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Organisation génomique du virus :
Elle fait apparaitre trois gènes : Pol, Gag et Env qui codent respectivement les protéines internes du virion, les enzymes nécessaires à la réplication et les protéines de surface. Ils sont associés à des gènes de régulation nommés tat, rev, nef, vif, vpu, vpr dont les protéines correspondantes sont impliquées dans des phénomènes de régulation de l’expression des protéines virales (cf. figure 2)
Cycle de réplication du VIH :
Les cellules cibles du VIH sont les lymphocytes T-CD4, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules de Langherans et les cellules de la microglie (Girard PM et al,. 2011).
Par sa gp120, le VIH s’adsorbe à la surface des cellules cibles, précisément sur le Cluster différenciation 4 (CD4) ; d’autres corécepteurs (CCR5, CXCR4) interviennent dans cette fixation. Lors de la pénétration par fusion-lyse, la gp41 intervient.
Une fois dans la cellule, la décapsidation se fait et l’ARN monocaténaire viral libéré dans le cytoplasme cellulaire est rétrotranscrit en ADN bicaténaire viral (ADNv) par la RT. Par la suite, cet ADN est importé dans le noyau cellulaire où il est intégré grâce à l’Intégrase virale : il est alors appelé ADN proviral. Le VIH peut rester à vie sous cette forme dans le noyau des cellules infectées ou répliquer.
Lors de l’étape de la réplication, le provirus est transcrit en ARN messagers viraux (ARNmv) et ARN génomiques par l’ARN polymérase II de la cellule hôte. Les ARNmv sont alors traduits en protéines virales structurales et non structurales. La dernière étape du cycle conduit à la formation de nouveaux virions. Les polyprotéines sont maturées en protéines virales suite à leur clivage par la protéase virale. Les protéines régulatrices, l’ARN génomique, la RT et l’Intégrase sont encapsidés et donnent les virions fils qui vont bourgeonner à la surface de la cellule infectée. Ainsi libérés dans le milieu extracellulaire, ces virus fils vont infecter de nouvelles cellules cibles. (cf. figure 3)
Epidémiologie de l’infection à VIH
Le VIH se propage sous forme d’épidémie à travers le monde. La contamination survient par des voies d’entrées qui déterminent les modes de transmission.
Histoire naturelle de l’infection à VIH chez l’enfant
Elle se rapporte à l’évolution de l’infection à VIH en l’absence de toute intervention pouvant retarder la progression vers la maladie. Dans son ensemble, l’infection à VIH de l’enfant n’est guère différente de celle de l’adulte. Le déficit immunitaire sévère aboutit aux mêmes complications infectieuses.(Chakraborty, R., 2005).
Forme rapidement évolutive
Elle concerne environ 15 % (Mayaux M.J. et al., 1996) des enfants infectés et se caractérise par la constitution, en quelques mois, d’un déficit immunitaire sévère qui touche, en général, aussi bien l’immunité cellulaire que l’immunité humorale. Les premiers symptômes notés entre 1 et 3 mois sont une hépatosplénomégalie ou des adénopathies notamment axillaires. Le délai d’apparition du SIDA est estimé entre 3 et 5 mois. Les complications infectieuses sévères de type opportuniste sont précoces, voire inaugurales (mycose œsophagienne ou pneumocystose pulmonaire le plus souvent). La complication spécifique de cette situation est l’encéphalopathie (Chakraborty R., 2005). En l’absence de traitement antirétroviral, les signes neurologiques s’aggravent progressivement et le décès survient en général avant l’âge de 4 ou 5 ans.
Forme lentement évolutive
Chez 80% des enfants infectés, les perturbations immunitaires significatives n’apparaissent qu’après plusieurs années d’évolution (Blanche S. et al., 1997), parfois même après l’âge de 10 ou 15 ans. La symptomatologie clinique peut débuter assez précocement, avant l’âge de 6 mois, sous forme d’une polyadénopathie, avec ou sans hépato splénomégalie, mais ces symptômes restent stables ou même disparaissent pour faire place à une longue période asymptomatique. Les complications infectieuses entrainent la lente dégradation du statut immunitaire. Des infections bactériennes, ORL ou bronchiques, sont observées dans un premier temps puis, lorsque le taux de lymphocytes TCD4+ est effondré, surviennent des infections opportunistes identiques à celles de l’adulte. L’atteinte neurologique ne prend pas la forme de l’encéphalopathie du nourrisson mais correspond plutôt à ce qu’est observé chez l’adulte en situation de déficit immunitaire sévère. La progression en termes de mortalité et de morbidité est similaire à long terme à celle des adultes infectés par le VIH et la survie moyenne est de 95 % à 5ans en l’absence de TARV mais imprécise à plus long terme.
Quelle que soit la forme clinique, le diagnostic de l’infection à VIH ne peut être posé que par la biologie.
Modes de transmissions du VIH :
Il existe plusieurs modes de transmission du VIH. Les plus connus sont :
La transmission sexuelle, par contact entre les muqueuses vaginales, rectale et les sécrétions sexuelles ou du sang contaminé (Belec L., 2007)
La transmission par voie sanguine, par partage de matériel d’injection de drogues contaminé, d’accidents par exposition au sang ou par transfusion de sang contaminé.
Transmission mère-enfant :
La transmission mère-enfant du VIH ou transmission verticale représente la principale cause de l’infection pédiatrique. En effet, plus de 25% des enfants nés de mères séropositives deviennent infectés par le VIH en l’absence de prophylaxie ARV dans les pays en voie de développement (Mofenson L.M., 2010) La transmission du virus à l’enfant a lieu principalement en fin de grossesse (un tiers des cas) et autour de l’accouchement (2 tiers des cas) (Rouzioux, C. et al., 1995). La transmission peut survenir in utero dans les semaines précédant l’accouchement ou ante partum, intra partum pendant l’accouchement, et en post partum pendant l’allaitement ( Neubert J. et al., 2013).
• Transmission in utero :
Le placenta constitue en soi une barrière active contre le passage du virus. Cependant elle peut être prise en défaut lors d’une infection d’origine virale bactérienne ou parasitaire. Ces infections diminuent la fonction protectrice du placenta et augmentent le risque de transmission du VIH pendant la grossesse. Une affection de la cavité amniotique peut favoriser la transmission in utero ainsi qu’une réplication virale maternelle très élevée liée à une situation de primo-infection où à un stade avancé de la maladie. Les cellules maternelles infectées telles que les macrophages placentaires peuvent être diffusées au travers de brèches de la barrière trophoblastique au cours des échanges sanguins fœto-maternels (Girard P.M., et al., 2011).
• Transmission au cours de l’accouchement :
La contamination par le VIH intervient en majorité en per-partum, lors du passage de l’enfant dans la filière génitale probablement liée aux micro-transfusions materno-foetales fréquentes durant le travail. Par ailleurs, les sécrétions vaginales contiennent du VIH sous forme de cellules infectées et de particules virales libres au contact desquelles l’enfant peut être infecté lors de l’accouchement par voie basse. Les échanges sanguins fœto-maternels se poursuivent jusqu’à ce que le cordon ombilical soit coupé. Là encore, le niveau de réplication virale chez la mère est le facteur de risque essentiel de contamination de l’enfant bien qu’il n’y ait pas de valeur seuil en-dessous de laquelle la transmission serait nulle (Jourdain G. et al., 2007).
• Transmission par le lait maternel :
La transmission post-natale du VIH peut survenir au cours de l’allaitement de l’enfant. Le lait maternel contient des virus libres et des cellules infectées. Le risque de transmission est important dans les premières semaines et persiste pendant toute la durée de l’allaitement. L’allaitement occasionne quelque fois des crevasses au niveau du sein. Les ulcérations buccales possibles chez l’enfant peuvent favoriser la transmission de ce dernier exposé par le sang de la mère. Plusieurs travaux menés en Afrique ont montré que le taux de transmission était deux fois plus élevé chez les enfants allaités au sein, l’allaitement artificiel étant le seul moyen d’éviter tout risque de transmission postnatale (Chasela C.S. et al., 2010). La transmission post partum demeure problématique dans les pays en voie de développement, où il n’est pas toujours possible de recourir à l’allaitement artificiel en raison de son coût élevé, du manque d’eau potable et des normes sociétales.
Ces différentes voies de transmission ont déterminé la diffusion du VIH et sa rapidité d’expansion sur tous les continents.
Diagnostic de l’infection à VIH :
Diagnostic clinique
La réplication virale chez les enfants est plus élevée que chez l’adulte. Il en résulte une grande destruction des lymphocytes TCD4+ chez les enfants et une progression plus rapide vers la maladie. La plupart des enfants sont asymptomatiques à la naissance et n’ont pas d’anomalies visibles (Sagar A. and Vasudevan B., 2012). Un diagnostic présomptif doit donc être effectué. L’OMS a décrit quelques critères cliniques pour un diagnostic de présomption d’une infection par le VIH chez les enfants de moins de 18 mois donnés dans le tableau I.
Tableau I: Critères de réalisation d’un diagnostic présomptif d’une infection à VIH chez les enfants de moins de 18 mois lorsque les tests virologiques ne sont pas disponibles (OMS, 2010)
Un diagnostic présomptif d’une infection à VIH doit être effectué si :
• L’enfant a des anticorps anti-VIH et
• Le diagnostic de tout autre indicateur de l’infection effectué Ou
• L’enfant est symptomatique avec deux ou plusieurs des indicateurs suivants – Muguet
– Pneumonie sévère – Infection sévère
Autres facteurs indicateurs d’une infection à VIH chez un enfant séropositif :
• Décès récent de la mère lié au VIH ; ou stade avancé de l’infection à VIH maternelle
• Taux de lymphocytes T CD4+ < 20%
Une confirmation de l’infection doit être envisagée aussi tôt que possible
Diagnostic direct ou biologique
Les tests directs font appel à des techniques de détection directe du virus, des protéines ou du génome viral soit par culture cellulaire, ou par diverses techniques de biologie moléculaire dont la PCR.
Antigène p24 :
L’antigène p24 est un marqueur direct de l’infection à VIH. L’intérêt de sa recherche porte sur le diagnostic de l’infection avant la séroconversion des anticorps qui survient vers la sixième semaine. En effet, les anticorps sont indétectables au cours de la primo-infection.
Recherche du virus par culture cellulaire :
La culture cellulaire consiste à isoler le virus à partir de lignées de cellules mononuclées dont le génome renferme l’ADN proviral du VIH. Les cellules TCD4, étant la cible des VIH, peuvent être prises à visée de culture. En effet une variante de la culture virale est fondée sur la purification des cellules TCD4 et leur activation. La présence du virus dans les lymphocytes est décelée par détection de la réplication virale en mesurant l’AgP24 ou une activité transcriptase reverse. Cette culture est fastidieuse et nécessite des laboratoires spécialisés.
Diagnostic moléculaire par amplification génique :
Il est effectué grâce à des techniques permettant de détecter le matériel génétique viral. La recherche de l’ADN dans les cellules blanches et de l’ARN (Cunningham C.K. et al., 1999) dans le plasma sont les méthodes moléculaires utilisées pour réaliser le diagnostic de l’infection à VIH chez l’enfant de moins de 18 mois (Young N.L. et al., 2000). Cela permet aussi de clarifier une sérologie douteuse. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour amplifier soit une séquence d’ADN, soit une séquence d’ARN. La plus utilisée des méthodes d’amplification sélective est la polymérisation en chaine (PCR).
Amplification génique par PCR :
La PCR pour réaction de polymérisation en chaine est une technique d’amplification génique in vitro de biologie moléculaire. Elle est utilisée pour amplifier de l’ADN en milliers de copies identiques par une succession de réactions de réplication de la matrice d’ADN (Saiki R.K. et al., 1985).La PCR est basée sur le mécanisme de réplication de l’ADN. Elle comprend 3 étapes dont une dénaturation thermique de l’ADN, une hybridation par des amorces oligonuléotides, et une élongation par une enzyme de polymérisation. Chaque réaction emploie deux amorces spécifiques qui bornent la séquence d’intérêt à amplifier.
Les méthodes d’amplification sont nombreuses et nous pouvons citer deux méthodes principales :
• Amplification d’une cible par PCR qualitative : la PCR qualitative est une technique très sensible de détection du virus même en très petite quantité dans le sang.
• Amplification par RT-PCR quantitative : le principe est une réaction de reverse transcription suivie d’une amplification de l’ADNc. Elle ne détecte pas des quantités de virus aussi faibles que la PCR qualitative. Elle permet de mesurer la quantité de virus dans l’organisme.
• Amplification d’une cible par NASBA (Nucleic Acid Sequence Basic Amplification) : c’est une technique d’amplification isothermique dont le produit final est de l’ARN antisens.
Exemple de quelques trousses de détection moléculaire du VIH :
Amplification détection par Amplicor ADN VIH-1 (roche) :
Le test Amplicor HIV-1 ADN test®, version1.5 est basé sur l’amplification par PCR d’une séquence de 155 pb du gène gag suivie d’une détection par hybridation de sondes spécifiques en présence d’un contrôle interne. Tout d’abord, une étape de préparation des échantillons est réalisée en présence de détergent suivie de l’extraction de l’ADN viral à chaud. Après l’amplification par PCR, une détection de l’ADN viral et du contrôle interne est réalisée séparément après une dénaturation chimique. La fixation d’un conjugué marqué à l’Avidine peroxydase permet la lecture de l’absorbance à une longueur d’onde de 450nm.
La technologie Abbott Real time HIV-1 des laboratoires Abbott :
C’est une technique qui est entièrement automatisée grâce à deux appareils : Abbott m2000sp® qui assure la préparation des échantillons avec pour objectif d’extraire et d’isoler les acides nucléiques et l’appareil Abbott m2000rt ®qui réalise l’Amplification et la détection qualitative du virus. . L’amplification se fait sur une séquence cible du gène pol. La quantité de séquence cible du VIH-1 présente à chaque cycle d’amplification est mesurée à l’aide de sondes oligonucleotidiques marquées par fluorescence. Les sondes ne génèrent aucun signal à moins d’être spécifiquement liées au produit amplifié. Le cycle d’amplification, au cours duquel le signal fluorescent est détecté par m2000rt®, est proportionnel au log de la concentration d’ARN du VIH-1 présente dans l’échantillon d’origine. (Voir Figure annexe)
NuliSENS EasyQ HIV V1.1® de Biomerieux :
Le test NucliSENS EasyQ HIV-1 v1.1 combine une extraction magnétique de l’ARN par la chimie de Boom suivie d’une amplification isothermique (par la technique NASBA) et utilise des balises moléculaires pour la détection. Elle cible la séquence gag et permet la quantification aussi bien du VIH-1 que du VIH-2 dans une marge de 25 à 1000000.
Le diagnostic de l’infection à VIH est basé sur la recherche des acides nucléiques du VIH par la technique de PCR chez nouveau né et enfant, ou par la recherche des anticorps maternels. Le diagnostic est sans nul doute une étape importante dans le suivi du patient pour assurer une bonne prise en charge de la maladie et mieux évaluer l’état du malade.
Place du DBS dans le diagnostic précoce de l’infection à VIH/SIDA.
Le prélèvement de sang sur papier buvard ou papier filtre DBS (Dried Blood Spot) a permis une approche simple et efficace dans le diagnostic de nombreuses maladies néonatales.
Les nombreuses difficultés rencontrées au cours des prélèvements et traitements des échantillons veineux sur tube (réalisation du prélèvement chez l’enfant, volume de sang insuffisant, non disponibilité d’un laboratoire de biologie moléculaire, délai de traitement des échantillons de sang veineux, rupture de la chaîne de froid) ont rendu souvent inaccessible le dépistage précoce des enfants avant l’âge de 18 mois. L’utilisation des DBS dans la détection moléculaire de l’ADN et l’ARN du VIH-1, décrite en 1991, constitue une aide précieuse au diagnostic biologique décentralisé. Ainsi, les difficultés liées au transport et à la conservation des prélèvements veineux sur tube ont diminuée (Diouara A.A. et al., 2014, Kebe K. et al., 2011)
Traitement par les antirétroviraux
Le traitement ARV est indispensable à la prise en charge de l’infection à VIH/SIDA. L’objectif principal du TARV est d’empêcher la progression vers le SIDA et le décès en maintenant ou restaurant les CD4 à un nombre de CD4 > 500/mm3. Selon les recommandations de l’OMS, l’initiation du traitement ARV est indiquée chez toute personne dont le nombre de CD4 est inférieur ou égal à 500/mm3. Ce traitement est recommandé quelle que soit la numération des CD4 et un traitement à vie pour les femmes enceintes séropositives ou qui allaitent leur enfant (OMS, 2014). Le TARV doit rendre la charge virale plasmatique (CV) indétectable (<50 copies/mL), ce qui favorise la restauration immunitaire, diminue le risque de sélection de virus résistants et réduit la morbidité associée au VIH (Peeters M., et al., 2013). Le TARV est regroupé sous trois schémas thérapeutiques codifiés par l’OMS selon les niveaux de résistance.
Ce traitement consiste en l’association de plusieurs molécules ayant une action sur le cycle de réplication du virus. Les molécules antirétrovirales agissent en interférant avec le cycle de réplication de ce dernier. Il est utilisé comme moyen de prévention depuis 1994 dans la PTME.
Approche méthodologique:
Cadre de l’étude
Nos travaux se sont déroulés au niveau de l’unité de biologie moléculaire du laboratoire de Bactériologie Virologie (LBV) du CHU Aristide Le Dantec au Sénégal à partir des résultats réalisés dans les sites PTME au Mali à l’institut national de recherche en sante public (INRSP) de Bamako. Il s’agit d’une étude rétrospective, sur les données de 2009 à 2013.
Population d’étude
Notre étude a concerné au total 4960 enfants âgés de 0 à 104 semaines nés de mères séropositives ayant ou non bénéficié des protocoles de PTME en vigueur durant la période d’étude.
Échantillonnage
L’échantillonnage a été fait sur 4960 enfants nés de mères séropositives aux centres de santé de références des régions: de Kayes ; de Koulikoro ; de Sikasso, de Ségou et les six communes du district de Bamako selon un modèle simple de recrutement systématique des enfants nés de mères séropositives au VIH dans le cadre du programme PTME. Des spots ont été réalisés sur des papiers buvards (DBS)
Variables étudiées
Caractéristiques sociodémographiques et thérapeutiques :
– Age ;
– Sexe des nouveaux nés ;
– Traitement-prophylaxie reçus après découverte de leur statut ;
– Mode d’alimentation ;
– Type prophylaxie ;
– Le résultat des PCR et le profil sérologique des enfants infectés.
Matériel et techniques de collecte :
Liste du matériel nécessaire pour le prélèvement (cf. ANNEXE)
• Identification de l’échantillon:
Dans les centres de santés un certain nombre de fiches et registres étaient rempli par l’équipe qui recevait les enfants et/ou celles qui effectuaient le prélèvement:
Le registre de la clinique ou du centre de santé
La fiche de prélèvement
• La fiche d’identification
Chaque échantillon a été identifié avec son numéro d’identification et la date de prélèvement. Le numéro d’identification du patient (NIP) indispensable pour l’identification des fiches et du papier filtre se trouvait normalement dans le carnet de santé de la mère et de l’enfant. Il a été demandé aux techniciens des centres de s’assurer avant tout prélèvement que la mère dispose du carnet de l’enfant et d’un numéro PTME, au cas contraire, d’attribuer un nouveau NIP à l’enfant.
Il s’agit d’un prélèvement du sang sur papier buvard ou DBS réalisés à partir de gouttes de sang prélevées du talon pour les enfants de moins de 10 kg ou du bout du doigt pour les enfants de plus de 10 kg et recueillies sur papier buvard (cf. Figures 4,5).
Taux de transmission mères-enfants du VIH selon les caractéristiques sociodémographiques et prophylactiques des enfants infectés
• Répartition des enfants infectés par sexe
Parmi ces 448 enfants infectés, 240 étaient de sexe masculin et 208 de sexe féminin. Le taux de transmission mère-enfants est similaire chez les garçons avec 9,7 % (n=240/2478) et les filles avec 8,4 % ((n= 208/2482). Aucune différence significative n’a été notée entre les deux sexes concernant le taux de transmission.
• Détermination de la période d’infection
Le diagnostic de l’infection au VIH a été porté positif pour 445 enfants dès leur premier diagnostic et 3 enfants au deuxième diagnostic. Aucun n’enfant ne fut détecté positif au VIH sur une 3ième PCR. Ainsi, 13,7% (n=445/3237) des enfants ont été détectés positifs au VIH dès la 1èrePCR, pour 0,18% (n=3/1663) des enfants infectés à la 2ième PCR.
Concernant la prise en charge l’évolution des schémas utilisés et le mode d’alimentation des enfants infectés sont consignés dans le tableau VIII.
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Table des matières
PREMIERE PARTIE :
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I: Généralités sur le VIH
1- Définition et Classification
2- Structure et Cycle de réplication viral
2-1-Morphologie du virus
2-2- Organisation génomique du virus
2-3-Cycle de réplication du VIH
3- Epidémiologie de l’infection à VIH
3-1-Histoire naturelle de l’infection à VIH chez l’enfant
3-2- Modes de transmissions du VIH
4-Diagnostic de l’infection à VIH
4-1- Diagnostic clinique
4-2-Diagnostic direct ou biologique
4-3-Place du DBS dans le diagnostic précoce de l’infection à VIH/SIDA
5-Traitement par les antirétroviraux
CHAPITRE II: prévention de la TME
1-Définition
2- Objectif
3- Stratégies d’intervention par le programme de la prévention de la TME au Mali
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
CHAPITRE I:
1-Contexte et justification
2-Objectifs de l’étude
CHAPITRE II: Approche méthodologique
1-Cadre de l’étude
2-Population d’étude
3-Échantillonnage
4-Variables étudiées
5- Matériel et techniques de collecte :
6-Analyse statistique des données générées
CHAPITRE III: Résultats
1-Provenance des enfants et répartition des prélèvements sur le territoire:
2-Répartition des enfants selon les caractères sociodémographiques et prophylactiques
3-Résultats biologiques
3-1-Taux global de transmission mère-enfant (TME) du VIH
3-2-Taux de transmission mères-enfants du VIH selon les caractéristiques sociodémographiques et prophylactiques des enfants infectés
CHAPITRE IV : Discussion
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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