Soutenance mémoire
Métabolisme des HAP
Les HAP sont formés au cours de la combustion incornplète des matériaux organiques du carbone et de l’hydrogène. Ils proviennent de sources naturelles mais également anthropiques. Généralement, les voies d’exposition aux HAP sont digestives et pulmonaires (tabagisme et la pollution atmosphérique), notamment en zone urbaine et péri-industrielle. L’absorption peut être également cutanée après contact direct avec des produits ou indirect avec des éléments souillés et aussi par retombées atmosphériques de poussières en suspension. L’absorption respiratoire est fonction de la granulométrie et de la composition des particules. L’absorption digestive est rapide et facilitée par les aliments riches en graisse, quant à l’absorption cutanée, constitue une voie d’entrée importante pour les HAP dans le cas d’expositions professionnelles. (Moody 1995). Les études chez l’animal montrent que les HAP sont rapidement transportés vers d’autres organes via le sang et les vaisseaux lymphatiques. La distribution est rapide, quelle que soit la voie d’entrée et les HAP sont détectés dans pratiquement tous les organes. Ils peuvent être stockés dans le foie, les reins et le tissu adipeux, (Tarantini, 2009). Les HAP, peuvent entrer dans les cellules en franchissant la membrane plasmique, une fois dans la cellule, ils s’associent généralement avec des molécules hydrophobes qui participent à leur distribution à travers les compartiments intracellulaires. L’élimination des métabolites des HAP se fait majoritairement par les fèces et les urines, (Tarantini, 2009).
Bio surveillance – Evaluation de la qualité de l’environnement
L’évaluation de la qualité d’un écosystème par la simple recherche des contaminants dans le milieu est insuffisante pour caractériser son « état de santé » dans sa globalité. L’étude in situ des interactions entre contaminants et organismes apporte des informations complémentaires notamment sur la nature et l’intensité de la contamination et sur l’exposition (distribution des polluants dans le milieu et biodisponibilité) et sur les effets toxiques aux différents niveaux d’organisation. En plus de son caractère intégrateur, la réponse mesurée a alors une signification biologique et/ou écologique, même si tous les facteurs causaux ne sont pas connus ou identifiés avec précision, (Wittig, 1993). La biosurveillance correspond à l’utilisation d’un système biologique indicateur pour obtenir des informations sur la qualité de l’environnement et sur les effets des polluants sur les organismes exposés (Kettrup et Marth, 1998). Parmi les réponses observées, les programmes de surveillance biologique sont basés sur la mesure des concentrations des contaminants dans les organismes et sur l’évaluation des réponses, individuelles, populationnelles, communautaires, (Baturo, 1995). Les espèces accumulatrices correspondent à celles qui accumulent d’importantes quantités de polluants dans leurs tissus. Les espèces sentinelles représentent toute espèce susceptible d’être utilisée comme indicateur de la présence et de la toxicité d’au moins un contaminant. Les espèces doivent être choisies en fonction de leur signification écologique pour permettre d’évaluer les effets potentiels des contaminants sur l’écosystème. Enfin, les espèces qui marquent la contamination du milieu par leur abondance ou leur absence sont des bioindicateurs (Amiard et al., 1998). Les deux types d’approche généralement proposées in situ sont la bioindication passive (utilisation d’individus ou de communautés naturellement présents dans la zone d’étude) ou active (introduction d’espèces accumulatrices et/ou sentinelles dans le milieu étudié). Les expérimentations en laboratoire ou sur terrain sont complémentaires et doivent aider à mettre au point les outils biologiques indicateurs utilisés sur le terrain (Coeurdassier, 2001). Le choix d’un organisme accumulateur « idéal » repose sur des critères bien définis et sur la connaissance des facteurs individuels qui peuvent influencer l’accumulation (Phillips et Segar, 1986). La connaissance des voies de transfert et d’accumulation des polluants dans les organismes contribuera à choisir les espèces accumulatrices (Martin et Coughtrey, 1982; Phillips et Rainbow, 1989), le choix se portant en général sur celles qui ont développées une stratégie de non-régulation conduisant au stockage des composés dans leurs tissus (Phillips, 1998). Parmi les Invertébrés utilisés comme accumulateurs, on peut citer les Annélides (polychètes, achètes et surtout oligochètes), les Mollusques bivalves (milieu aquatique uniquement) et Gastéropodes (milieux aquatique et terrestre) ou encore certains arthropodes et particulièrement les Crustacés, (Beeby, 2001).
Activité GST (glutathion S-transférase)
La mesure de l’activité glutathion S-transférase (GST) est déterminée selon la méthode de Habig et al., (1974). Elle est basée sur la réaction de conjugaison entre la GST et un substrat, le CDNB (1-chloro 2, 4 dinitrobenzène) en présence d’un cofacteur le glutathion (GSH). Les échantillons sont homogénéisés dans 1 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 6). L’homogénat est centrifugé à 14000 tours/mn pendant 30 mn et le surnageant récupéré servira comme source d’enzyme. Le dosage consiste à faire réagir 200 µl du surnageant avec 1,2 ml du mélange CDNB. La lecture des absorbances est effectuée toutes les minutes pendant 5 minutes à une longueur d’onde de 340 nm dans un spectrophotomètre Uv contre un blanc contenant 200 µl d’eau distillée remplaçant la quantité du surnageant.
Exposition contrôlée pendant 3 semaines au Naphtalène
Dans ce dernier chapitre, nous nous proposons d’évaluer les atteintes histopathologiques au niveau de l’hépatopancréas et du rein d’Helix aspersa exposé à des concentrations croissantes du naphtalène. Après chaque période de traitement, Trois escargots par traitement sont retenus pour l’étude histologique. Les escargots sont directement disséqués, les coquilles sont enlevées délicatement. La glande digestive et le rein sont excisés. Après dissection, les fragments de la glande digestive et du rein sont fixés dans le liquide de Bouin alcoolique pendant 48h. Puis déshydratés dans l’éthanol 95°au moins deux fois pour éliminer l’excès d’acide picrique. Après déshydratation, les pièces sont conservées dans du butanol. Après imprégnation dans la paraffine (3 bains de 24 h.) les pièces sont coupées (2µm) à l’aide d’un microtome Anglia scientific 0325, étalées avec l’eau gélatinée et séchées à l’étuve (37 °C) pendant au moins 48 h. Les coupes sont par la suite déparaffinées avant d’être colorées à l’hemalun éosine qui permet une coloration différentielle. Après déshydratation dans les bains suivants : éthanol 95°, éthanol à 95° et du xylène pur et enfin du xylène pur. Les pièces sont montées à l’aide du baume de Canada, Les observations des coupes sont effectuées avec une photo microscope LEICA DM 1000 (Gx40) (Martoja et Martoja, 1967). On a retenu une période de traitement de 3 semaines, la nourriture apportée est renouvelée, qu’elle soit contaminée ou non, tous les (03) jours au moment du nettoyage des boites d’élevage. Ce nettoyage est fait, autant que possible, à heure fixe. Il comprend un lavage des couvercles et des parois des boites à l’eau distillée, un changement de l’éponge absorbante au fond de la boîte ou un ramassage des fèces des escargots déposés sur le substrat. Ensuite, l’ensemble des récipients d’essai est humidifié à l’eau distillée.
Conclusion générale
Dans les écosystèmes terrestres, les Gastéropodes sont exposés à différents types de contaminants à travers plusieurs voies d’exposition, par l’ingestion d’aliments, par le contact et l’absorption via l’épithélium du pied depuis des surfaces contaminées et l’inhalation de substances toxiques. Dans notre recherche, concernant la pollution aux HAP, nous avons opté pour l’exposition par voie cutanée. Des stratégies individuelles de résistance aux polluants sont utilisées par les Invertébrés: l’augmentation des capacités d’excrétion et la synthèse accrue de structures intracellulaires de stockage. Ces mécanismes de détoxication ont un coût énergétique pour l’organisme. Ils constituent un « détournement » d’une partie de l’énergie disponible pour des fonctions vitales et pourraient de cette façon être responsables d’une partie des effets constatés. Cette étude montre l’intérêt de Helix aspersa comme espèce modèle de gastéropode pulmoné terrestre pour l’évaluation de la toxicité des HAP dans des tests de laboratoire et pour la surveillance des milieux terrestres récepteurs en utilisant ces organismes dans une démarche de biosurvaillance. Il apparaît clairement que l’espèce Helix aspersa est un excellent bioindicateur de la dégradation du milieu, elle est particulièrement sensible à une pollution par des polluants inorganiques ou organiques (HAP). Cette sensibilité se manifeste par une perturbation dans le développement des paramètres physiologiques (inhibition de la croissance). D’un autre coté, nous avons mis en évidence la perturbation du métabolisme globale à travers l’augmentation significative du taux de protéines totales et la diminution significative du taux de lipides et de glucides. En ce qui concerne l’étude des biomarqueurs d’exposition nous avons mis en évidence une diminution significative du taux du glutathion, parallèlement à l’augmentation de l’activité GST et catalase connus pour leur rôle dans la détoxication et ce au niveau des deux organes. De plus, nous avons mis en évidence une augmentation significative du taux de MDA confirmant ainsi l’atteinte des lipides membranaires. L’étude histopathologique a confirmé cette sensibilité de l’espèce vis-à-vis du naphtalène à travers des atteintes tissulaires bien visibles, au niveau de l’hépatopancréas et du rein.
Les plantes utilisées ont des capacités de phytoaccumulation des HAP vu les effets de leurs lessivats sur Helix aspersa. Chaque espèce de plantes utilisée à des degrés d’accumulations différents. Le Salix babylonica a les capacités de phytoaccumulation les plus importantes suivi de Populus nigra et pour finir Acer monspessulanum, dont les capacités d’accumulation sont les plus faibles.
Les lessivats de feuilles fraiches sont plus toxiques que ceux des feuilles séchées, cela serait probablement dû au fait que les HAP sont plus facilement lessivés quand ils sont en solution dans les fractions liquides des feuilles (Peterson & Cummins, 1974).
Les Gastéropodes traités par l’eau prélevée sur le site d’études sont les plus touchés par la toxicité. Cette toxicité serait due au fait que l’eau prélevé du sol serait saturer en HAP, cela peut avoir comme explication que le sol est recouvert par la litière des feuilles qui tombe d’année en année donc la concentration dans la couche supérieure du sol est très élevée en HAP.
Les radicaux libres produits sont responsables des lésions tissulaires et peuvent aboutir à la mort cellulaire (Grara, 2011) comme dans notre cas pour les gastéropodes traités avec le lessivat de Salix babylonica après 48h de lessivage.
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Table des matières
Chapitre I: Introduction Générale
1. Introduction
2. Devenir des hydrocarbures aromatiques polycycliques dans l’environnement
3. Propriétés physico-chimiques
4. Métabolisme des HAP
5. Bio surveillance – Evaluation de la qualité de l’environnement
6. les biomarqueurs
7. Végétaux et phytoaccumulation
8. Objectif de travail
Chapitre II: Matériels et méthodes
1. Matériel biologique
2. Matériel chimique
3. Méthodes
3.1. Mode de traitement des escargots
3.2. Paramètres étudiés
Chapitre III: Résultats
1. Exposition non-contrôlée pendant plusieurs semaines à une pollution atmosphériques
1.1. Effets des rejets atmosphériques chargés des HAP sur le taux de protéines totales
1.2. Effets des rejets atmosphériques chargés des HAP sur le taux de glucides totaux
1.3. Effets des rejets atmosphériques chargés des HAP sur l’activité Catalase
1.4. Effets des rejets atmosphériques chargés des HAP sur l’activité GST
1.5. Effets des rejets atmosphériques chargés des HAP sur le taux de glutathion (GSH)
1.6. Effets des rejets atmosphériques chargés des HAP sur le taux du malondialdehyde (MDA)
2. Exposition semi-contrôlée par les lessivats de feuilles
2.1. Évolution du poids moyen des escargots
2.2. Évolution du diamètre de la coquille des escargots
2.3. Evolution du taux de protéines totales
2.4. Evolution du taux de glucides
2.5. Mesure de l’activité catalase
2.6. Mesure de l’activité GST
2.7. Mesure du taux de GSH
2.8. Mesure du taux de MDA
3. Exposition contrôlée au Naphtalène
Chapitre VI. Discussion et Conclusion Générale
Discussion
Conclusion générale
Perspectives
Références Bibliographiques
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