles (oxydants ou alkylants). La densité électronique fortement polarisable portée par l’atome du soufre en fait un bon réducteur et un nucléophile mou. De fait, la cystéine peut être modifiée par oxydation radicalaire à un électron, ou réaliser des substitutions ou additions nucléophiles qui aboutissent à son oxydation ou à son alkylation. Si des agents électrophiles très réactifs, comme des radicaux peroxyles HO• , peuvent réagir sur toutes les cystéines, d’autres, comme le peroxyde d’hydrogène H2O2, qui présentent une réactivité relativement faible, ne peuvent réagir qu’avec certaines cystéines suffisamment réactives. Outre le problème de l’accessibilité au solvant d’une cystéine située au cœur d’une protéine, différents facteurs déterminent la réactivité d’une cystéine donnée dans une protéine envers l’H2O2. En particulier, un anion thiolate est beaucoup plus réactif, c’est-à-dire nucléophile et oxydant, que le thiol correspondant. En solution aqueuse, le pKa de la cystéine est 8,5, aussi est-elle présente de façon majoritaire sous forme protonée. De même, dans une protéine, les cystéines sont majoritairement protonées et relativement peu sensibles à l’oxydation par l’ H2O2. En revanche, la forme thiolate d’une cystéine peut être stabilisée dans une protéine par la proximité d’une fonction chimique basique, et ainsi la cystéine rendue particulièrement réactive. La réaction d’oxydation des thiols par l’H2O2 permet une certaine spécificité, et rend l’H2O2 particulièrement adapté pour participer en tant que second messager à des processus de signalisation cellulaire (B. D’Autreaux, 2007, C.C. Winterbourn, 2008).
Le pont disulfure représente une forme d’oxydation des cystéines particulièrement stable, et est impliqué dans de nombreux processus biochimiques. Divers chemins réactionnels peuvent aboutir à la formation de ponts disulfure par oxydation de thiols.
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Table des matières
Introduction
I. Modifications chimiques des thiols par les espèces oxydantes
I.A. Réactivité des espèces réactives dérivées de l’oxygène et du monoxyde d’azote
I.B. Oxydation de cystéines en ponts disulfure
I.C. Systèmes cellulaires de réduction des thiols cytoplasmiques
I.C.1. Description des protéines impliquées dans les voies de réduction
I.C.2. Redondance entre les deux voies de réduction des thiols cytoplasmiques
I.D. Rôle de l’H2O2 et formation de ponts disulfure au cours de la signalisation cellulaire
I.D.1. Mise en évidence d’un rôle de l’H2O2 de second messager dans la signalisation
I.D.2. Identification de phosphatases comme cibles de l’oxydation par l’H2O2
I.D.3. Identification de protéines kinases comme cibles de l’oxydation par l’H2O2
II. Le facteur de transcription Nrf2
II.A. Identification de Nrf2
II.B. Regulation de la voie Keap1-Nrf2
II.B.1. Les inducteurs de Nrf2
II.B.2. Keap1, le régulateur de Nrf2
II.B.2.a. Structure de Keap1
II.B.2.b. Keap1 contrôle l’ubiquitylation et la stabilité de Nrf2
II.B.2.c. Keap1 est le détecteur des inducteurs de Nrf2
II.B.2.d. Activation de Keap1-Nrf2 par l’H2O2 et le NO?
II.B.2.e. Keap1 est ubiquitinylé
II.B.3. Activation de Nrf2 par phosphorylation
II.C. Rôle physiologique de Nrf2
II.C.1. Les gènes régulés par Nrf2
II.C.2. Apports du modèle de souris à la compréhension de la fonction de Nrf2
Phénotypes des souris nrf2-/-
Phénotype des souris keap1-/-
Nrf2 et cancers
Nrf2 et inflammation
III. Les facteurs de transcription Bach1 et Bach2
III.A. Fonction de Bach1
III.B. Fonction de Bach2
III.C. Régulation de Bach1 et Bach2 par des agents électrophiles ou oxydants
Résultats et discussion
I. La régulation de Keap1 par oxydation
I.A. Étude de l’état redox de Keap1 in vivo
I.A.1. Keap1 est oxydé dans des cellules exposées à de l’H2O2
I.A.2. Cinétique et dose-dépendence de l’oxydation de Keap1 par l’H2O2
I.A.3. Identification des cystéines engagées dans les ponts disulfure de Keap1
I.A.3.a. Stratégie
I.A.3.b. Keap1 oxydé par l’H2O2 contient deux ponts disulfures
I.A.3.c. Analyse des complexes redox de haut poids moléculaire de Keap1
I.A.3.d. Présence d’un dimère non covalent de Keap1
I.A.4. Oxydation de Keap1 par la spermine NONOate
I.A.5. Oxydation de Keap1 endogène dans des macrophages en culture
I.A.6. Détection indirecte de l’alkylation des cystéines 151, 226, et 613
I.B. L’oxydation de Keap1 inhibe la dégradation de Nrf2
I.B.1. Validation du système expérimental
I.B.2. L’oxydation de Cys151 de Keap1 par le NO induit la stabilisation de Nrf2
I.B.3. Oxydation de Keap1 et stabilisation de Nrf2 par la S-nitrosocystéine
I.B.4. L’H2O2 active-t-il Nrf2 ?
I.C. Effet de l’inactivation du contrôle thiol redox sur l’axe Keap1-Nrf2
I.C.1. Effets de l’inactivation de la voie de la thioredoxine
I.C.2. Effet de l’inactivation conjointe des voies du GSH et de la thioredoxine
I.D. Conclusion
II. La régulation de Bach2 par oxydation
II.A. Mise en évidence et caractérisation de la formation de ponts disulfure dans la protéine Bach2 induite par l’H2O2
II.A.1. Bach2 est oxydé dans des cellules exposées à de l’H2O2
II.A.2. Mutagenèse des cystéines de Bach2
II.A.3. Recherche d’autres protéines engagées par des ponts disulfure dans les formes d’oxydation de Bach2
II.A.3.a. Les complexes d’oxydation de Bach2 ne contiennent pas d’autre protéine en quantité équivalente à celle de Bach2
II.A.3.b. purification de la forme oxydée de Bach2
II.A.3.c. Formation d’un pont disulfure intermoléculaire entre Bach2 et MafK
II.B. Modulation de l’oxydation de Bach2 par le glucose
II.C. L’H2O2 provoque l’accumulation nucléaire de Bach2
II.D. Discussion
III. Effet de Prx1 sur l’oxydation de protéines par l’H2O2
III.A. L’H2O2 induit la formation de ponts disulfure entre la peroxyredoxine Prx1 et d’autres protéines
III.A.1. L’H2O2 induit la formation d’un pont disulfure entre Prx1 et Bach2
III.A.2. L’H2O2 induit la formation d’un pont disulfure entre Prx1 et Keap1
III.B. Effet de la surexpression de la Prx1 sur l’oxydation d’autres protéines cibles de l’oxydation par l’H2O2
III.B.1. La sur-expression de Prx1 sensibilise Bach2 à l’oxydation par l’H2O2
III.B.2. La sur-expression de la Prx1 sensibilise Keap1 à l’oxydation par l’H2O2
III.B.3. La sur-expression de la Prx1 sensibilise ASK1 à l’oxydation par l’H2O2
III.B.4. Effet de la sur-expression de Prx2 sur l’oxydation de ASK1 par l’H2O2
III.B.5. Prx1 est-elle nécessaire à l’oxydation de Keap1 par l’H2O2 ?
III.C. Discussion
Matériel et méthodes
1. Produits
2. Plasmides
3. Culture cellulaire
4. Transfection des cellules Hela
5. Etablissement de populations cellulaires exprimant de façon stable un ARN interférant
6. Analyse de l’état redox des protéines contenues dans des lysats cellulaires
7.Précipitation des protéines fusionnées à une étiquette HIS par chromatographie d’adsorption sur résine de nickel
8.Purification et analyse par spectroscopie de masse des formes oxydées de Bach2
9. Localisation par immunofluorescence de 9myc-Bach2
Conclusion
Références Bibliographiques
Remerciements
